tìm hiểu về e.coli và coliform, nguồn thực phẩm chứa e.coli, coliform, các bệnh và triệu chứng khi nhiễm khuẩn E.coli, coliform, kĩ thuật màng p, đinh lượng escherichia coli và coliform bằng phương pháp sử dụng đĩa đếm petrifilm trong thịt và thủy sản
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM Mơn học: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM Quy trình định lượng E coli Coliform phương pháp màng petrifilm thịt thủy sản Nhóm 11 GVHD: Th.s Liêu Mỹ Đơng NỘI DUNG Tìm hiểu E Nguồn thực Các bệnh coli Coliform phẩm triệu chứng Kỹ thuật màng p Quy trình định lượng Tổng quan Coliforms Trực khuẩn, Gram(-) Lên men Đặc Không lactose điểm sinh bào tử sinh Hiếu khí kỵ khí tùy ý Phân loại Coliforms Escheria Citrobacter Klebsiell Enterobacter Coliforms Coliforms Coliforms chịu nhiệt Coliforms phân E.coli Sơ lược Escherichia (E.coli) Đặc điểm: Thuộc họ vi khuẩn đường ruột Trực khuẩn, gram(-) Khơng sinh bào tử Kỵ khí khơng bắt buộc Hầu hết có lơng roi có khả di động Phát triển 5-40oC, thích hợp 37oC Tính hóa sinh Lên men nhiều loại đường sinh Có khả sinh indole Khơng sinh H2S Betagalactosidase dương tính Kháng nguyên Kháng Kháng nguyên O nguyên K Kháng nguyên H NGUỒN THỰC PHẨM Nguồn thực phẩm chứa E.coli • Phân bố rộng mơi trường sống Trái Đất, hay có mặt thực phẩm, nguồn nước, thường kí sinh ruột già người động vật máu nóng Bước 13: Ủ Đặt đĩa vào bao, dán miệng bao Đặt đĩa với màng bảo vệ hướng lên trên, ủ đĩa nhiệt độ thời gian thích hợp tùy theo tiêu hướng dẫn nhà sản xuất Bước 14: Đọc kết Đếm khuẩn lạc nguồn sáng gián tiếp nguồn sáng khuếch đại (bằng máy đếm khuẩn lạc) Bước 15: Có thể trích biệt khuẩn lạc để thực test thử xác định khác ĐỊNH LƯỢNG ESCHERICHIA COLI VÀ COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐĨA ĐẾM PETRIFILM TRONG THỊT VÀ THỦY SẢN NGUYÊN TẮC Phần lớn chủng E coli sản sinh glucuronidase, chất phản Sử dụng đĩa cấy chứa môi trường dinh dưỡng khô chất tạo đông tan nước lạnh ứng với chất thị màu để tạo kết tủa màu xanh bao quanh khuẩn lạc Do vậy, chủng E.coli dương tính với glucuronidase cho khuẩn dung phùCác mẫuColiform thử chưakhông pha lỗng lạcCho màucác xanh kèmdịch theohuyền bọt khí phải E.coli pha loãng vào đĩa với lượng ml đĩa Dàn dung dịch huyền tích khoảng 20cho cmmàu đỏ kèm theo bọt khí khuẩn lạcphù âm tính diện với glucuronidase Chất tạo đơng có thành phần đĩa làm môi trường dinh dưỡng đĩa đông lại Đĩa ủ ấm 35°C ± 1°C 24 h ± h rối đếm khuẩn lạc ĐỊNH LƯỢNG ESCHERICHIA COLI VÀ COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐĨA ĐẾM PETRIFILM TRONG THỊT VÀ THỦY SẢN Thuốc thử môi trường Chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích nước cất nước có chất lượng tương đương, trừ có quy định khác Nước dùng để pha lỗng (dung dịch nước đệm phosphat) Hịa tan 34 g kali hydro phosphat (KH2PO2) vào 500 ml nước đựng bình định mức lít, chỉnh pH đến 7,2 khoảng 175 ml dung dịch natri hydroxit M thêm nước đến vạch Pha loãng 1,25 ml dung dịch đến lít nước đun sơi để nguội, hấp áp lực 15 phút 121°C ĐỊNH LƯỢNG ESCHERICHIA