Thành phần hóa học và hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu lá Xạ hương (Thymus vulgaris) được khảo sát. Tinh dầu Xạ hương được ly trích thành công bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước đạt hiệu suất 1,60%. Bằng phương pháp phân tích sắc ký khí ghép khối phổ(GC-MS), thành phần hóa học chính trong tinh dầu lá Trầu không được xác định là hợp chất Thymol với hàm lượng 50,84%.
Nghiên cứu khoa học công nghệ KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU CỎ XẠ HƯƠNG Nguyễn Hà Trung*, Nghiêm Ngọc Hoa, Phạm Kiên Cường Tóm tắt: Thành phần hóa học hoạt tính kháng vi sinh vật tinh dầu Xạ hương (Thymus vulgaris) khảo sát Tinh dầu Xạ hương ly trích thành cơng phương pháp chưng cất lôi nước đạt hiệu suất 1,60% Bằng phương pháp phân tích sắc ký khí ghép khối phổ(GC-MS), thành phần hóa học tinh dầu Trầu không xác định hợp chất Thymol với hàm lượng 50,84% Hoạt tính kháng vi sinh vật tinh dầu đánh giá phương pháp pha loãng đa nồng độ để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật cho thấy tinh dầu Xạ hương có khả ức chế tăng trưởng chủng vi sinh vật: Staphylococcus aureus Escherichia với giá trị MIC 110 82,5 μg/mL Từ khóa: Thymol; Xạ hương; Kháng khuẩn; Tinh dầu ĐẶT VẤN ĐỀ Cỏ xạ hương lồi thực vật có hoa họ Hoa môi, sử dụng rộng rãi ẩm thực, dược liệu trang trí Tại Việt Nam trồng Đà Lạt Sa Pa Thành phần cỏ xạ hương gồm thành phần quan trọng Thymol, Carvacrol Eugenol Thymol dẫn xuất monoterpene tự nhiên cymene carvacrol đồng phân [1] Ngày nay, loại tinh dầu nói chung tinh dầu Xạ hương nói riêng, có chứa thymol, sử dụng nhiều mục đích, ví dụ chất sát trùng, chống viêm, chất bảo quản thực phẩm hương liệu Thymol Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) công nhận chất phụ gia thực phẩm (công bố số 21 CFR 172.515) chất bảo quản thực phẩm (công bố số 21 CFR 175.105) phép sử dụng Thymol sử dụng chất khử trùng bề mặt, thuốc trừ sâu (thuốc trừ sâu, thuốc diệt nấm, thuốc diệt chuột, thuốc chống vi trùng, v.v.), chất chống oxy hóa, thuốc thử phòng thí nghiệm, nước hoa [1] Thymol, thường kết hợp với glycerin, ethanol chất bay khác, sử dụng để làm nước súc miệng Ví dụ, Listerine® chứa 0,06% thymol với tinh dầu bạc hà, eucalyptol methyl salicylate Hầu hết ứng dụng có liên quan đến hiệu kháng khuẩn thymol nhiều loại vi khuẩn, nấm mốc, nấm giun đường ruột, hoạt tính chống oxy hóa chúng Thymol cỏ Xạ hương có phổ kháng khuẩn rộng, bao gồm vi khuẩn Gram dương Gram âm Nhiều nghiên cứu khả kháng loại vi khuẩn có mặt thực phẩm Salmonella, Escherichia, Pseudomonas, Listeria, Bacillusspecies số mầm bệnh liên quan đến nhiễm trùng đường hơ hấp, thể tiềm to lớn thymol tinh dầu xạ hương bảo quản thực phẩm [2] Việc bảo quản thực phẩm thường liên quan đến biện pháp làm chậm ngăn ngừa thay đổi vi sinh, hóa học vật lý, gây ảnh hưởng đến chất lượng cảm quan làm hỏng thực phẩm Thực tế, hư hỏng thực phẩm yếu tố vi sinh quan trọng thường diễn so với yếu tố khác Mặt khác, xu hướng