bài giảng thí nghiệm công nghệ hợp chất thiên nhiên

Nếu những chất đại phân tử có trọng lượng phân tử lớn, tính chất hóa học tương đối đồng nhất, người ta có thể đề xuất được một số qui trình tổng quát để chiết tách cô lập chúng thì các h

THÍ NGHIỆM CHUYÊN ĐỀ CÔNG NGHỆ TÁCH CHIẾT HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN

GV: ThS Hoàng Minh Hảo

KS Nguyễn Bình Kha

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB ĐH Quốc Gia

TP HCM

[2] Nguyễn Khác Quỳnh Cứ (1999), Bài giảng chiết xuất dược liệu Bộ môn dược liệu

ĐH Y-Dược TP Hồ Chí Minh, 45-97

BÀI 1: MỞ ĐẦU

Hợp chất thiên nhiên (natural product), phân tử sinh học tự nhiên (biological molecule)

là chất biến dưỡng thứ cấp được tạo ra bởi cơ thể của một sinh vật, chất biến dưỡng thứ cấp có thể cần thiết hoặc nhiều khi không cần thiết cho cơ thể sinh vật

Các chất biến dưỡng thứ cấp của thực vật thường thuộc các nhóm sau: alcaloid, quinonoid, steroid, terpenoid, iridoid, flavonoid, glycosid…

Nếu những chất đại phân tử có trọng lượng phân tử lớn, tính chất hóa học tương đối đồng nhất, người ta có thể đề xuất được một số qui trình tổng quát để chiết tách cô lập chúng thì các hợp chất thiên nhiên có trọng lượng phân tử nhỏ, tính chất hóa học đa dạng, khác biệt nên không có qui trình tổng quát nào có thể áp dụng chung cho tất cả các nhóm, mà mỗi loại nhóm phải có một số phương pháp khác nhau

Mục đích của việc tách chiết, cô lập hợp chất tự nhiên

Khảo sát thành phần hóa học của một cây mới, trước đó chưa ai nghiên cứu và xem những chất này có hoạt tính sinh học gì? Muốn biết được điều này cần phải cô lập hợp chất đạt độ tinh khiết >95% mới có thể khảo sát cấu trúc hóa học bằng phương pháp quang phổ hiện đại

Cần có thêm lượng mẫu một hợp chất đã biết cấu trúc hóa học, muốn khảo sát thêm về hoạt tính sinh học của chất đó Nếu việc thử nghiệm cho kết quả hấp dẫn thì sẽ xem xét

có thể tổng hợp hóa học hợp chất đó để có số lượng nhiều hơn

Tìm hiểu một hợp chất đã biết và xem chất này được sản sinh ra từ bộ phận nào của sinh vật (sự sinh tổng hợp)

Tìm hiểu sự khác biệt của những chất biến dưỡng thứ cấp được sản sinh ra từ cùng một nguồn tự nhiên nhưng không cùng điều kiện sinh thái: thí dụ tìm hiểu xem hai thực vật cùng họ (family), cùng chi (genus), cùng loài (species) nhưng mọc ở hai nơi có diều kiện khí hậu, đất đai thổ nhưỡng khác nhau có chứa cùng những hợp chất tự nhiên và những chất này có cùng hàm lượng hay không?

 Có nhiều phương pháp để tách chiết, cô lập hợp chất tự nhiên từ cây cỏ: Sắc ký cột, sắc

ký lớp mỏng, sắc ký gel, sắc ký khí, sắc ký lỏng hiệu năng cao

 Trong hướng hợp chất thiên nhiên, việc cô lập chất phức tạp hơn vì không biết được cây đang khảo sát có chứa các hợp chất với cấu trúc hóa học như thế nào Biết rằng cây

cỏ cần khảo sát có chứa nhiều loại hợp chất hữu cơ, từ loại không phân cực đến loại rất phân cực, vì thế nếu muốn cô lập hợp chất mà áp dụng sắc ký cột trực tiếp ngay trên cao thô ban đầu sẽ rất khó đạt được kết quả mong muốn Vì vậy, người ta thường chuẩn

bị một loạt các cao chiết có tính phân cực tăng dần, như thế mỗi loại cao chiết chứa tương đối ít hợp chất, giúp cho quá trình cô lập hợp chất tinh chất dễ dàng

