Nghiên Cứu Sự Đa Dạng Di Truyền Các Giống Sầu Riêng (Durio Zibethinus Murr.) Bằng Kỹ Thuật RAPD

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NC&PT CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HOC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC GIỐNG SẦU RIÊNG (Durio Zibethinus Murr.) BẰNG KỸ THUẬT RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS TRẦN NHÂN DŨNG VIỆN NC & PT CNSH SINH VIÊN THỰC HIỆN TRỊNH KIỀU THẾ LOAN MÃ SỐ SINH VIÊN: 3064459 LỚP CNSH K32 Cần Thơ, 06- 05- 2010 LỜI CẢM TẠ Xin chân thành biết ơn: Thầy Trần Nhân Dũng tận tình hướng dẫn, trực tiếp bảo, động viên, thăm hỏi tạo điều kiện tốt giúp em hoàn thành tốt đề tài Anh Trần Văn Bé Năm, chị Nguyễn Thị Giáng Đan, anh Nguyễn Vũ Linh, chị Nguyễn Phạm Anh Thi – Cán Phịng thí nghiệm Sinh học Phân Tử, giúp đỡ dẫn em suốt thời gian thực đề tài Cô Trần Thị Xuân Mai – cố vấn học tập dẫn, khuyên bảo động viên em suốt thời gian học tập trường Các Thầy Cô Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học tạo nhiều điều kiện thuận lợi để em hoàn thành đề tài Cảm ơn bạn Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Nguyễn Ngọc Vân Thanh, Nguyễn Kim Thúy, Nguyễn Thái Học, Phạm Văn Một nhiệt tình giúp đỡ động viên tơi suốt thời gian qua Con xin gửi lời tri ân sâu sắc đến Cha Mẹ - người nuôi nấng, dạy bảo nên người tạo điều kiện thuận lợi cho học tập Xin chân thành biết ơn cám ơn Thầy, Cô, Ba Mẹ, Anh Chị bạn! Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT TĨM TẮT Dựa vào thị phân tử RAPD để nghiên cứu xác định tính đa dạng di truyền 20 dịng/giống sầu riêng số tỉnh Đồng sông Cửu Long Bến Tre, Trà Vinh, Tiền Giang Trong đó, khuyếch đại 10 đoạn mồi RAPD (A13, OPR10 OPS14, OPS11, SN20, OPS05, OPH13, OPH18, OPO05 OPN09) ghi nhận kết 111 dấu phân tử Dựa kết cho thấy mức độ đa dạng di truyền 20 dòng/ giống sầu riêng đánh giá cao, xếp thành nhóm khác có mức độ tương đồng giống biến động từ 64% đến 87,71%, Từ khóa: RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA), matK, sầu riêng, đa dạng di truyền, dấu thị phân tử Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT ABSTRACT Twenty varieties of durian in some regions of Mekong Delta such as Ben Tre, Tra Vinh, Tien Giang… were analysed by RAPD Consequently, ten RAPD primers (A13, OPR10, OPS14, OPS11, SN20, OPS05, OPH13, OPH18, OPO05 and OPN09) amplified 111 bands Based on 111 bands, twenty varieties of durian were classified into four groups with high frequency of genetic diversity The similarities of varieties were from 64% to 87.71% Keyword: RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA), matK, durian, genetic diversity, marker Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT MỤC LỤC  PHẦN KÝ DUYỆT LỜI CẢM TẠ TÓM TẮT i ABSTRACT ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH BẢNG v DANH SÁCH HÌNH vi CÁC TỪ VIẾT TẮT viii CHƢƠNG I: GIỚI THIỆU 1.1 1.2 Đặt vấn đề Mục tiêu CHƢƠNG II: LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 Sơ lƣợc nguồn gốc phân loại Sầu riêng 2.1.1 Nguồn gốc đặc điểm phân bố 2.1.2 Phân loại Đặc điểm hình thái Sầu riêng Hiện trạng Sầu riêng 2.3.1 Trên giới 2.3.2 Ở Việt Nam Đặc điểm lục lạp vùng gen matK (maturase matK) Kỹ thuật sinh học phân tử .8 2.5.1 PCR (polymerase chain reaction) 2.5.2 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 10 2.5.3 Các phương pháp giải trình tự 11 2.5.4 Những nghiên cứu liên quan 14 CHƢƠNG III: PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1 Phƣơng tiện .16 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 3.2 Trường ĐHCT 3.1.1 Dụng cụ thiết bị 16 3.1.2 Hóa chất 16 3.1.