người tiêu dùng sử dụng sản phẩm khơng có chất hóa học Do đó, loại tinh dầu thu từ gia vị húng quế, quế, oregano, hương thảo, xô thơm xạ hương nghiên cứu ngày nhiều, bên cạnh tính chất cảm quan chúng, hợp chất thể hoạt tính chức có ích khác Báo cáo trình bày kết nghiên cứu thành phần hóa học khả kháng vi khuẩn gram âm E coli gram dương S aureus tinh dầu cỏ xạ hương, từ ứng dụng vào bảo quản thực phẩm Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 66, - 2020 139 Hóa học & Kỹ thuật mơi trường VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Nguyên liệu Cỏ xạ hương khô thu mua từ sở trồng thảo dược Đà Lạt, nguyên liệu nghiền nhỏ cối, chia túi nhỏ 100g, bảo quản 4oC sử dụng Chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 25923 Escherichia coli ATCC 25922 cung cấp từ phòng thí nghiệm vi sinh, Viện Cơng nghệ sinh học công nghệ thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội 2.2 Phương pháp trích ly tinh dầu [3] Tinh dầu Xạ hương ly trích từ 100g cỏ Xạ hương khô phương pháp chưng cất lôi nước trực tiếp, với chưng cất tinh dầu Clevenger, sản phẩm thu được làm khan Na2SO4 Đồng thời khảo sát ảnh hưởng thời gian chưng cất, thể tích nước bổ sung nhiệt độ sử dụng trình chưng cất đến hàm lượng tinh dầu thu Hiệu suất thu nhận tinh dầu tính theo cơng thức: Hiệu suất thu nhận (%) = ố ượ ố ượ ê ầ ( ) ệ ( ) × 100 2.3 Phân tích thành phần hóa học tinh dầu thu [4] Thành phần hàm lượng cấu tử có tinh dầu phân tích phương pháp Sắc kí khí-khối phổ (GC/MS), thực hệ thống thiết bị sắc kí khí phổ kí liên hợp GC/MS hãng Agilent Technologies HP 6890N Agilent Technologies HP 6890N ghép nối với Mass Selective Detector Agilent HP 5973 MSD Cột HP-5MS có kích thước 0,25 µm x 30 m x 0,25 mm Chương trình nhiệt độ với điều kiện 60°C/2 phút; tăng nhiệt độ 4°C/1 phút 220°C, sau lại tăng nhiệt độ 20°/phút 260°C; với He làm khí mang Việc xác nhận cấu tử thực 42 cách so sánh kiện phổ MS chúng với phổ chuẩn cơng bố có thư viện Willey/Chemstation HP 2.4 Xác định hoạt tính kháng khuẩn phương pháp phương pháp đo đường kính vòng kháng khuẩn [5] Chủng vi khuẩn hoạt hóa trước 37oC 24 mơi trường MHA Đĩa giấy tiệt trùng đường kính 6mm tẩm 10 µl tinh dầu đặt lên bề mặt thạch chứa sẵn huyền dịch vi khuẩn nồng độ 108 CFU/ml Sau đem ni 37oC 24 Kích thước vòng kháng khuẩn (D) khoảng mà vi sinh vật khơng thể phát triển Kích thước vòng kháng khuẩn lớn khả kháng khuẩn tinh dầu cao ngược lại Hoạt tính ức chế khuẩn đánh giá cách đo bán kính (BK) vòng ức chế vi sinh vật cơng thức: BK = D - d (mm) Trong đó: D = đường kính vòng vơ khuẩn; d = đường kính đĩa giấy tiệt trùng Thí nghiệm lặp lại ba lần lấy giá trị bán kính trung bình Mẫu tinh dầu pha loãng theo thang nồng độ thấp dần, để tính nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)- nồng độ mà vi sinh vật bị ức chế gần hồn tồn Mẫu có MIC ≤ 200 µg/mL có hoạt tính KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình chưng cất tinh dầu 3.1.1 Ảnh hưởng thời gian chưng