 Muốn có các loại cao có độ phân cực khác nhau, sử dụng các dung môi chiết có độ phân cực khác nhau, dựa trên nguyên tắc chung là “các chất giống nhau sẽ hòa tan

nhau”: dung môi không phân cực hòa tan tốt các hợp chất không phân cực, dung môi có tính phân cực trung bình sẽ hòa tan các hợp chất có tính phân cực trung bình và dung môi phân cực mạnh sẽ hòa tan tốt các hợp chất phân cực

BÀI 2: SẮC LÝ LỚP MỎNG VÀ ĐỊNH TÍNH SỰ HIỆN DIỆN CỦA

MỘT SỐ NHÓM HỮU CƠ

I Mục đích

Trang bị những kỹ năng, thao tác khi khảo sát các hợp chất từ cây cỏ bằng kỹ thuật sắc

ký lớp mỏng

Sinh viên có thể định tính sự hiện diện của một số nhóm hợp chất hữu cơ bằng phương pháp vật lý và hóa học

II Cơ sở lý thuyết

Sắc ký lớp mỏng (SKLM) (Thin Layer Chromatography (TLC)) còn gọi là sắc ký phẳng

(planar chromatography), dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu, trong đó pha động là một dung môi hay một hỗn hợp dung môi, di chuyển qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ Thí dụ: silica gel hay oxit alumin Pha tĩnh này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic Do chất hấp thu được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này gọi là sắc ký lớp mỏng

 Bình sắc ký: Một chậu, hũ, lọ…bằng thủy tinh, có nắp đậy

 Pha tĩnh: Một lớp mỏng khoảng 0,25 mm của một loại chất hấp thu thí dụ như silica gel, alumin…

 Mẫu phân tích: Mẫu chất cần phân tích thường là hỗn hợp gồm nhiều hợp chất với độ phân cực khác nhau

 Pha động: Dung môi hoặc hỗn hợp hai dung môi, di chuyển chầm chậm dọc theo tấm lớp mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó

III Cách tiến hành

1 Các bước chuẩn bị trước khi SKLM

Dụng cụ

 Ống vi quản

 Đèn cồn

 Kẹp

 Lọ thủy tinh

 Giấy thấm

 Aceton

Cách tiến hành

Dùng 2 tay cầm 2 đầu ống vi quản, hơ nóng đoạn giữa của vi quản đến khi mềm dẻo Đem vi quản tránh khỏi ngọn lửa rồi kéo từ từ hai đầu ống ra xa Giữ yên cho đến khi thủy tinh đặc cứng lại

Tiến hành rửa vi quản đã kéo bằng cách chấm vào lọ thủy tinh có chứa aceton, lấy vi quản

ra và chấm vào giấy thấm để rút bỏ aceton Làm lại vài lần để vi quản được sạch

1.2 Chấm mẫu lên tấm bản mỏng

1.2.1 SKLM bản nhỏ

Dụng cụ:

 Tấm bản mỏng thương mại 20x20cm

 Kéo cắt

 Thước

 Bút chì

 Vi quản đã kéo

 Mẫu đã chấm bản mỏng

 Máy sấy

Hóa chất: eter dầu hỏa, cloroform, etyl acetat, metanol, aceton, nước cất

Cách tiến hành

Mẫu là chất lỏng, lấy mẫu và chấm trực tiếp trên bản mỏng Mẫu là chất rắn thì phải hòa tan mẫu trong dung môi hữu cơ phù hợp, nồng độ 2-5%, dung môi hòa tan mẫu không nhất thiết là dung môi giải ly

Cắt tấm bản mỏng nhỏ (5x2cm), dùng viết chì kẻ một đường thẳng phía dưới bảng cao 1cm làm mức xuất phát Một đường thẳng phía trên bản mỏng cao 0.5cm làm tiền tuyến dung môi

Chấm vi quản nhúng vào dung dịch mẫu, chạm nhẹ đầu vi quản vào tấm bản mỏng tại vạch xuất phát Nhanh chóng nhấc vi quản rời khỏi tấm bản mỏng để vết chấm chỉ lan rộng ra thành vết tròn có đường kính 2-5mm

