Bài giảng hợp chất thiên nhiên

Bài giảng hợp chất thiên nhiên

Chương 1.1 MỞ ĐẦU KHÁI NIỆM VÀ PHÂN LOẠI HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN 1.1.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU Hợp chất thiên nhiên sản phẩm hữu trình trao đổi chất thể sống Ngành hóa học nghiên cứu tính chất cấu trúc hợp chất thiên nhiên gọi hóa học hợp chất thiên nhiên Lịch sử hợp chất thiên nhiên có từ xa xưa Ngành y học cổ truyền nhiều nước biết nhiều đến độc tính tác dụng chữa bệnh của nhiều chất có nguồn gốc động thực vật Con người phát triển chưng cất tinh dầu từ kỷ 16 Một số hợp chất phân lập sớm campho chiết từ kỷ 17 Cuối kỷ 19, nhà hóa học nghiên cứu tính chất cấu trúc nhiều hợp chất thiên nhiên Một cơng trình có giá trị ‘’qui tắc isopren’’ cấu tạo tecpenoit (Wallch, 1887) Trong năm nửa đầu kỷ 20, nhà hóa học xác định nhiều hợp chất thiên nhiên, citral (Tiemann, Semmler, Verley, 1890-1897), linalol (Tiemann, Ruzicka, 1895-1919)… Việc xác định hợp chất thiên nhiên phương pháp hóa học việc khó khăn phức tạp, có trường hợp phải trăm năm Ví dụ morphin tinh khiết phân lập từ thuốc phiện từ năm 1805, đến năm 1923 nhà hóa học đưa dự đoán cấu trúc đến năm 1952 cấu trúc khẳng định phương pháp tổng hợp Có nhiều hợp chất khác xác định cấu trúc thời gian lâu strychnin (18191954), quinin (1820- 1944) Từ sau năm 1945, ngành hóa học hợp chất thiên nhiên phát triển mạnh mẽ nhờ hỗ trợ phương pháp vật lý đại, đặc biệt phương pháp phân tích quang phổ như: UV, IR, NMR, nhiễu xạ tia X Ngày , song song với nghiên cứu hợp chất thiên nhiên, người ta nghiên cứu cấu trúc hợp chất cao phân tử, đặc biệt hợp chất cao phân tử thể động thực vật sống đại dương để tìm kiếm hợp chất có ích cho người 1.1.2 PHÂN LOẠI CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN Trong thể động thực vật khơng có hợp chất hữu mà cịn có nhiều hợp chất vơ muối khống Trong phần đề cập đến hợp chất hữu có động thực vật Hợp chất hữu thiên nhiên đa dạng phong phú Tùy thuộc vào cách phân loại người ta chia hợp chất thiên nhiên thành nhiều loại khác 1.1.2.1 Dựa vào tính thiết yếu đối động thực vật: người ta chia thành nhóm + Chất trao đổi sơ cấp : Là chất thiên nhiên cần thiết cho sống gồm cacbonhidrat, protein, axit nucleic, lipit dẫn xuất chúng Các hợp chất sản sinh từ thể sống, không phụ thuộc vào lồi Q trình chất trao đổi sơ cấp tạo thành gọi trình trao đổi thứ cấp + Chất trao đổi thứ cấp: Là hợp chất thiên nhiên không hẵn không cần thiết cho sống động thực vật Tuy nhiên khác với chất trao đổi sơ cấp, chất trao đổi thứ cấp thường phụ thuộc nhiều vào loài Các hợp chất thứ cấp bao gồm : tecpenoit, steroit, flavonoit, ankaloit….Chúng sản phẩm trình trao đổi thứ cấp Các chất trao đổi thứ cấp nghiên cứu nhiều tác dụng dược lý hoạt tính sinh học chúng Trong hợp chất thiên nhiên thường có nhóm chức bản: + Hợp chất hidrocacbon chưa no + Ancol- phenol – ete +Andehit- xeton + Axit hữu dẫn xuất + Amin + Dị vòng + Hợp chất tạp chức … 1.1.2.2 Dựa vào khung cacbon, nhóm chức theo tính phổ biến hợp chất: Các hợp chất thiên nhiên thường phân loại thành: + Chất béo- lipit + Hidratcacbon- Gluxit ( monosacarit, oligosacarit, polisacarit) + Axit amin- Protit + Tecpenoit (monotecpen, ditecpen, tritecpen…) + Steroit + Coumarin + Flavonoit + Ankaliot + Tanin + Chất kháng sinh + Vitamin… 1.2 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT Có nhiều phương pháp chiết xuất hợp chất thiên nhiên, tùy thuộc vào hợp chất cụ thể loại nguyên liệu cụ thể mà người ta chọn phương pháp thích hợp Muốn trước hết phải biết nguyên tác chiết xuất hợp chất thiên nhiên 1.2.1.NGUYÊN LIỆU Để nghiên cứu thành phần hóa học điều kiện cho phép nên dùng nguyên