cất Tiến hành khảo sát ảnh hưởng thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu thu 140 N H Trung, N N Hoa, P K Cường, “Khảo sát thành phần hóa học … cỏ xạ hương.” Nghiên cứu khoa học công nghệ 100g xạ hương khô, cố định yếu tố nhiệt độ 100oC, thể tích nước bổ sung 200ml Kết trình bày bảng Bảng Kết khảo sát thời gian chưng cất tinh dầu xạ hương Thời gian (giờ) 2,5 3,5 Hiệu suất tinh dầu (%) 0,4766 0,496 0,768 0,62 0,624 0,4534 Bảng cho thấy hàm lượng tinh dầu thu phụ thuộc vào thời gian chưng cất, hàm lượng tinh dầu tăng thời gian chưng cất tăng với thời gian chưng cất giờ, hàm lượng gần đạt cao Kết phù hợp với nghiên cứu tương tự, thời gian chưng cất tối ưu nhóm nghiên cứu chọn khơng vượt [6] Mặt khác, chưng cất với thời gian lâu lượng tinh dầu thu nhiều khơng đáng kể Vì vậy, để tiết kiệm thời gian, thời gian ly trích tinh dầu tối ưu chọn cố định để tiếp tục khảo sát yếu tố khác 3.1.2 Ảnh hưởng thể tích nước cất thêm vào Khảo sát ảnh hưởng thể tích nước cất thêm vào đến hàm lượng tinh dầu ly trích từ 100 g xạ hương khô cách tiến hành chưng cất tinh dầu với thể tích nước khác nhau, cố định yếu tố lại Mục đích nhằm xác định thể tích nước tối ưu cho trình chưng cất, tránh sử dụng lượng nước q dư, khơng có lợi cho việc ly trích tinh dầu Kết thể bảng Bảng Kết khảo sát lượng nước bổ sung đến hàm lượng tinh dầu Thể tích (ml) 100 150 200 250 300 Hiệu suất tinh dầu (%) 0,562 0,751 1,017 1,561 0,634 Nước có tác dụng thẩm thấu vào mơ ngun liệu, sau hòa tan, khuếch tán lôi hợp chất hữu tinh dầu, có tác dụng phá vỡ hệ keo xung quanh tinh dầu, tạo điều kiện cho tinh dầu thoát dễ dàng Bảng cho thấy rằng, trình chưng cất tinh dầu Xạ hương tỷ lệ dung môi khảo sát tối ưu nằm tỷ lệ 2,5/1 Trong khoảng tỷ lệ dung môi tinh dầu tạo suốt, tạo nhũ tương, mùi thơm tự nhiên Ta có nhận xét tinh dầu thu tăng theo tỷ lệ nước/ khối lượng Quá trình đạt hiệu thu tinh dầu cao tỷ lệ 2,5/1 Nếu thể tích nước làm tinh dầu khuếch tán không tốt vào dung dịch làm cho thời gian chưng cất kéo dài thời gian tiếp xúc nhiệt lâu tinh dầu ngả vàng chất lượng tinh dầu giảm xuống Nếu lượng nước cao khả tạo nhũ tương tinh dầu với nước cao, làm chất lượng tinh dầu giảm xuống lượng nước nhiều thành phần phân cực tan nhiều vào nước, lại thành phần khơng phân cực với tỷ lệ hợp phần cao, khả tạo nhũ tương cao, đó, hiệu suất thu tinh dầu giảm mạnh tăng lượng nước lên 300ml 3.1.3 Ảnh hưởng nhiệt độ chưng cất Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ chưng cất đến hàm lượng tinh dầu ly trích từ 100 g xạ hương khô cách tiến hành chưng cất tinh dầu với nhiệt độ khác nhau, cố định yếu tố lại theo kết khảo sát thí nghiệm trước (thời gian giờ, tỷ lệ nước/nguyên liệu 2,5/1) Kết thể bảng Bảng Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Nhiệt độ (°C) 80 85 90 95 100 Hiệu suất tinh dầu (%) 0,048 0,061 0,095 0,152 1,599 Bảng cho thấy nhiệt độ thấp 90oC gần khơng có tinh dầu thu được, tăng lên đến 95oC tinh dầu bắt đầu cuồn theo nước