Sau khi chấm xong, sấy nhẹ để dung môi bay ra khỏi vết chấm rồi nhúng vào dung dịch giải ly

Nếu cần khảo sát một lượt nhiều mẫu khác nhau, chuẩn bị và chấm mỗi mẫu một vết trên bản mỏng Vết này cách vết kia 1cm Hai vết ở ngoài bìa phải cách bờ cạnh 1,5cm

1.2.2 Sắc ký lớp mỏng điều chế (20x20cm)

Với SKLM điều chế, dung dịch mẫu chất sẽ được chấm lên thành một đường dài, đều, dọc theo vạch xuất phát bằng cách dùng vi quản kéo một đường dài dọc theo vạch xuất phát

1.3 Giải ly bản mỏng

1.3.1 Chuẩn bị bình giải ly bản mỏng

Dụng cụ

 Bình giải ly (bình phải có nắp đậy)

 Giấy lọc (cắt sao cho bỏ vừa vào bình giải ly)

 Ống đong 10ml, 100ml

 Đũa thủy tinh

Hóa chất: Eter dầu hỏa, cloroform, etyl acetat, metanol, aceton, nước cất

1.3.2 Giải ly bản mỏng

Cách tiến hành

Pha dung môi (hệ dung môi) phù hợp cho vào bình giải ly có đặt sẵn một tấm giấy thấm (giấy lọc), nghiêng đảo nhẹ để dung môi thấm ướt tờ giấy lọc (làm cho dung môi trong bình được bão hòa)

Đặt tấm bản mỏng vào bình giải ly, cạnh đáy của bản mỏng chạm vào đáy của bình và ngập vào dung môi Các vết chấm mẫu không được ngập vào dung môi

Khi dung môi đến mức tiền tuyến (vạch phía trên) bản mỏng thì ngưng quá trình giải ly Lấy bản mỏng ra, sấy khô dung môi Tiến hành hiện hình mẫu thử bằng các thuốc thử đặc trưng

2 Hiện hình các vết sau khi giải ly

Sau khi giải ly xong, các hợp chất có màu sẽ được nhìn bằng mắt thường, nhưng phần lớn các chất hữu cơ không có màu nên muốn nhìn thấy các vết cần sử dụng các phương pháp hóa học hoặc vật lý

2.1 Phương pháp vật lý

Phát hiện bằng tia tử ngoại (UV)

Dụng cụ:

 Đèn chiếu UV

 Viết chì

Cách tiến hành: Bản mỏng sau khi giải ly xong, sấy khô, đặt bản mỏng vào đèn UV, quan sát

màu, nếu quan tâm thì dung viết chì khoanh lại

2.2 Phương pháp hóa học:

Phát hiện bằng các thuốc thử đặc trưng

Dụng cụ:

 Kẹp

 Máy sấy

 Cuộn băng keo

 Kéo

Hóa chất

 I2

 Dd FeCl3

 Dd H2SO4 50%

Thuốc thử Màu của vết Hợp chất

Hơi I2

H2SO4 đđ

H2SO4 đđ

H2SO4 đđ

FeCl3

H2SO4 đđ

Vàng hoặc nâu Vàng đậm đến da cam Màu đỏ hoặc xanh dương –đỏ Màu cam đến đỏ

Xanh lục đến xanh đen

Màu tím

Hợp chất hữu cơ nói chung Flavon, Flavonol

Chalcon, auron Flavonoid Sesquiterpen Triterpen

bản mỏng trong bình chứa I2 Nếu hiện hình bằng dung dịch FeCl3, hay H2SO4 thì nhúng tấm bản mỏng vào lọ chứa dung dịch đó, lấy ra và lắc nhẹ cho thuốc thử chảy xuống hết Tiến hành nướng bản mỏng bằng máy sấy hay bếp điện, các vết màu sẽ hiện lên, dùng băng keo dán tấm bản mỏng lại để tấm bản mỏng không bị vỡ để tiện cho quan sát lần sau Trên tấm bản mỏng phải ghi rõ dung môi hoặc hệ dung môi giải ly

Màu đỏ sậm (λmax: 545nm) Màu xanh dương đen (λmax: 595nm)