COLI VÀ COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐĨA ĐẾM PETRIFILM TRONG THỊT VÀ THỦY SẢN Thuốc thử môi trường Chất thị Chất thị 2,3,5-triphenyltetrazolium clorua Chất thị 5-brom-4-clo-3-indolyl-b-D-glucuronid Chất dinh dưỡng mật đỏ-tím (violet red bile nutrients) Chất tạo đơng tan nước ĐỊNH LƯỢNG ESCHERICHIA COLI VÀ COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐĨA ĐẾM PETRIFILM TRONG THỊT VÀ THỦY SẢN Thiết bị dụng cụ Đĩa đếm E.coli/Coliform Petrifilm Đĩa chứa chất dinh dưỡng mật đỏ-tím, chất tạo đông tan nước lạnh, chất thị 2,3,5-triphenyltetrazolium clorua chất thị hoạt độ glucuronidase 5-brom-4-clo-3-indolyl-b-D-glucuronid, đếm Coliform E.coli đĩa Vùng sinh trưởng khoanh tròn đĩa chứa khoảng 20 vng, có diện tích cm màng ĐỊNH LƯỢNG ESCHERICHIA COLI VÀ COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐĨA ĐẾM PETRIFILM TRONG THỊT VÀ THỦY SẢN Thiết bị dụng cụ Dụng cụ dàn mẫu chất dẻo (gồm mặt có gờ mặt láng), cung cấp với đĩa đếm, để dàn huyền Thiết bị đếm khuẩn lạc, loại chuẩn loại có độ khuếch đại độ nhìn thấy tương đương3) phù lên khắp vùng sinh trưởng đĩa Cân, cân xác đến 0,1 g Pipet, hiệu chuẩn, dùng để phân tích vi sinh vật pipet dạng xyranh phân phối 1,0 ml, chia vạch đến 0,1 Thiết bị trộn cao, có bình chứa vơ trùng ml Có thể dùng pipettốc tự độ động Tủ ấm, trì nhiệt độ 35°C ± 1°C Nồi hấp áp lực, trì nhiệt độ 121°C ĐỊNH LƯỢNG ESCHERICHIA COLI VÀ COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐĨA ĐẾM PETRIFILM TRONG THỊT VÀ THỦY SẢN LẤY MẪU Việc lấy mẫu phải nguyên tắc Phòng thử nghiệm phải nhận mẫu đại diện không bị hư hỏng thay đổi trình vận chuyển bảo quản ĐỊNH LƯỢNG ESCHERICHIA COLI VÀ COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐĨA ĐẾM PETRIFILM TRONG THỊT VÀ THỦY SẢN Chuẩn bị mẫu thử Theo TCVN 6507-2:2005 (ISO 6887-2:2003) TCVN 6507-3:2005 (ISO 6887-3:2003) NếuCân tổngvơ khối lượng khơng 50chính g cân mẫug,thử thêm tíchcủa nước để pha cần thiết có dung dịch pha trùng 50 gmẫu phần mẫuđủ thử, xác phần đến 0,1 chothích vào hợp bìnhvà trộn vơ thể trùng thiếtdùng bị trộn (Đốilỗng với mẫu đơngđểlạnh, cân mẫu -1 lỗng 10 rã Tổng tồn5 dao trộn thời gian khơng q 18 h để lấy 50 g phần mẫu thử, cần) Thêm chưa đơng.thể Ổntích địnhtrong mẫubình thử trộn đơngphải lạnhphủ 2hồn °C đến °C 450bịml pha lỗng phân trộn vớicách tốc dùng độ từ 90 10 ml 000nước r/min đếnđể 12pha 000loãng r/min.(4.1) Thờivới gian mẫu dịch thử đến cấytrước Chuẩn cácnước dungdùng dịchđể pha loãng thập dùng 10 trộn ml dung pha lỗng mẫukhi lêncóđĩa mơi trường qdịch 15 đó, trừ quy định khác.khơng Lắc dung 25 lần với biên độ dao động 30 cm thời gian s ĐỊNH LƯỢNG ESCHERICHIA COLI VÀ COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐĨA ĐẾM PETRIFILM TRONG THỊT VÀ THỦY SẢN Đếm E coli đĩađĩa đếm E.coli/Coliform PetrifilmTM lên bềđặc mặt lại phẳng màngtủmỏng phía nhỏ 1nằm ml huyền phùvới mẫu thửhướng vào ĐểĐặt n cho gel đơng ĐặtNhấc đĩa vào ấm (5.7) theoraphương ngang nắp o Dàn huyền phù diện tích 20 cm cách ấn màng Đậy cẩn thận màng mỏng phía