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu 16 Phƣơng pháp thực 17 3.2.1 Thu mẫu 17 3.2.2 Trích DNA 17 3.2.3 Thực phản ứng PCR .18 3.2.4 Giải trình tự 21 3.2.5 Phân tích số liệu 23 CHƢƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 4.1 Thu mẫu 25 4.2 Đặc điểm hình thái sầu riêng .26 4.3 Ly trích DNA mẫu 26 4.3.1 Phương pháp định tính DNA 26 4.3.2 Phương pháp định lượng DNA 27 4.4 Phân tích sản phẩm khuếch đại 28 4.4.1 Kỹ thuật RAPD 28 4.4.2 Gen matK .40 CHƢƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42 5.1 Kết luận 42 5.2 Đề nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Các hình ảnh Phụ lục 2: Kết Bảng 8: Số liệu phân tích Marker dịng sầu riêng số tỉnh Đồng sông Cửu Long Bảng 9: Tương quan di truyền 20 mẫu sầu riêng Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Danh sách mồi sử dụng phương pháp RAPD 19 Bảng 2: Thành phần phản ứng PCR mồi RAPD 19 Bảng 3: Thành phần phản ứng PCR cặp mồi matK-390F/matK-132R 20 Bảng 4: Thành phần hóa chất cho phản ứng Cycle Sequencing 22 Bảng 5: Danh sách 20 mẫu Sầu riêng thu mẫu số tỉnh Đồng sông Cửu Long 24 Bảng 6: Kết đo nồng độ mẫu DNA bước sóng 260nm 280nm 26 Bảng 7: Trình tự mồi tổng số băng mồi 34 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Các đặc điểm hình thái Sầu Riêng Hình 2: Cấu tạo lục lạp Hình 3: Kết giải trình tự đoạn DNA 14 Hình 4: Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR cặp mồi RAPD 20 Hình 5: Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR cặp mồi matK-390F/matK-132R 21 Hình 6: Chu kỳ nhiệt phản ứng Cycle Sequencing 23 Hình 7: Kết kiểm tra nhanh DNA sau trích 25 Hình 8: Primer OPO05 từ mẫu sầu riêng thứ đến 18 27 Hình 9: Primer OPH18 từ mẫu sầu riêng đến 18 27 Hình 10: Primer OPN09 từ mẫu sầu riêng đến 18 27 Hình 11: Primer OPS14 từ mẫu sầu riêng đến 18 28 Hình 12: Primer A13 từ mẫu sầu riêng đến 18 28 Hình 13: Primer OPR10 từ mẫu sầu riêng đến 18 28 Hình 14: Primer OPS11 từ mẫu sầu riêng đến 18 29 Hình 15: Primer SN20 từ mẫu sầu riêng đến 18 29 Hình 16: Primer OPH13 từ mẫu sầu riêng đến 18 29 Hình 17: Primer OPS05 từ mẫu sầu riêng đến 18 30 Hình 18: Phổ điện di sản phẩm PCR với mồi OPO05 gel Agarose 1.5% 31 Hình 19: Phổ điện di sản phẩm PCR với mồi OPN09 gel Agarose 1.5% 31 Hình 20: Phổ điện di sản phẩm PCR với mồi OPH18 Agarose 1.5% 33 Hình 21: Giản đồ phả hệ 20 mẫu sầu riêng 35 Hình 22: Phổ điện di sản phẩm PCR với cặp mồi matK-390F/matK-132R Sầu riêng từ mẫu 1- 16 so với thang chuẩn 1Kb 38 Hình 23: : Một đoạn giản đồ peak gen matK Sầu riêng Mon Thong Ngũ Hiệp, Tiền Giang, 2010 39 Hình 24: Một đoạn giản đồ peak gen matK Sầu riêng Lựu đạn (Mẫu 2) Ngũ Hiệp, Tiền Giang, 2010 39 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT CÁC TỪ VIẾT TẮT RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) PCR (Polymerase Chain Reaction) cpDNA (chloroplast DNA) ddNTP (dideoxynucleotide) EtBr (Ethidium Bromide) CTAB (Cetyl Trimetyl Amoni Bromua) EDTA (Ethylenediaminetetra Acetic Acid) SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) TE (Tris Edta) RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) EB (Extraction Buffer) OD (Optical Density) UPGMA (Unweighted Pair-Group Method, Arithmethic Average) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT CHƢƠNG