Bước Đầu Khảo Sát Một Số Thành Phần Hóa Học Và Đánh Giá Hoạt Tính Kháng Khuẩn Của Dịch Chiết Nước

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA DỊCH CHIẾT NƢỚC TỪ BỒ CÔNG ANH (LACTUCA INDICA L) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hƣớng dẫn : Th.S Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực MSSV: 1311100687 : Trịnh Thị Phƣơng Thảo Lớp: 13DSH03 TP Hồ Chí Minh, 2017 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đồ án nghiên cứu riêng đƣợc thực sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dƣới hƣớng dẫn ThS Phạm Minh Nhựt Các số liệu, kết nêu đồ án trung thực chƣa đƣợc công bố công trình nghiên cứu khác Tơi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan Tp.Hồ Chí Minh, ngày 27 tháng năm 2017 Sinh viên Trịnh Thị Phƣơng Thảo Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại học Cơng Nghệ Tp Hồ Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy Khoa Công nghệ sinh học Thực phẩm - Môi trƣờng tất thầy cô truyền dạy kiến thức quý báu cho em suốt năm học vừa qua Qua em xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Phạm Minh Nhựt, ngƣời định hƣớng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hƣớng dẫn giúp đỡ em suốt thời gian làm khoá luận tốt nghiệp Bên cạnh em xin cảm ơn thầy Phòng Thí nghiệm Khoa Cơng nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trƣờng anh chị, bạn bè nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình ln bên cạnh, động viên lúc khó khăn, nản lòng suốt thời gian học tập, nghiên cứu nhƣ sống Tp Hồ Chí Minh, ngày 27 tháng năm 2017 Sinh viên Trịnh Thị Phƣơng Thảo Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH ẢNH viii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu 3 Nội dung nghiên cứu Phạm vi nghiên cứu CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu bồ công anh tác dụng dƣợc lý 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Nguồn gốc phân bố 1.1.3 Đặc điểm chung Bồ công anh 1.1.4 Tác dụng dƣợc lý 1.1.5 Thành phần hóa học bồ công anh 1.1.5.1 Flavonoid 1.1.5.2 Alkaloid 1.1.5.3 Carbohydrate 10 1.1.5.4 Glycoside 11 1.1.5.5 Saponin 12 1.1.5.6 Tannin 13 1.1.5.7 Amino acid 14 1.1.5.8 Isoprenoid 15 1.2 Cơ chế kháng khuẩn hợp chất có nguồn gốc từ thực vật 16 1.2.1 Khái niệm hoạt tính kháng khuẩn 16 i Đồ án tốt nghiệp 1.2.2 Cơ chế kháng khuẩn 16 1.2.3 Một số hợp chất có khả kháng khuẩn từ thực vật 19 1.2.3.1 Hợp chất phenolic 19 1.2.3.2 Nhóm alkaloid 21 1.3 Tổng quan số nhóm vi khuẩn gây bệnh 23 1.3.1 Nhóm vi khuẩn Escherichia coli 23 1.3.2 Nhóm vi khuẩn Salmonella spp 24 1.3.3 Nhóm vi khuẩn Shigella spp 26 1.3.4 Nhóm vi khuẩn Listeria spp 27 1.3.5 Nhóm vi khuẩn Vibrio spp 28 1.3.6 Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Pseudomonas spp 29 1.3.7 Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Enterococcus spp 30 1.3.8 Nhóm vi khuẩn Staphylococcus aureus 31 CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 Địa điểm thời gian 33 2.1.1 Địa điểm 33 2.1.2 Thời gian 33 2.2 Vật liệu 33 2.2.1 Nguồn mẫu 33 2.2.2 Vi khuẩn thị 33 2.2.3 Mơi trƣờng hóa chất sử dụng 33 2.2.4 Dụng cụ thiết bị 34 