xuống chất cấy lên trên, không chồng cao 20 đĩa, ủ ấm đĩa nhiệt độ 35°C ± C 24 ± h Sau ủ xong, bảo quản nhẹ xuống tâm dụng cụ dàn mẫu (mặt láng dụng o cụ dàn mẫu hướng xuống dưới) đông lạnh nhiệt độ nhỏ - 15 C đến ngày, cần ĐỊNH LƯỢNG ESCHERICHIA COLI VÀ COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐĨA ĐẾM PETRIFILM TRONG THỊT VÀ THỦY SẢN Đếm E coli Đếm khuẩn lạc đĩa sau giai đoạn ủ, sử dụng thiết bị Không đếm khuẩn lạc phát triển ngồi vịng trịn giới hạn đếm khuẩn lạc Có thể sử dụng khuếch đại rọi sáng để thuận tiện môicho trường chọn Đếm lọc, tất không cáclạcbọt cókèm thể theo việc đếm cácđếm khuẩn có khí màugiả xanh nhiều bọttác khíchưa (trongđúng vịngtrong đườngq kínhtrình khuẩn lạc) lên đượcmột tạohoặc thao cấy mẫu đĩa đĩa chứa từ 10 khuẩn lạc đến 150 khuẩn lạc ĐỊNH LƯỢNG ESCHERICHIA COLI VÀ COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐĨA ĐẾM PETRIFILM TRONG THỊT VÀ THỦY SẢN Đếm Coliform Đếm khuẩn lạclạc trêncócác đĩađỏ nàynhưng sau giaicóđoạn dụng thiết đếm Các khuẩn màu khơng bọt ủ, khísửkhơng đượcbịcoi khuẩn lạc Có thể sử dụng khuếch đại rọi sáng để thuận tiện cho Coliform Không đếm khuẩn lạc phát triển ngồi vịng trịn giới việc đếm Đếm tất khuẩn lạc có màu đỏ kèm theo nhiều hạn môi trường chọn lọc, không đếm bọt khí giả bọt khí (trong vịng đường kính khuẩn lạc) đĩa chứa từ 15 tạo thao tác chưa trình cấy mẫu lên đĩa khuẩn lạc đến 150 khuẩn lạc ĐỊNH LƯỢNG ESCHERICHIA COLI VÀ COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐĨA ĐẾM PETRIFILM TRONG THỊT VÀ THỦY SẢN Tính hiển thị kết Nhân tổng số lượng khuẩn lạc đĩa (hoặc số lượng trung bình khuẩn lạc đĩa, đếm đĩa kép độ pha loãng) với số nghịch đảo độ pha lỗng tương ứng Nếu khơng có đĩa có số đếm lớn 10 khuẩn lạc với màu đặc trưng kèm bọt khí trở lên (màu đỏ khuẩn lạc Coliform, màu xanh khuẩn lạc E coli) ghi lại số đếm xác đĩa có độ pha lỗng thấp (tương ứng với dung dịch pha lỗng nhất) ĐỊNH LƯỢNG ESCHERICHIA COLI VÀ COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐĨA ĐẾM PETRIFILM TRONG THỊT VÀ THỦY SẢN Tính hiển thị kết Nếu tất đĩa có số đếm lớn 150 xác định số đếm ước tính cách đếm số khuẩn lạc nhiều vng đại diện, tính số đếm trung bình vng nhân số đếm với 20 (diện tích vùng sinh trưởng khoảng 20 cm ) Trong trường hợp này, phải báo cáo số ước tính Nếu đĩa có mật độ khuẩn lạc lớn để ước tính số đếm kết báo cáo "quá nhiều để đếm" ... Chất tạo đơng tan nước ĐỊNH LƯỢNG ESCHERICHIA COLI VÀ COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐĨA ĐẾM PETRIFILM TRONG THỊT VÀ THỦY SẢN Thiết bị dụng cụ Đĩa đếm E.coli/ Coliform Petrifilm Đĩa chứa chất... đó, trừ quy định khác.khơng Lắc dung 25 lần với biên độ dao động 30 cm thời gian s ĐỊNH LƯỢNG ESCHERICHIA COLI VÀ COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐĨA ĐẾM PETRIFILM TRONG THỊT VÀ THỦY SẢN Đếm... chưa trình cấy mẫu lên đĩa khuẩn lạc đến 150 khuẩn lạc ĐỊNH LƯỢNG ESCHERICHIA COLI VÀ COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐĨA ĐẾM PETRIFILM TRONG THỊT VÀ THỦY SẢN Tính hiển thị kết Nhân tổng số lượng