I: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Những năm gần diện tích trồng ăn trái nước ta mở rộng nhiều phát triển loại ăn trái có tiềm xuất bưởi, măng cụt, sầu riêng, xồi… Đặc biệt diện tích trồng sầu riêng chuyển biến khởi sắc, trồng nhiều tỉnh Đồng Nai (Long Thành, Long Khánh), Lâm Đồng (Bảo Lộc - Di Linh) diện tích trồng vườn khơng lớn, chưa khai thác hết tiềm có (Miền Đơng Nam Bộ có 120.000 với chủng loại trái đa dạng phong phú, có 10.000 sầu riêng) ( www.rauhoaquavietnam.vn) Sầu riêng loại ăn trái nhiệt đới đặc biệt, có giá trị dinh dưỡng cao, nhiều chất béo, chất đường, nhiều lượng protein, nhiều viatmin A, C canxi (Việt Chương, 1999) Ở Việt Nam, sầu riêng xem trái đặc sản vùng Nam Bộ tập trung trồng nhiều Lái Thiêu- Đồng Nai, Cái Mơn-Bến Tre, Ngũ Hiệp- Tiền Giang với nhiều giống sầu riêng tiếng Monthong, Ri-6, cơm vàng hạt lép… Tuy nhiên, q trình trồng nơng dân thường chọn giống từ nhiều nguồn khác chủ yếu dựa vào bố mẹ cho suất cao sinh trưởng tốt mà giống tuyển chọn từ trung tâm sản xuất giống Những tồn gây cho nhà vườn nhiều bất ổn việc lựa chọn giống sầu riêng sản xuất theo qui mơ hàng hóa lớn, khó khăn q trình nghiên cứu tạo giống mà cịn ảnh hưởng đến việc đăng ký thương hiệu xuất quốc tế Vấn đề đặt phải xác định giống sầu riêng cho suất cao, đồng bộ, ổn định, sinh trưởng tốt tạo tiền đề cho việc chọn giống sau Vì việc đánh giá chất lượng giống sầu riêng nghiên cứu mức độ đa dạng di truyền chúng vấn đề cấp thiết Ngày nay, việc phân biệt giống đặc điểm hình thái nơng học, với phát triển kỹ thuật sinh học phân tử, dấu phân tử (molecular marker), với hỗ trợ đắc lực phần mềm tin sinh học, … giúp việc nghiên cứu đa dạng di truyền giống loài sinh vật ngày đơn giản xác Trong đó, kỹ thuật RAPD (Random Amplified polymorphisms DNA) với đoạn mồi ngắn (10 nucleotide) khuếch đại trình tự ngẫu nhiên đoạn DNA kỹ thuật đơn giản, bước đầu nghiên cứu khác biệt di truyền giống cách nhanh chóng Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT Hu, J and C.F Quiros 1991 Identification of broccoli and cauliflowers cultivars with RAPD marker, Plant cell Report 10: 505-511 Kresovich, S., J.G.K Williams, J.K McFerson, E.J.Routman and B.A.Schaal 1992 Characterization of genetics indentities and relationships of Brassica oleracea L via a random amplified polymorphism DNA assay, Theoretical and Applied Genetics 85: 190-196 Lim, Ng, P.K.L and K.K.P 1990 Snakeheads (Pisces: Channidae): Natural history, biology and economic importance Essays Zool 1990:127-152 Hilu K W And H Liang 1997 The natK gene: Sequence variation and aplication in plant systematics, American Journal of Batany, 84, 830-839 Liang H 1997 The Phylogenetic Reconstruction of the Grass Family (Poaceae) Using matK Gene Sequence Degree Doctor of Philosophy, Department Biology Mendoza, G 1941 The reproductive cycle of the viviparouse telost Neotoca bilineota, a member of the family goodeidae III The germ cycle cell cycle Biol Bull 81:70-79 Nanthachai, S 1994 Durian fruit development, post harvest physiolory, handling and maketing in ASEAN ASEAN Food Handling Burean (ATHB) Kuala Lumpur Malaysia O’Gara, E., J Martin and D Guest 2001 The development of a detached-leaf bioassay to screen durian for susceptibility to Phytophthora diseases Sneath, P H A and R R.Sokal 1973 Numerical Taxonomy, Freeman, San Francisco, p573 Sugina M 2003 History of chloroplast genomics, Phytosynthesis Research, 76, 371377 