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 35 2.3.1 Phƣơng pháp thu xử lý nguồn mẫu 35 2.3.2 Phƣơng pháp tách chiết thu nhận cao thực vật 35 2.3.3 Phƣơng pháp bảo quản giữ giống vi sinh vật 36 2.3.4 Phƣơng pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi sinh vật thị 36 ii Đồ án tốt nghiệp 2.3.5 Phƣơng pháp pha loãng mẫu 37 2.3.6 Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn 38 2.3.7 Phƣơng pháp xác định thành phần hóa học có cao chiết 38 2.3.7.1 Định tính carbohydrate 39 2.3.7.2 Định tính alkaloids 39 2.3.7.3 Định tính saponin 39 2.3.7.4 Định tính cardiac glycoside 39 2.3.7.5 Định tính anthraquinone glycoside 40 2.3.7.6 Định tính flavonoid 40 2.3.7.7 Định tính hợp chất phenol 41 2.3.7.8 Định tính tannin 41 2.3.7.9 Định tính steroid 41 2.3.7.10.Định tính amino acid 41 2.3.8 Phƣơng pháp đánh giá khả kháng oxy hóa DPPH 42 2.3.9 Phƣơng pháp định lƣợng thành phần hóa học 42 2.3.9.1 Định lượng vitamin C 42 2.3.9.2 Định lương Alkaloid 43 2.3.9.3 Định lượng Flavonoid 44 2.3.10 Phƣơng pháp xử lý số liệu 44 2.4 Bố trí thí nghiệm 44 2.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng dung môi tách chiết đến hiệu suất thu hồi cao chiết từ Bồ công anh 46 2.4.1.1 Sơ đồ thí nghiệm 46 2.4.1.2 Thuyết minh quy trình 47 2.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nƣớc từ Bồ công anh chủng vi khuẩn gây bệnh 48 2.4.2.1 Sơ đồ thí nghiệm 48 iii Đồ án tốt nghiệp 2.4.2.2 Thuyết minh quy trình 50 2.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả kháng oxy hóa cao chiết nƣớc từ Bồ công anh 50 2.4.3.1 Sơ đồ thí nghiệm 50 2.4.3.2 Thuyết minh quy trình 51 2.4.4 Thí nghiệm 4: Định tính số thành phần hóa học cao chiết nƣớc từ Bồ công anh 51 2.4.4.1 Sơ đồ thí nghiệm 51 2.4.4.2 Thuyết minh quy trình 53 2.4.5 Thí nghiệm 5: Định lƣợng số thành phần hóa học cao chiết nƣớc từ Bồ công anh 53 2.4.5.1 Sơ đồ thí nghiệm 53 2.4.5.2 Thuyết minh quy trình 55 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 56 3.1 Kết đánh giá hiệu suất thu hồi cao chiết Bồ công anh từ dung môi nƣớc 56 3.2 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nƣớc từ Bồ công anh chủng vi khuẩn gây bệnh 56 3.2.1 Kết hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nƣớc từ Bồ cơng anh nhóm vi khuẩn Escherichia coli 56 3.2.2 Kết hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nƣớc từ Bồ cơng anh nhóm vi khuẩn Listeria Spp 58 3.2.3 Kết hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nƣớc từ Bồ công anh nhóm vi khuẩn Samonella Spp 58 3.2.4 Kết hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nƣớc từ Bồ cơng anh nhóm vi khuẩn Shigella Spp 60 3.2.5 Kết hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nƣớc từ Bồ công anh nhóm vi khuẩn Vibrio spp 61 iv Đồ án tốt nghiệp 3.2.6 Kết hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nƣớc từ Bồ cơng anh nhóm vi khuẩn gây bệnh hội da 62 3.3 Tổng hợp kết hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nƣớc Bồ cơng anh 20 vi khuẩn gây bệnh 63 3.4 Kết định tính số thành phần hóa học cao chiết nƣớc Bồ cơng anh 64 3.5 Kết định lƣợng số thành phần hóa học cao chiết nƣớc Bồ cơng anh 66 3.6 Kết khả kháng oxy hóa cao chiết nƣớc từ Bồ công anh 67 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71 4.1 Kết luận 71 4.2 Đề nghị 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 PHỤ LỤC v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DMSO: Dimethyl sulfoxide RNA: Ribonucleic acid TSA: Trypton Soya Agar TSB: Trypton Soya Broth LiWE: Lactuca indica Water extract NA: Non Activity DPPH: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Những nhóm hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn (theo Cowan, 1999) 18 Bảng 3.1 Kết đƣờng kính vòng ức chế (mm) cao chiết nƣớc Bồ công anh 20 chủng vi khuẩn gây bệnh 63 Bảng 3.2 Kết định tính số thành phần hóa học cao chiết nƣớc từ Bồ cơng anh 65 Bảng 3.3 Kết định lƣợng số thành phần hóa học Bồ công anh 67 Bảng 3.4 Hàm lƣợng chất kháng oxy hóa theo vitamin C 69 vii Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different Tukey Grouping Mean N Cao A 12.3333 ND500 B 9.8333 ND200 C 0.0000 ND100 B.2 Kết xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nƣớc từ Bồ công anh nhóm vi khuẩn Listeria spp B.2.1 L.innocua Bảng The ANOVA Procedure Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 18.66666667 9.33333333 Error 1.33333333 0.22222222 Corrected Total 20.00000000 Bảng The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Means with the same letter are not significantly different Tukey Grouping Mean N Cao A 12.0000 ND500 B 9.3333 ND200 B B 8.6667 ND100 42.00 0.0003 Đồ án tốt nghiệp B.2.2 L.monocytogene Bảng The ANOVA Procedure Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 245.3888889 Error 0.6666667 Corrected Total 246.0555556 122.6944444 1104.25 F Model 2.88888889 1.44444444 Error 2.16666667 0.36111111 Corrected Total 5.05555556 Bảng The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Means with the same letter are not significantly different Tukey Grouping A Mean N Cao 12.5000 ND500 A A 11.5000 ND200 A A 11.1667 ND100 4.00 0.0787 Đồ án tốt nghiệp B.4 Kết xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nƣớc từ Bồ cơng anh nhóm vi khuẩn Shigella spp B.4.1 Shi.flexneri Bảng The ANOVA Procedure Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 288.1666667 Error 0.3333333 Corrected Total 288.5000000 144.0833333 2593.50 F Model 492.7222222 Error 1.1666667 Corrected Total 493.8888889 Bảng The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) 11 246.3611111 1267.00 F Model 4.38888889 2.19444444 Error 2.00000000 0.33333333 Corrected Total 6.38888889 Bảng The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Means with the same letter are not significantly different Tukey Grouping A Mean N Cao 11.3333 ND0.008 10.1667 ND200 9.6667 ND100 A B A B B 12 6.58 0.0307 Đồ án tốt nghiệp B.6 Kết xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nƣớc từ Bồ cơng anh nhóm vi khuẩn gây bệnh hội da B.6.1 E.feacalis Bảng The ANOVA Procedure Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5.72222222 2.86111111 Error 1.16666667 0.19444444 Corrected Total 6.88888889 Bảng The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Means with the