liệu tươi Nguyên liệu thu hái xong nên ổn định cách nhúng vào cồn hay nước đun sôi vài phút, sau để nước hay làm khơ tự nhiên khơng khí Hết sức tránh dùng nhiệt độ cao để làm khô nguyên liệu Phải sơ xử lý nguyên liệu ban đầu như: vứt bỏ nguyên liệu có sâu bệnh, Phải xác định tên khoa học cây, khơng xác định tên việc xác định khơng có ý nghĩa khoa học Do thơng thường thơng báo khoa học phải ghi địa người xác định, quan…để người đọc liên hệ tham khảo cần thiết 1.2.2 TÍNH PHÂN CỰC CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN Trong cây, hợp chất hữu tồn dạng hòa tan nước, dầu béo tinh dầu - Các hợp chất hòa tan nước (dịch tế bào) hydratcacbon có phân tử lượng thấp (monosaccarit, số oligosaccarit pectin, gôm…); glycozit, muối ankaloit axit hữu cơ; aminoaxit, muối aminoaxit; hợp chất phenol hòa tan dạng glycozit - Các hợp chất tan dầu béo tinh dầu hidrocacbon, monotecpen, sesquitecpen, sterol, carotenoit… Nói chung chất tan nước chất phân cực chất tan dầu béo tinh dầu chất phân cực Tuy nhiên tính phân cực chúng khác tùy thuộc vào khối lượng nguyên tử nhóm chức có phân tử hợp chất Thơng thường hợp chất có mạch cacbon dài phân cực, hợp chất có nguyên tử H liên kết trực tiếp với nguyên tố âm điện O, N, F, Cl…là nhóm phân cực, nhiều nhóm phân cực phân tử tính phân cực lớn 1.2.3 DUNG MƠI 1.2.3 Tính phân cực dung mơi Dung mơi dùng cho chiết xuất đa dạng thay đổi tùy theo tính chất nguyên liệu Cơ sở để lựa chọn dung môi để chiết độ phân cực hợp chất chứa nguyên liệu độ phân cực dung môi Người ta phân biệt dung môi theo độ phân cực + Dung môi phân cực mạnh: nước, ancol thấp (metanol, etanol….) + Các dung môi không phân cực: ete, êt-dầu hỏa, benzen, toluen hexan… + Các dung môi phân cực yếu vừa etyl axetat, cloroform, axeton,… 1.2.3.2 Chất tan nước dung môi phân cực + Các chất điện ly muối vô tan nước dung môi phân cực + Các hợp chất hữu nói chung khơng ion hóa, chúng có nhóm tạo liên kết hydro với nước tan nước Càng nhiều nhóm phân cực phân tử dễ tan nước, mạch cacbon dài độ hịa tan giảm Thực nghiệm cho thấy : nhóm phân cực phân tử có khả tạo thành liên kết hydro với nước làm cho phân tử chất tan nước phân tử chất có mạch cacbon khơng q khơng hợp chất có mạch nhánh Nhưng phân tử có nhiều nhóm phân cực (từ trở lên) tỉ lệ giảm xuống: nhóm phân cực cho nguyên tử cacbon mạch phân tử tan nước 1.2.3.3 Chất tan ete dung môi không phân cực Các hợp chất hữu khơng chứa nhóm phân cực gọi chất khơng phân cực Nói chung chất không phân cực tan ete dung môi không phân cực ngược lại không tan nước dung môi phân cực khác Các phân tử có nhóm phân cực phân tử tan ete Hầu hết chất hữu tan nước khơng tan ete Nếu chất vừa tan nước vừa tan ete chất phải chất khơng ion hóa, có số cacbon khơng q 5, có nhóm phân cực tạo liên kết hydro phân cực mạnh 1.2.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT Nói chung khơng thể có phương pháp chung áp dụng cho tất nguyên liệu Trong phần nêu phương pháp chiết xuất nhằm nghiên cứu sơ chưa biết rõ thành phần hóa học nguyên liệu 1.2.4.1 Phương pháp cổ điển: Dùng dãy dung môi từ không phân cực đến phân cực mạnh để chiết phân doạn chất khỏi nguyên liệu ví dụ dãy ete- dầu hỏa, ete, cloroform, cồn cuối nước Cách chiết thơng dụng chiết nóng liên tục máy soxhlet chiết hồi lưu Sau lần chiết với loại dung môi, cần làm khô nguyên liệu tiếp tục chiết với dung môi Mỗi phân đoạn chiết, thu hồi dung môi tiến hành phân tích riêng Dựa vào tính phân cực dung mơi dự đốn có mặt chất có mặt dịch chiết + Trong phân đoạn ete, ete dầu hỏa có hidrocacbon béo thơm, thành phần tinh dầu monotecpen, chất không phân cực chất béo caroten, sterol, chất màu thực vật, clorofyl + Trong dịch chiết cloroform