bay lên ngưng tụ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 66, - 2020 141 Hóa học & Kỹ thuật mơi trường với nước đạt 100oC nhiệt độ sôi nước, nước bốc lên nhiều hơn, lôi thêm nhiều tinh dầu suốt thời gian chưng cất, cuối trình đạt hiệu suất tinh dầu 1,599 % Như vậy, nhiệt độ chưng cất 100oC nhiệt độ thích hợp cho trinh chưng cất thu tinh dầu xạ hương Phân tích tổng hợp kết trên, điều kiện tối ưu để chưng cất tinh dầu xạ hương phương pháp chưng cất lơi nước quy mơ phòng thí nghiệm đề xuất bảng Bảng Kết điều kiện thích hợp cho q trìnhly trích tinh dầu cỏ Xạ hương phương pháp chưng cất lôi nước Khối lượng Thời gian (giờ) Thể tích Nhiệt độ (°C) Hàm lượng nguyên liệu (g) nước (ml) cao (%) 100 180 250 100 1,60 3.2 Thành phần hóa học tinh dầu Bảng Thành phần hóa học tinh dầu cỏ Xạ hương STT Thời gian lưu (phút) 10,13 13,04 13,16 14,16 22,41 22,71 Thành phần Pinene Cymene Limonene Terpinene Thymol Carvacrol Tổng Hàm lượng (%) 0,16 37,59 0,11 9,78 50,84 0,20 98,68 Từ kết GC/MS cho thấy thành phần hóa học tinh dầu cỏ Xạ hương thu nhận bao gồm hợp chất chiếm khoảng 98,68% thành phần tinh dầu Trong đó, hợp chất Thymol (50,84%), Cymene (37,59%) Terpinene (9,78%), kết tương đồng với nghiên cứu Borugă O cộng (2014) [5] Có thể thấy cấu tử chiếm hàm lượng cao tinh dầu dẫn xuất phenol nên tinh dầu có nhiệt độ sơi, tỷ trọng chiết suất cao Các dẫn xuất phenol có mặt tinh dầu có tác dụng sinh học tốt tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa, độc tính tế bào [7],… 3.3 Hoạt tính kháng khuẩn Từ tinh dầu nguyên chất ban đầu, pha loãng thang nồng độ thấp dần, từ xác định giá trị MIC Kết thử nghiệm trình bày bảng Bảng Kết xác định hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu Xạ hương Độ pha loãng 1/10 1/50 1/100 1/150 1/200 1/250 Nồng độ thymol (µg/ml) 1650 330 165 110 82,5 66 S aureus - - - - - + E coli - - - - + + Dấu (-): Khơng có vi khuẩn mọc xung quang, vòng kháng khuẩn ≥ 10mm Dấu (+): Có vi khuẩn mọc xung quanh, vòng kháng khuẩn ≤ 10 mm Đường kính giấy = mm 142 N H Trung, N N Hoa, P K Cường, “Khảo sát thành phần hóa học … cỏ xạ hương.” Nghiên cứu cứu khoa học cơng nghệ Hình Khả Khả kháng khuẩn tinh dầu xạạ hương hương vvới E Coli Coli Khả kháng Hình 22 Khả háng khu khuẩn ẩn ureus ureus tinh ddầu ầu xạ hương hương với với S Aureus Từ ảng rằng,, MIC kết bảng thể nhận thấy tinh dầu xạ hương hương đđối ối với chủng khuẩn gram âm E coli 110 µg/ml gram dương S aureus 82,5 µg/ml K vi khuẩn Kết ết này thấy hoạt tính tinh dầu xạ hhương cho thấy ương cao so với với tinh dầu tía tơ tinh dầu này ối với E coli [8] khơng có thấy thấy hoạt tính kháng khuẩ khuẩnn đđối [8] Tương ttự ự so sánh với tinh dầu giới, tinh dầu xạ hhương Kinh giới, ương cũng cho thấy hoạt tính kháng khuẩn mạnh hơn đđối ối với âm E coli (MIC 110 µg/ml < 2048 µg/ml) ccảả với S aureus (MIC 82,5 µg/ml < 2048 µg/ml) Hoạt tính kháng khuẩn tinh ddầu phần Hoạt ầu phụ thuộc vào vào thành ph ần hóa học chúng Rõ Rõ ràng, hoạt hoạt