same letter are not significantly different Tukey Grouping Mean N Cao A 12.0000 ND500 B 10.5000 ND200 B B 10.1667 ND100 13 14.71 0.0049 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC C CÁCH PHA CÁC LOẠI THUỐC THỬ C.1 Thuốc thử Molisch Hòa tan 5g α- napthol vào ethanol 95% pha loãng thành 100 ml C.2 Thuốc thử Fehling * Thuốc thử Fehling A: 34,6 g CuSO4.5H2O đƣợc hòa tan hồn tồn vào nƣớc cất, sau tiếp tục định mức đến 500ml * Thuốc thử Fehling B: Hòa tan 125g KOH 173g Kali Natri tartrate.7H2O vào nƣớc cất định mức 500ml C.3 Thuốc thử Barfoed Cân 66,5g Copper (II) acetate monohydrate hòa tan vào dung dịch gồm 10 ml acid acetic glacial 1000ml nƣớc cất Hỗn hợp đƣợc mang đun khuấy đến tan hoàn toàn C.4.Thuốc thử Mayer: Hòa tan 1,358g HgCl2 60ml nƣớc cất Tiếp tục cân 5g KI hòa tan 10ml nƣớc cất Sau tiến hành trộn dung dịch lại với định mức nƣớc cất đến100 ml C.5 Thuốc thử Dragendroff: Gồm dung dịch: -Dung dịch A: hòa tan 0,5 g Bismuth nitrate (Bi(NO3)3.5H2O) 20 ml acid acetic 20% -Dung dịch B: dung dịch KI 40% hòa tan nƣớc cất Khi sử dụng, trộn 20 ml dung dịch A với ml dung dịch B 70ml nƣớc cất C.6 Thuốc thử Hager Hòa tan g acid picric vào 100ml nƣớc cất, sau lọc dung dịch thu dịch lọc C.7 Thuốc thử Wagner Hòa tan 2g I2 6g KI vào nƣớc cất định mức đến 100ml Thuốc thử dung dịch tan hoàn toàn, tránh tiếp xúc ánh sáng 14 Đồ án tốt nghiệp C.8 Natri nitro prusside Hòa tan1g Natri nitroferricyanide vào 10 ml nƣớc cất 15 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC D KẾT QUẢ HÌNH ẢNH XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA CAO CHIẾT NƢỚC TỪ BỒ CÔNG ANH D.1 Kết dƣơng tính thử nghiệm định tính Carbohydrate A B A Thử nghiệm Molisch B Thử nghiệm Barfoed D.2 Kết dƣơng tính thử nghiệm định tính Saponin Thử nghiệm Foam 16 Đồ án tốt nghiệp D.3 Kết dƣơng tính thử nghiệm định tính Alkaloids A A Thử nghiệm Wagner B C B Thử nghiệm Hager C Thử nghiệm Dragendroff D.4 Kết dƣơng tính thử nghiệm định tính Tannin Thử nghiệm Tannin 17 Đồ án tốt nghiệp D.5 Kết dƣơng tính thử nghiệm định tính amino acid Thử nghiệm Ninhydrin 18 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC E KẾT QUẢ HÌNH ẢNH VỊNG KHÁNG KHUẨN CỦA CAO CHIẾT NƢỚC TỪ BỒ CÔNG ANH A B A L.monocytogenes 200 mg/ml C B L.innocua200 mg/ml D C Shi.sonnei 200 mg/ml D Shi.sonnei 100 mg/ml E F E V.cholerae 200 mg/ml F V.alginolyticus 200 mg/ml 19 Đồ án tốt nghiệp G H G E.feacalis 200 mg/ml H E.feacalis 100 mg/ml I J I S.typhii 200 mg/ml J ETEC 200mg/ml 20 ... - Khảo sát sơ hoạt tính kháng khuẩn cao chiết bồ công anh chủng vi khuẩn gây bệnh - Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa cao chiết nƣớc từ bồ công anh - Xác định diện số thành phần hóa học cao chiết. .. kết hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nƣớc Bồ công anh 20 vi khuẩn gây bệnh 63 3.4 Kết định tính số thành phần hóa học cao chiết nƣớc Bồ công anh 64 3.5 Kết định lƣợng số thành phần hóa. .. độc tính chƣa đƣợc xác định cụ thể Vì việc đánh giá hoạt tính sinh học thành phần hóa học thuốc điều cần thiết Với sở khoa học ý nghĩa thực tiễn trên, tiến hành thực đề tài: “Bƣớc đầu khảo sát số