có sesquitecpen, ditecpen, coumarin, quinon aglycon glycozit thủy phân tạo ra, số ankaloit bazo yếu + Trong dịch chiết cồn có mặt glycozit, ankaloit, flavonoit, hợp chất phenol khác, nhựa, axit hữu cơ, tanin + Trong dịch nước có có hợp chất phân cự glycozit, tanin, đường, hidratcacbon phân tử vừa pectin, protein thực vật, muối vô cơ… 1.2.4.2 Khi cần chiết lấy toàn thành phần nguyên liệu, dung mơi thích hợp cồn (metanol hay etanol) 80% nước Cồn, đặc biệt metanol xem dung mơi vạn hịa tan chất không phân cực chất phân cực khác Dịch chiết bay dung môi cao toàn phần chứa hầu hết hợp chất nguyên liệu Sau cần tách phân đoạn chất cao chuẩn bị dãy chất khơng tan nước có độ phân cực từ yếu đến mạnh ví dụ dãy ete- dầu hỏa, ete, cloroform, etyl axetat, butanol Hòa tan cao vào lượng nước, cho vào bình chiết, chiết với dung môi Dịch chiết phân đoạn sau thu hồi dung mơi đem phân tích 1.2.4.3 Cách chiết : có cách chiết chiết nóng chiết nhiệt độ thường + Chiết nhiệt độ thường : có cách ngấm kiệt ngấm phân đoạn Ngấm kiệt phương pháp tốt chiết nhiều hợp chất hơn, tốn dung môi, áp dụng phương pháp ngấm kiệt ngược dịng + Chiết nóng: Nếu dung mơi dễ bay phải dùng phương pháp chiết liên tục ( soxhlet) chiết hồi lưu Nếu chiết hồi lưu phải chiết lần 1.2.4.4 Cách thu hồi dung mơi: cách chưng cất, tốt dùng phương pháp chưng cất áp suất thấp 1.3 PHƯƠNG PHÁP TÁCH BIỆT CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN Phương pháp tách biệt phương pháp sắc ký 1.3.1 CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ 1.3.1 Khái niệm sắc ký Sắc ký phương pháp vật lý dùng để tách riêng thành phần khỏi hỗn hợp cách phân bố chúng pha: pha có bề mặt rộng gọi pha cố định pha chất lỏng hay chất khí gọi pha di động, di chuyển qua pha cố định Phân loại: Chia thành loại: sắc ký lỏng sắc ký khí • Sắc ký lỏng : sắc ký có pha động chất lỏng Trong sắc ký lỏng có kỹ thuật: + Sắc ký giấy: pha tĩnh giấy + Sắc ký lớp mỏng: pha tĩnh lớp mỏng chất hấp phụ trải thủy tinh kim loại + Sắc ký cột: Pha tĩnh chất rắn nhồi thành cột Trong sắc ký cột tùy thuộc vào chất chất rắn nhồi cột mà chia thành loại: -Cột cổ điển: cột đơn giản với chất hấp phụ vô hay hữu -Cột trao đổi ion: Cột chất trao đổi ion âm dương -Cột gel hay lọc gel: Pha tĩnh gel tổng hợp có lỗ xốp xác định để lọc chất có kích thước khác + Sắc ký lỏng cao áp: ( sắc ký lỏng hiệu cao) • Sắc ký khí sắc ký có pha động chất khí Dựa vào pha cố định người ta chia ra: + Sắc ký khí- rắn + Sắc ký khí – lỏng 1.3.1 Sắc ký giấy A Các bước tiến hành a) Chuẩn bị mẫu thử Chất thử pha lượng tối thiểu dung môi Dung môi thường dùng chất dễ bay axeton, metanol, etanol Trừ trường hợp nghiên cứu tồn diện cây, thơng thường người ta phải loại tạp trước cô đặc trước chấm Cách loại tạp thường dùng tách dung môi khác nhau, cách tủa, ly tâm, đông lạnh… b) Chấm mẫu thử: dùng ống mao quản có đường kính từ 0,5- 1mm Thơng thường nồng độ chất chấm từ 0,1-1%, lượng chất chấm từ 1-1000µg tùy thuộc vào độ nhạy để phát chúng Điều quan trọng kỹ thuật chấm vết chấm vết nhỏ tốt vết lần sắc ký phải đồng kích thước độ đậm đặc c) Giấy: Nếu dùng sắc ký giấy để phát chất dùng loại giấy mỏng, dùng tách chất dùng giấy dày Khi sử dụng cần triển khai chiều giấy Thơng thường ngồi bó giấy có có mủi tên chiều triển khai giấy d) Dung môi: Việc chọn dung mơi thích hợp yếu tố định kết thí nghiệm + Cách chọn dung môi: Thứ tự độ phân cực dung môi ( theo E Berg, 1963) Ete dầu hỏa < CCl < Xyclohexan< Cacbon disunfua < dietylete < benzen < este < Cloroform < dicloetan < ancol < nước < pyridin < axit hữu < axit vơ bazo Cũng dùng dung mơi nguyên chất hỗn hợp dung môi với tỉ lệ thích hợp Để lựa chọn hệ dung mơi ta dùng chạy thử với