động kháng khuẩn tinh dầu Xạ hương hương đư ợc phân tích có liên liên quan đđến ến ện diện hợp chất phenolic (thymol) vvàà terpene hydrocarbons (-terpinene) ( terpinene) [9] 37,59%),, không cho th Cymene, thành phần phần thứ hai theo ttỷ ỷ lệ phần trăm (37,59%) (37,59%) thấy hiệu ình [10] [10] Tuy nhiên nghiên cứu kháng khuẩn khuẩn đ ợc sử dụng m cứu tác giả Delgado cộng (2004) đđãã chỉ tác dụng hiệp đồng Cymene với Thymol hoạt tính B cộng ự llàà tác dụng khảả kháng khuẩn, khuẩn, tương tương ttự dụng hiệp đồng Thymol vvàà Terpinene kh ũng đđã đư kháng E coli, S aureus, B cereus ợc Gallucci M.N và cộng cộng (2009) chứng cho thấy minh [11, 12] 12] Điều Điều nnày ày thấy tác dụng hiệp đồng thành thành phần phần hóa học liên liên đến hoạt tính sinh hhọc quan đến ọc tinh dầu KẾT K ẾT LUẬN trình chưng cất phương pháp lôi cu Nghiên cứu cứu tr ình chưng cất tinh dầu từ cỏ Xạ hương hương bbằng ằng phương ốn nước nư ớc quy mơ phòng phòng thí nghiệm nghiệm đđã đđềề xuất điều kiện tối ưu vvềề thời gian (180 phút), tỷ lệ bổ liệu chư ổ sung nư nước/nguy ớc/nguyên li ớc/nguyên ệu (2,5/1), nhiệt độ ch ưng ng cất cất (100oC) vvới ới hiệu suất đạt đđược ợc cao nhất 1,60% Áp dụng dụng phương phương pháp phân tích hiện đại GC/MS cho thấy tinh dầu thu đđư ược ợc từ chứa thành ph ần llàà Thymol (50,84%), Cymene (37,59%) cỏ Xạ hương hương có ch ứa thành phần phần nghiên ên ccứu Terpinene (9,78%) m ột số thành thành ph ần khác Kết quả nghi ứu thành thành ph phần ần hóa học ự đđư tinh dầu dầu Xạ hương hương được so sánh với kết số nghiên nghiên cứu cứu tương tương ttự ược ợc thực thành ực Rumani (Borugă O vvàà ccộng ộng sự, 2014) nhận thấy có tương tương đồng đồng th ành phần chiếm hàm phần hàm lượng lượng cao llàà Thymol (50,84% (50,84% 47,59%), nhiên có ssự ự sai khác thành thành phần phần có hàm hàm lượng lượng nhiều thứ 2, là Cymene Terpinene Có ssự ự khác th làà ssự ự khác khí hậu, thổ nhưỡng ỡng phương phương pháp thu tinh ddầu ầu biểu Tinh dầu dầu Xạ hương hương bi ểu hoạt tính kháng vi khu khuẩn ẩn tốt với vi khuẩn Gram (+) S aureus cả vi khuẩn Gram (( )) E coli coli Đây ssở giúp ứng dụng tinh dầu Xạạ hhương nhiên, ương một chất kháng khuẩn tự nhi ên, cho thấy thấy tiềm to lớn việc ứng dụng vào bảo ụng vào bảo quản thực phẩm Tạp 2020 ạp chí Nghiên Nghiên cứu cứu KH&CN quân uân sự, sự, Số 666, - 2020 143 Hóa học & Kỹ thuật mơi trường TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Salehi, B., et al., “Thymol, thyme, and other plant sources: Health and potential uses” Vol 32 2018 [2] Laranjo, M., et al., “Use of essential oils in food preservation” 2017 [3] “Dược điển Việt Nam IV” 2009: NXB Hà Nội [4] Wesolowska, A., M Grzeszczuk, and D Jadczak, “Comparison of the Chemical Composition of Essential Oils Isolated by Water-steam Distillation and Hydrodistillation from Garden Thyme (Thymus vulgaris L.)” Journal of Essential Oil Bearing Plants, 2016 19(4): p 832-842 [5] Borugă, O., et al., “Thymus vulgaris essential