Tinker, N.A., M.G.Fortin and D.E.Mother 1993 Random a and pedigree relationship in spring barley, amplified polymorphism DNA, Theoretical and Applied Genetics 85: 976-984 Trang web www.rauhoaquavietnam.vn(ngày truy cập 17-12-2009) www.agu.edu.vn(ngày truy cập 17-12-2009) www.bio.miami.edu/~cmallery/150/ _gen.htm (ngày truy cập 17-12-2009) http://genomics.cas.psu.edu/research.html (ngày truy cập 17-12-2009 ) hhttp://vi.wikipedia.org/wiki/L%E1%BB%A5c_l%E1%BA%A1p (ngày truy cập 1712-2009) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 42 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học PHỤ LỤC Phụ lục 1: Các hình ảnh 14 15 17 18 20 21 22 23 Hình 25 Hình DNA sầu riêng từ mẫu 14-27 24 25 26 27 Hình 27 Phổ điện di sản phẩm PCR với mồi A13 gel Agarose 1.5% Hình 28 Phổ điện di sản phẩm PCR với mồi OPH13 gel Agarose 1.5% Hình 29 Phổ điện di sản phẩm PCR với mồi OPH18 gel Agarose 1.5% Hình 30 Phổ điện di sản phẩm PCR với mồi OPN09 gel Agarose 1.5% Hình 31 Phổ điện di sản phẩm PCR với mồi OPO05 gel Agarose 1.5% Hình 32 Phổ điện di sản phẩm PCR với mồi OPR10 gel Agarose 1.5% Hình 33 Phổ điện di sản phẩm PCR với mồi OPS05 gel Agarose 1.5% Hình 34 Phổ điện di sản phẩm PCR với mồi OPS11 gel Agarose 1.5% Hình 35 Phổ điện di sản phẩm PCR với mồi SN20 gel Agarose 1.5% Hình 36 Phổ điện di sản phẩm PCR với mồi OPS14 gel Agarose 1.5% Hình 37 Một đoạn giản đồ peak gen matK Sầu riêng Khổ qua xanh Đồng Tháp, 2010 Hình 38 Một đoạn giản đồ peak gen matK Sầu riêng Ri6 Bến Tre, 2010 Hình 39 Một đoạn giản đồ peak gen matK Sầu riêng Cơm vàng hạt lép Hậu Giang, 2010 Hình 40 Một đoạn giản đồ peak gen matK Sầu riêng Khổ qua xanh Ngũ Hiệp, Tiền Giang, 2010 Hình 41 Một đoạn giản đồ peak gen matK Sầu riêng Monthong Cầu Kè, Trà Vinh, 2010 Phụ lục 2: Kết Bảng Số liệu phân tích Marker dịng sầu riêng số tỉnh Đồng sông Cửu Long Băng 10 11 10 11 Mồi A13 OPH 13 OPR 10 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 10 1 1 1 1 0 1 1 1 1 12 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 13 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 14 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 16 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 17 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 18 1 1 1 1 0 1 1 0 1 20 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 21 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 22 1 1 1 0 1 0 1 1 23 1 1 1 1 0 1 0 0 0 24 1 1 1 1 0 0 0 0 1 25 1 1 0 0 0 0 0 1 26 1 1 1 0 0 0 0 0 0 27 1 1 1 1 0 0 0 1 0 10 11 12 13 10 11 12 13 SN20 OPS 11 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 9 10 11 OPS 14 OPS05 OPH18 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 9 10 11 12 13 OPO 05 OPN 09 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 10 11 12 13 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ... “NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC GIỐNG SẦU RIÊNG (Durio zibethinus Murr.) BẰNG KỸ THUẬT RAPD? ?? thực góp phần giải phần vấn đề khó khăn nêu 1.2 Mục tiêu đề tài  Nghiên cứu đa dạng di truyền giống. .. 5.1 Kết luận Chỉ thị RAPD tỏ hữu ích phân tích đa dạng di truyền sầu riêng Phân tích thị RAPD: nghiên cứu đa dạng di truyền 20 mẫu sầu riêng thu từ nhiều tỉnh khác kỹ thuật RAPD với 10 đoạn mồi... tốc độ di chuyển Hiện kỹ thuật RAPD sử dụng phổ biến xây dựng đồ di truyền, xác định cấu trúc di truyền quần thể, vẽ đồ tính trạng, đánh giá tính đa dạng hay đồng dạng di truyền Kỹ thuật RAPD sử