chiều cao 10 cm đủ + Các loại hệ dung môi - Hệ dung mơi có pha cố định nước - Hệ dung mơi có pha cố định dung mơi hữu phân cực ( ưa nước) - Hệ dung mơi có pha cố định dung môi hữu không phân cực kỵ nước e) Cách khai triển: + Triển khai xuống: Ưu điểm phương pháp tốc độ chảy tương đối ổn định nhanh nhờ tác dụng trọng lực + Triển khai lên ( triển khai ngược): Phương pháp có ưu điểm triển khai đơn giản, nhanh chóng có nhược điểm dung môi chảy độ 25 mm dung mơi chạy chậm lại, người ta thường sử dụng cách để thử tìm hệ dung mơi thích hợp thường cho chạy đến 25cm ngừng lại + Triển khai ngang + Triển khai vòng + Triển khai nhiều lần triển khai cở giấy + Sắc ký hai chiều e) Phát vết + Phương pháp hóa học: Dùng chất màu đặc trưng cho loại hợp chất Thuốc thử pha có nồng độ thích hợp cho tác dụng lên giấy Có cách: - Nhúng giấy: Áp dụng cho sắc đồ nhỏ,và thuốc thử khơng hịa tan vết - Phun : Phương pháp thường dụng + Phương pháp vật lý: Thường áp dụng với hợp chất hấp thụ tia cực tím khoảng từ 240-260 nm hình thành vết tối phát quang Trong số trường hợp phun lên giấy dung dịch Fluorescein (C20H18O2) với mục đích làm tăng độ phát quang để nhìn vết rõ Một số chất có khả phát huỳnh quang chiếu tia cực tím bước sóng khoảng 360nm B Các yếu tố ảnh hưởng đến giái trị Rf a) Trong sắc ký để biểu thị di chuyển chất người ta dùng khái niệm R f Rf = Chiều dài di chuyển chất thử Chiều dài di chuyển dung môi Giá trị Rf số đặc trưng cho di chuyển chất điều kiện, ghi giá trị Rf phải ghi đầy đủ điều kiện thí nghiệm kèm theo (loại giấy, nống độ chất thử, lượng chấm, hệ dung môi, lượng dung mơi, chiều triển khai, nhiệt độ tiến hành thí nghiệm) b) Để làm tăng độ lặp lại sức ký giấy phải lưu ý + Giữ nhiệt độ không đổi khoảng nhiệt độ cho phép ± 50C + Trộn dung môi giử nhiệt độ thí nghiệm 1-2 ngày + Kiểm tra lại dung môi cách chạy thử với chất chuẩn đối chiếu + Giấy chấm chất thử đưa vào trước 24 để tạo cân giấy khí bình + Đậy bình kín suốt trình triển khai + Đường di chuyển dung môi phải từ 30-35 cm triển khai xuôi 25 cm cho triển khai ngược + Dùng loại giấy, tiến hành điều kiện C Hiện tượng vết dị thường a Vết lan rộng ( Không tập trung): Để khắc phục cần phải - Chấm vết nhỏ, trịn - Thuốc màu khơng q đặc, pha vừa đủ để màu - Chọn hệ dung mơi thích hợp tốc độ chạy hệ dung mơi Ngồi hình dạng kích thước lỗ xố giấy không đề vết lan rộng b Vết có Vết có + Lượng chất chấm nhiều + Dung môi chảy nhanh + Sự biến dổi không thuận nghịch thừ từ thành phần chất tan trình di chuyển + Sự hấp phụ mạnh bề mặt chất hấp phụ c Hiện tượng hai đuôi Hiện tượng thường xãy chất màu dịch chiết, chất màu khơng có khả hấp phụ mạnh chất khơng có màu có mặt dịch chiết nên chất khơng màu chiếm vị trí cịn chất màu di chuyển rìa chấm Vì triển khai có hai vết chạy nhanh bên nên vế có d Ngồi cịn có tượng: vết bè hai bên , lan rộng bên, vết méo, vết không di chuyển, vết chất tạo nhiều vết 1.3.1.3 SẮC KÝ LỚP MỎNG (SKLM) A Nguyên lý: Là phương pháp phân tích dung dịch chất phân tích di chuyển lớp mỏng chất hấp phụ mịn vô hay hữu theo chiều định Trong trình di chuyển, chất chuyển dịch với tốc độ khác tùy thuộc vào chất chúng dừng lại vị trí khác B Chất hấp phụ Thường dùng oxit khơng tan, oxit hidrat hóa muối Lực hấp phụ chất hấp phụ theo trật tự tăng dần ( theo Strain) 1, Sacaroz 2, Magie xitrat 3, Tale ( đá tan, hoạt thạch) 4, Silicagel 5, Natri cacbonat 6, Canxi cacbonat 7, Magie cacbonat 8, Magie oxit \9, Axit silixic hoạt hóa 10, Nhơm oxit hoạt hóa 11, Than động vật hoạt hóa Trong phân tích nguyên liệu, chất dùng thông dụng silicagel oxit nhôm C Hoạt Hoạt chất hấp phụ phụ thuộc nhiều vào hàm lượng nước nước hấp phụ chiếm vị trí hoạt động bề mặt làm giảm