oil: chemical composition and antimicrobial activity” Journal of Medicine and Life, 2014 7(Spec Iss 3): p 56-60 [6] Kuok Loong, N.G., P.F Wahida, and C.H Chong, “Optimisation of extraction of thymol from plectranthus amboinicus leaves using response surface methodology” Vol 2014 79-88 [7] Hayek, S., R Gyawali, and S Ibrahim, “Antimicrobial Natural Products” Vol 2013 [8] Nguyễn Thị Hoàng Lan, “Khả kháng khuẩn tinh dầu tía tơ” Tạp chí Khoa học Phát triển, 2015 13(2): p 245-250 [9] Flores Santurio, D., et al., “Antimicrobial Activity of the Essential Oil of Thyme and of Thymol against Escherichia coli Strains” Vol 42 2014 [10] Dorman, H.J and S.G Deans, “Antimicrobial agents from plants: antibacterial activity of plant volatile oils” J Appl Microbiol, 2000 88(2): p 308-16 [11] Delgado, B., et al., “Effect of thymol and cymene on Bacillus cereus vegetative cells evaluated through the use of frequency distributions” Food Microbiology, 2004 21(3): p 327-334 [12] Gallucci, M.N., et al., “Antimicrobial combined action of terpenes against the foodborne microorganisms Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Bacillus cereus” Flavour and Fragrance Journal, 2009 24(6): p 348-354 ABSTRACT CHEMICAL COMPOSITION AND ANTI-MICROBIAL ACTIVITY OF ESSENTIAL OIL FROM LEAVES OF THYMUS VULGARIS Chemical composition and anti-microbialactivity of essential oil from leaves of Thymus vulgaris have been investigated The highest yield of oil (1.60 %) of Thymus vulgaris leaves was successfully extracted by steam distillation By using gas chromatography-mass spectrometry analysis (GC-MS), we have confirmed that the main component of Thymus vulgaris essential oil is Thymol, with content up to 50.84% The in vitro anti-microbial activity was evaluated by Minimum Inhibitory Concentration (MIC) method The results showed that the essential oil from Thyme leaves inhibited the growth of microorganisms species: Staphylococcus aureus and Escherichia coli with the MIC values of 110 and 82,5 μg/mL, respectively Keywords: Thymol; Thymus vulgaris; Anti-microbial activity; Essential oil Nhận ngày 26 tháng 06 năm 2019 Hoàn thiện ngày 19 tháng 11 năm 2019 Chấp nhận đăng ngày 10 tháng năm 2020 Địa chỉ: Viện Công nghệ mới/Viện Khoa học công nghệ quân *Email: nghatrung@gmail.com 144 N H Trung, N N Hoa, P K Cường, “Khảo sát thành phần hóa học … cỏ xạ hương.” ... 100 180 250 100 1,60 3.2 Thành phần hóa học tinh dầu Bảng Thành phần hóa học tinh dầu cỏ Xạ hương STT Thời gian lưu (phút) 10,13 13,04 13,16 14,16 22,41 22,71 Thành phần Pinene Cymene ... đồng thành thành phần phần hóa học liên liên đến hoạt tính sinh hhọc quan đến ọc tinh dầu KẾT K ẾT LUẬN trình chưng cất phương pháp lơi cu Nghiên cứu cứu q tr ình chưng cất tinh dầu từ cỏ Xạ hương. .. khí hậu, thổ nhưỡng ỡng phương phương pháp thu tinh ddầu ầu biểu Tinh dầu dầu Xạ hương hương bi ểu hoạt tính kháng vi khu khuẩn ẩn tốt với vi khuẩn Gram (+) S aureus cả vi khuẩn Gram (( )) E coli