khả hấp phụ chất hấp phụ, Vì điều chỉnh khả hấp phụ cách thêm nước Tuy nhiên thực tế triển khai thông thường ta phải sấy khô để khả hấp phụ chất hấp phụ tăng lên hấp phụ ổn định D Chất hấp phụ thông dụng a Silicagel: Dùng mỏng loại bột mịn, vơ định hình có đường kính cở hạt từ 10- 40 µm, dùng sắc ký cột thơng thường đường kính cở hạt 63-200 µm (63-200 mesh) 10 glyxin H2N-CH2-COOH Gly CH3-CH-COOH (+) alanin Ala NH2 HO- CH2-CH-COOH (-)serin Ser NH2 HS- CH2-CH-COOH cystein Cys NH2 CH3-CHOH CH-COOH (-) threonin* Thr (CH3)2CH- CH-COOH valin* Val NH2 (CH3)2CH-CH2- CH-COOH leuxin* NH2 NH2 CH3-CH2-CH(CH3)- CH-COOH Leu isoleuxin* Ile (+) axit glutamic Glu NH2 HOOC- CH2-CH-COOH NH2 H2N-CH2CH2CH2CH2CH-COOH (+)lysin* Lys NH2 Công thức cấu tạo Tên thường (-) prolin COOH Chữ viết tắt Pro N H NH CH2 - CH2 CH-COOH NH2 CH-COOH NH2 CH2 HON N H CH-COOH NH2 CH2 CH-COOH NH2 (-)triptophan* Trp (-) phenylalanin* Phe (-) tyrosin Tyr (-) histidin* His 9.2.1.2 ĐIỀU CHẾ 103 a) Điều chế α-amino axit + Từ axit α-monohalocacboxylic Cho axit α-monohalocacboxylic tác dụng với amoniac Ví dụ : R CH NH3 COOH R CH COOH NH2 Br + Tổng hợp Strecker Cộng HCN NH3 vào andehyt cho α-aminonitrin Thuỷ phân có xt axit cho αamino axit.Ví dụ : CH3 CHO +HCN +NH3 CH3 CH CN H3O CH3 CH COOH NH2 NH2 + Tổng hợp Gabriel Cho phtalimit tác dụng với α-haloeste để tạo sản phẩm trung gian phtalimidoaxetatetyl Thuỷ phân hợp chất cho glyxin axit phtalic b) Điều chế β-amino axit ( xem tài liệu) + Từ axit không no CH2=CH-COOH + NH3 → NH2 - CH2-CH2-COOH + Từ andehyt axit malonic ( Phương pháp Rodionov) Cho andehit tác dụng với axit malonic có mặt amoniac rượu CH3CHO + HOOC-CH2-COOH + NH3 → CH3CH(NH2)-CH2-COOH + CO2+ H2O 9.2.1.3 TÍNH CHẤT VẬT LÝ Các aminoaxit chất rắn kết tinh khơng bay Khi đun nóng mạnh nóng chảy đồng thời bị phân hủy Có tính chất phân tử có nhóm COOH NH2 nên chúng tồn chủ yếu dạng ion lưỡng cực NH3+-R-COO104 Trừ Glyxin khơng có cacbon bất đối, cịn aminoaxit khác có tính quang hoạt aminoaxit tham gia cấu tạo protit tự nhiên có cấu hình L (nhóm NH2 gần nhóm COOH phía trái cơng thức Fischer) COOH COOH H2N H H NH2 CH3 CH3 D(-)-Alanin L(+)-Alanin 9.2.1.4 TÍNH CHẤT HĨA HỌC a) Tính axit- bazơ Điểm đẳng điện aminoaxit Axit amin hợp chất lưỡng tính Có thể tạo muối với axit bazơ vô cơ, axit amin viết dạng, tuỳ theo pH môi trường mà tồn dạng Ví dụ : NH2 NH3 CH2 COOH Acid liê n hợp H NH3 CH2 COOH CH2 COO Ion lưỡ ng cực OH NH2 CH2 COO Baz liê n hợp Điểm đẳng điện: giá trị pH mơi trường mà phân tử aminoaxit tổng số điện tích dương điện tích âm , nghĩa phân tử trung hòa điện, tức tổng điện tích phân tử o Như điểm đẳng điện phân tử tồn dạng ion lưỡng cực ( chủ yếu) phân tử trung hòa (rất it) Điểm đẳng điện thường ký hiệu pI Tại điểm đẳng điện, dung dịch có đặt dịng điện chiều phân tử aminoaxit khơng di chuyển phía điện cực Điểm đẳng điện aminoaxit có số nhóm amino số nhóm cacboxyl nằm khoảng 6,0-6,3 Điểm đẳng điện aminoaxit có số nhóm amino lớn cacboxyl nằm khoảng 7,6-10,8 105 Điểm đẳng điện aminoaxit có số nhóm amino nhỏ cacboxyl nằm khoảng 2,8-3,3 Có thể tính điểm đẳng điện aminoaxit biết pKa aminoaxit Đối với hợp chất có nhóm NH2 nhóm COOH pI= (pK1 + pK2)/2 Ví dụ: Glyxin H2N-CH2-COOH ; pK1= 2,35; pK2= 9,78; pI= (2,35+9,78)/2 = 6,06 b) Phản ứng nhóm –COOH Aminoaxit có tính chất nhóm cacboxyl tạo dẫn xuất axit + Tạo ester + Tạo clorua axit NH2 CH COOH PCl5 NH2 CH COCl R R + Decacboxyl hóa ( tách CO2) NH2 CH COOH Ba(OH)2 NH2 CH2 R R c) Phản ứng nhóm amino Nhóm amino aminoait cho phản ứng nhóm amin thơng thường + Phản ứng ankyl hố NH2 CH COOH R CH3I H3C NH CH COOH R + Axyl hóa: Tạo Amit Tác dụng với axit nitro Tạo hidroxy axit giải phóng nito Ví dụ : NH2 CH COOH R HONO HO CH COOH + N R 106 d) Phản ứng chung nhóm cacboxyl nhóm amino.Nhiều phản ứng có tham gia đồng thời hai nhóm chức amino cacboxyl Ví dụ + Tách nước Ví dụ :đối với α- aminoaxit tác dụng nhiệt , hai phân tử tác dụng với nhau, tách nước tạo hợp chất vòng đixetopiperazin O C COOH H2N CH R R CH + NH2 HOOC NH R CH NH C CH R O + Tạo phức với số kim loại nặng Nhóm cacboxyl amino aminoaxit, có khả tạo phức với cation kim loại chuyển tiếp Ví dụ : d) Các phản ứng màu aminoaxit + Phản ứng với ninhydrin Aminoaxit cho phản ứng màu với ninhydrin, xanh đến tím , phản ứng dùng để phát aminoaxit phép sắc ký giấy, sắc ký mỏng… + Phản ứng xantoproteic 107 + Phản ứng milon, tạo sunfua chì…xem tài liệu 9.2.1.5 PHÂN TÍCH AMINO AXIT Để phân tích amino axit dùng sắc ký giấy sắc ký lớp mỏng -Chiết: Để chiết lấy amino axit tự từ hạt: nghiền hạt với nước nóng, sau cho cồn 750 vào ngâm 12 Ép, lọc ly tâm Bốc cồn Dung dịch cô đặc dùng để chạy sắc ký giấy lớp mỏng -Sắc ký giấy: chạy chiều, chiều chạy 45-50cm Dung môi: Chiều 1: butanol- axit axetic-nước (BAW) (4:1:1) Chiều 2: Phenol- nước ( 3:1) -Sắc ký lớp mỏng: Với hỗn hợp nhiều axit amin nên chạy sắc ký chiều với hệ dung môi sắc ký giấy Thuốc thử màu dung dịch ninhiđrin 0,1% axeton, hơ nóng kính 1050C 10 phút Nếu dùng thuốc thử dung dịch axetat cadimi 1%, nước + 2ml axit axetic + 100ml axeto-hòa tan vào 0,1 gam ninhidrin khơng cần hơ nóng vết axit amin màu Bảng : Rf màu số amino axit kính silícagel G với hệ dung mơi (B:A:W) Phenol: nước Aminoaxit Glyxin BAW Rf x 100 Phenol: nước 18 24 Màu với ninhidrin Tím đỏ Alanin 22 29 Tím Serin 18 20 ” Cystein 10 ” Threonin 20 26 ” 108 Valin 32 40 ” Leuxin 44 48 ” Isoleuxxin 43 49 ” Methionin 35 44 ” Axit aspartic 17 Tìm xanh Axit glutamic 24 10 Tìm Aspagin 14 - Vàng nâu Glutamin 15 - Tím Arginin 19 ” Lysin ” Prolin 14 50 Vàng Phenylalanin 43 55 Nâu tím Tyrosin 41 47 ’’ Triptophan 47 63 ’’ Hệ dung môi :butanol- axit axetic-nước (BAW) (4:1:1) : Phenol- nước ( 3:1) 9.2.1.5 ĐỊNH LƯỢNG AMINO AXIT Trước người ta thường định lượng cách sau: Có thể định lượng cách phối hợp sắc ký giấy lớp mỏng với đo mật độ quang Dịch chiết với lượng xác định tách sắc ký giấy lớp mỏng Hiện vết dung dịch ninhidrin Cắt vết riêng chiết với cồn 50 Các dịch chiết tạo màu với ninhidrin đo độ hấp thụ quang phổ kế Các kết đo so sánh với đường cong chuẩn lập sẵn với amino axit chuẩn Có thể dùng phương pháp chuyển thành dẫn xuất đinitrophenyl cách cho dịch chiết có chứa aminoaxit với dung dịch 2,4-đinitroflorobenzen nước axeton Đem dẫn xuất tách sắc ký lớp mỏng ( giấy) sau tiến hành định lượng Nhưng cách sản phẩm đinitrophenyl có màu vàng nên khơng cần phải chất màu ninhidrin 109 NO2 O2N F NO2 COOH O2N + H2N-CH-R COOH HN-CH-R ( mau vang) Phân tích phương pháp sắc ký điện di Trong dung dịch nước, aminoaxit tồn dạng: anion, cation ion lưỡng cực R-CH-COOH NH3 (a) -H+ + +H -H+ R-CH-COO NH3 (b) +H+ R-CH-COO NH2 (c) Tùy theo pH môi trường mà dạng chiếm ưu Do đặc điểm phân tích amino axit sắc ký điện di Trong dung dịch đệm môi trường axit, tác dụng điện trường phân tử amino axit dạng cation chuyển cực âm ngược lại phân tích mơi trường kiềm aminoaxit trở thành anion chuyển cực dương Vì amino axit có điểm đẳng điện khác q trình phân tích có thay đổi có kiểm sốt pH dung dịch điện ly tách chúng khỏi chất có đương lượng điện tích khác di chuyển với mức độ khác 9.2.2 PEPTIT Peptit polime aminoaxit chứa từ đến khoảng 50 gốc aminoaxit phân tử Peptit có thể động thực vật, số nấm người điều chế 9.2.2.1 CẤU TRÚC VÀ DANH PHÁP a) Cấu trúc: gồm nhiều gốc aminoaxit kết hợp nhờ liên kết peptit Nhóm peptit –CO-NH- có cấu trúc phẳng, nguyên tử H nhóm NH nằm vị trí anti nguyên tử O nhóm cacbonyl liên kết N-C mang phần đặc điểm liên kết đôi C=N liên hợp cặp e tự N phía nhón cacbonyl 110 Do liên kết peptit khó quay tự xung quanh trục khả quay tự liên kết Cα - CO- lớn Đó nguyên nhân cấu trúc xoắn phân tử protein Các peptit thiên nhiên cấu tạo từ α-aminoaxit, phân tử có ,3,…n gốc aminoaxit gọi đipeptit, tripeptit….polipeptit Trong phân tử peptit, đầu mạch chứa gốc NH2( NH3+) gọi “đầu N”, đầu chứa nhóm COOH (hoặc COO-) gọi “đi C” Khi viết công thức cấu tạo peptit “đầu N” quy ước viết phía bên trái cơng thức phân tử cịn “đi C” quy ước viết bên phải công thức H3N - CH - C - NH - CH - C- NH -CH - COO R1 O R3 R2 O aminoaxit dau N aminoaxit duoi C b) Cách gọi tên: Gọi tên cách ghép tên gốc axyl aminoaxit tạo nên từ phân tử peptit theo trình tự xếp chúng từ đầu N sang phía C, riêng aminoaxit C giử nguyên tên: Ví dụ H3N - CH - C - NH - CH - C- NH -CH2 - COO alanylphenylalanylglyxin CH3 O CH2 O C6H5 (Ala-Phe-Gly) 9.2.2.2 TÍNH CHẤT VẬT LÝ Các peptit có khối lượng phân tử nhỏ chất kết tinh tan tốt nước , Cac peptit có phân tử khối lớn chất rắn khơng định hình, tạo dung dịch keo với nước 9.2.2.3 TÍNH CHẤT HĨA HỌC 111 a) Tính axit- bazo: có tính lưỡng tính tương tự amino axit b) Phản ứng thủy phân: - Thủy phân hoàn toàn: axit nóng kiềm nóng cho sản phẩm cuối aminoaxit muối Thường thủy phân khoảng 24-72 nhiệt độ 1100C, xúc tác HCl 2N -Thủy phân khơng hồn tồn: tạo peptit nhỏ nhờ enzim đặc hiệu c-Phản ứng với 2,4-đinitrofluorobenzen: tương tự aminoaxit , đầu N phản ứng tạo thành dẫn xuất 2,4-dinitrophenyl màu vàng d-Phản ứng màu biure:các peptit có từ nhóm peptit trở lên phản ứng với dung dịch CuSO4 loãng kiềm cho phản ứng tạo thành dung dịch hợp chất phức có màu tím màu tím đỏ 9.2.2.4 TỔNG HỢP PEPTIT Để tổng hợp peptit theo trật tự xác định phản ứng trùng ngưng amino axit, cần phải “bảo vệ” nhóm amino hay cacboxyl không cần chúng tham gia phản ứng tạo liên kết peptit Các bước tổng hợp sau: a) Bảo vệ nhóm amino: Thường dùng nhóm benzyloxicacbonyl C6H5-CH2-OCO- ( cịn gọi nhóm cacbobenzoxi- viết tắt Cbz) cách cho aminoaxit tác dụng với benzylclorofomiat C6H5-CH2-O-CO-Cl mơi trường kiềm Thí dụ: b)Bảo vệ nhóm amino: chuyển thành dẫn xuất benzyl hay metyl etyleste 112 H2N-CH-COOH CH3 +PCl5 -POCl3-HCl H2N-CH-COOCl CH3 C6H5-CH2-OH -HCl NH2-CH2COO-CH2C6H5 benzyleste cua alanin c) Ngưng tụ dẫn xuất aminoaxit: trình nhờ có chất xúc tác DDC (dixiclohexyl cacbođiimit- C6H11-N=C=N-C6H11) Thí dụ CH3 C6H5-CH2-O-CO-NH-CH2COOH benzyloxicacbonyl glyxin + NH2-CHCOO-CH2C6H5 benzyleste cua alanin CH3 DDC -H2O C6H5-CH2-O-CO-NH-CH2CO- NH-CH COO-CH2C6H5 Cbz-Gly-Ala-CH2-C6H5 113 d) Hydro phân dẫn xuất peptit: 9.2.2.5 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC PEPTIT a) Xác định thành phần amino axit phân tử peptit Để xác định aminoaxit cấu trúc peptit, người ta thủy phân hoàn toàn peptit thành aminoaxit (thường thủy phân HCL 6N 110 0C 24-72 giờ), sau nhận biết aminoaxit phương pháp sắc ký Ngày phép phân tích tự động xá định chúng khoảng b) Xác định trật tự xếp amino axit phân tử peptit Về nguyên tác phải qua bước sau: - Xác định aminoaxit đầu N: có phương pháp chính: + Phương pháp Sanger: cho peptit tác dụng với 2,4-đinitrroflurobenzen, tạo thành dẫn xuất 2,4-dinitrophenyl peptit Thủy phân dẫn xuất dung dịch axit thu dẫn xuất 2,4-đinitrophenyl aminoaxit đầu N aminoaxit Nhận biết dẫn xuất 2,4-đinitrophenyl aminoaxit đầu N phương pháp sắc ký + Phương pháp Edman: ( xem tài liệu) - Xác định aminoaxit đuối C Thủy phân peptit nhờ enzim cacboxipeptiđaza, aminoaxit xuất dung dịch ( nhận biết phương pháp sắc ký aminoaxit đuôi C - Thủy phân phần mạch peptit (nhờ enzim cắt liên kết peptit vị trí xác định) 9.2.3 PROTEIN Protein polime thiên nhiên cấu tạo chuổi polipeptit Protein có thể sống (động, thực vật), enzim 114 9.2.3.1 PHÂN LOẠI VÀ CẤU TRÚC a) Phân loại a1) Dựa vào thành phần hóa học: chia thành nhóm: - Protein đơn giản: thủy phân hoàn toàn cho hỗn hợp aminoaxit -Protein phức tạp: thủy phân hoàn toàn, sản phẩm aminoaxit cịn có hợp chất khác khơng chứa aminoaxit gọi nhóm prrothetic ( nhóm ghép) Dựa vào thành phần phi protein mà người ta chia thành nhóm nhỏ a2) Dựa vào hình dạng phân tử: chia thành nhóm: -Protein hình cầu: phân tử có dạng hình cầu , tan nước( anbumin, globulin - protein hình sợi: Phân tử có dạng hình sợi, khơng tan nước Ví dun keratin tóc, fibroin tơ tằm b) Cấu trúc -Cấu trúc cấp (bậc 1): trật tự xếp gốc aminoaxit phân tử Cấu trúc tồn nhờ liên kết peptit -Cấu trúc bậc 2: cấu dạng protein: Phân tử tồn hai dạng chủ yếu dạng xoắn α ( gọi α-keratin) cấu dạng gấp khúc β ( gọi dạng β-keratin) Các cấu dạng trì nhờ liên kết hydro N-H -O=C< nhóm peptit với -Cấu trúc bậc 3: hình dạng mạch polipeptit cuộn lại khơng gian chiều, nhóm kị nước nằm phía cịn nhóm ưa nước nằm bề mặt phân tử Cấu trúc bậc trì nhờ tương tác Van der Vall, tương tác tác tĩnh điện, liêen kết sufua –S-S-, nhóm este -Cấu trúc bậc 4: tổ hợp nhiều đại phân tử polipeptit kết hợp với nhờ lực hút Van der Vall liên kết H nhóm nguyên tử phân bố bề mặt đại phân tử protein 9.2.3.2 TÍNH CHẤT a) Tính lưỡng tính: có tính lưỡng tính, điểm đẳng điện tương tự aminoaxit peptit 115 b) Tính tan: Tính tan chúng phụ thuộc nhiều vào cấu tạo phân tử, chất dung môi, pH dung dịch, nhiệt độ Các protein hình sợi ( long, tóc, sừng ) khơng tan, cịn cấu trúc hình cầu ( anbumin ) tan nước dung dịch muối lỗng trung tính tạo dung dịch keo Ở điểm đẳng điện độ tan thấp c) Sự kết tủa biến tính: Khi thay đổi yếu tố nồng độ, nhiệt độ dung dịch keo protein bị kết tủa Có hai loại kết tủa: -Kết tủa thuận nghịch: sau protein bị kết tủa, ta loại bỏ nguyên nhân tạo tủa mà tủa tan trở lại tạo dung dịch keo, gọi kết tủa thuận nghịch Ví dụ ta cho thêm muối (NH 4)2SO4 vào dung dịch lòng trắng trứng có kết tủa, loại muối pha lỗng kết tủa lại tan - Kết tủa khơng thuận nghich: Tủa tạo thành tan trở lại thành dung dịch keo Thông thường tác dụng axit mạnh, muối kim loại nặng, nhiệt độ kết tủa protein khơng thuận nghịch -Sự biến tính:Trong trường hợp kết tủa khơng thuận nghịch, tính chất protein khác nhiều so với chất ban đầu nên gọi biến tính protein d) Phản ứng thủy phân: Khi đun nóng dung dịch protein nhờ xúc tác axit, bazơ, nhờ men, phân tử protein bị thủy phân tạo thành sản phẩm cuối L-α-aminoaxit e) Một số phản ứng định tính định lượng protein: -Phản ứng định tính: + Phản ứng biure: phản ứng với Cu(OH)2 kiềm cho phức màu xanh tím + Phản ứng xangtoproteic: phản ứng với HNO3 đặc cho kết tủa màu vàng -Phản ứng định lượng: (Phản ứng với thuốc thử Folin-Xiocanto) Đầu tiên thực phản ứng biure, sau cho thêm thuốc thử Folin-Xiocanto ( hỗn hợp axit photphomolipdic axit photphovonphramic) để tạo hợp chất phức màu xanh da trời có bước sóng hấp thụ cực đại 750nm Dựa vào cường độ màu dung dịch để tính hàm lượng protein 116 TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu: Phương pháp nghiên cứu hóa học cấy thuốc (1985) Nhà xuất Y học Lê Văn Đăng Chuyên đề số hợp chất thiên nhiên (2005), Nhà xuất Đại học Quốc gia TP HCM Đỗ Tất Lợi Những thuốc vị thuốc Việt Nam (2000), Nhà xuất Y học Nguyễn Năng Vinh Kỹ thuật khai thác sơ chế tinh dầu (1977) Nhà xuất Nơng nghiệp John D.Roberts and C.Caserio Hóa học hữu đại Tập (1984)Nguyễn Đức Chung dịch, Nhà xuất KH& KT Hà Nội Raphael Ikan Natural products A Laboratory guide Second edition Academic press, INC (1991) 117