BÀI 3: CHIẾT XUẤT TINH DẦU

I Mục đích:

Giúp sinh viên nắm được phương pháp tách chiết tinh dầu bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước

II Cơ sở lý thuyết

Muốn khảo sát tinh dầu trong cây nên tiến hành việc lôi cuốn hơi nước trên mẫu cây tươi,

để tránh thất thoát tinh dầu vì tinh dầu có tính bay hơi cao

Nước khi bị đun nóng sẽ bốc thành hơi bay lên, hơi nước bay lên mang theo tinh dầu

Dụng cụ, hóa chất và cách tiến hành

Dụng cụ

 Bình cầu, erlen

 Bếp đun, ống ngưng hơi

 Các ống nối bằng thủy tinh

Hóa chất

 Nước

 Vỏ bưởi, vỏ chanh

Cách tiến hành

Mẫu được cắt nhuyễn, được đặt vào bình cầu, cho nước cất vào bình sao cho phần thể tích của cả mẫu và nước chỉ chiếm tối đa hai phần ba thể tích bình cầu Lắp hệ thống và cắm bếp điện đun nóng

Nước trong bình cầu khi bị đun nóng sẽ bốc thành hơi bay lên, hơi nước bay lên mang tinh dầu, hơi này bị ống ngưng hơi làm lạnh, ngưng tụ trở thành thể lỏng, rơi xuống ống gạn Trong ống gạn, dung dịch tách thành hai lớp gồm lớp nước và lớp tinh dầu Tùy theo tinh dầu nhẹ hơn nước hay nhẹ hơn nước, khi ráp hệ thống sẽ lựa chọn ống gạn cho phù hợp Vẫn tiếp tục đun nóng hệ thống, lớp nước trong ống gạn càng lúc càng nhiều, sẽ được trả về bình cầu nhờ ống nhánh ngang thông nhau Nhờ ống này mà không cần phải tiếp thêm nước cho

hệ thống trong quá trình chưng cất Lúc này chỉ cần mở khóa ống gạn là có thể thu lấy tinh dầu

BÀI 4: SẮC KÝ CỘT

I Mục đích

Đây là một trong những kỹ thuật nhằm phân đoạn cao thô ban đầu (cao etanol, metanol, butanol) ra thành các phân đoạn cao nhỏ hơn, có độ phân cực khác nhau, hoặc cô lập ra hợp chất tinh khiết từ một phân đoạn cao nhỏ

II Cơ sở lý thuyết

Sự sắc ký là một phương pháp vật lý để tách một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất ra riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại hợp chất đó đối với một hệ thống (hệ thống gồm hai pha: một pha động và một pha tĩnh)

Việc tách hai hợp chất nào đó ra riêng có đạt được kết quả tốt hay không là tùy vào hệ

số phân chia Bất kỳ một hợp chất nào khi đặt vào một hệ thống gồm hai pha (hai pha: lỏng-lỏng hoặc rắn-lỏng-lỏng), lúc đạt đến trạng thái cân bằng, hợp chất đó sẽ phân bố vào mỗi pha với một tỷ lệ nồng độ cố định, tỷ lệ này thay đổi tùy vào các tính chất động học của hợp chất và của cả hai pha

Cũng tương tự, một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất khác nhau khi được đặt vào hệ thống gồm hai pha, vì thế sẽ có tương tác mạnh/yếu khác nhau đối với pha tĩnh Hệ quả là mỗi loại hợp chất sẽ di chuyển ngang qua pha tĩnh với một vận tốc khác nhau, nhờ vậy, kỹ thuật sắc ký có thể tách riêng các loại hợp chất

Sắc ký cột hở được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển Pha tĩnh thường những hạt

có kích thước tương đối lớn (50-150µm), được nạp trong một cột bằng thủy tinh Mẫu chất cần phân tích được đặt phía trên đầu pha tĩnh, có một lớp bông thủy tinh đặt lên trên bề mặt để không bị xáo trộn lớp mặt Dung môi giải ly đươc đưa ra và hứng trong những lọ nhỏ ở phía dưới cột, rồi đem đi cô quay đuổi dung môi, dùng sắc ký lớp mỏng để theo dõi quá trình giải

ly

Trong loại sắc ký cột với pha tĩnh là silica gel loại thường, hợp chất không phân cực được giải ly ra khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly ra sau:

Bảng 1: Các loại hợp chất có tính phân cực tăng dần Loại hợp chất Thứ tự giải ly ra khỏi cột

Hydrocarbon

Alken

Eter

Hydrocarbon R-H

Hợp chất thơm

Ceton

Aldehyde

Ester

Alcol

Amin

Acid carboxylic

Các hợp chất kiềm mạnh Chậm nhất, cần dung môi phân cực

III Dụng cụ, hóa chất

Sắc ký nhanh-cột khô (Dry-column flash chromatography)

Dụng cụ

 Phễu lọc xốp bằng thủy tinh với độ xốp của lỗ thuộc loại 2 hoặc loại 3 để dòng chảy của dung môi được thuận lợi, đường kính trung bình của lỗ xốp 41-100µm

 Chén sứ và chày nhỏ

 Bình tam giác

 Hệ thống tạo chân không nhẹ bằng vòi nước (máy bơm)

 2 cái muỗng

 Bông gòn, kéo

 5 lọ thủy tinh (100ml)

Hóa chất

 Silica gel khô (cỡ hạt 15-40 µm)

 Eter dầu hỏa, cloroform, etyl acetat, metanol, nước cất, aceton

Sắc ký cột hở (open-column chromatography)

Dụng cụ

 Cột thủy tinh (đường kính 1.5cm, cao 60cm)

 2 cái kẹp

 1 giá đỡ (giữ cột)

 1 becher 100ml, đũa thủy tinh

 Ống đong 100ml

 Bông gòn thấm nước

 Phễu thủy tinh nhỏ, các lọ thủy tinh (100ml, 50ml)

Hóa chất

 Silica gel (50-150µm)

 Eter dầu hỏa, chloroform, etyl acetat, metanol, acetone, nước

IV Cách tiến hành

Sắc ký nhanh-cột khô (Dry-column flash chromatography)

a) Nạp chất hấp thu vào cột

Ráp hệ thống gồm phễu lọc xốp gắn trên bình tam giác, bình này nối với một máy bơm hút tạo chân không, cho máy bơm hoạt động Múc từng lượng nhỏ silica gel khô cho vào phễu, dùng muỗng nén nhẹ silica gel xuống đáy phễu, mỗi lần mỗi ít, từng lớp, tạo thành một khối rắn, đồng nhất, chặt chẽ, có bề mặt bằng phẳng Chiều dày lớp silica gel khoảng 5cm Nếu cần tách một lượng mẫu chất nhiều hơn thì sử dụng phễu to hơn, có đường kính lớn hơn

Bảng 2: Mối liên quan giữa lượng mẫu và kích thước phễu trong sắc ký-nhanh cột khô

Lượng mẫu Đường kính trong

của phễu (cm)

Chiều cao lớp hấp

thu

Phân đoạn dung dịch giải ly (ml)

<100 mg 0,5-1,0 4 10-15

b) Cân bằng cột sắc ký

Sau khi nạp pha tĩnh xong, chỉnh lớp bề mặt pha tĩnh cho bằng phẳng, đặt một lớp bông gòn dày lên bề mặt cột để bảo vệ lớp mặt

Cân bằng cột bằng loại dung môi ít phân cực nhất, loại dung môi dùng để giải ly đầu tiên Cho một lượng lớn dung môi lên đầu cột, mở máy bơm, dung môi sẽ được hút xuống bình tam giác Thực hiện vài lần, đến khi chất hấp thu đồng nhất trong cột thì dừng, cột được cân bằng

c) Nạp mẫu lên đầu cột và giải ly cột

Nạp mẫu thô: Dùng muỗng múc từng lượng nhỏ silica gel vào cao thô ban đầu, nghiền

thành bột, sau khi nghiền thành bột mịn xong, lấy lớp bông gòn ra khỏi cột, dùng muỗng múc bột nghiền vào đầu cột, dùng muỗng trải đều phần bột này để có một lớp mỏng, không được đè nén lớp bột này

Lấy lớp bông gòn lúc nảy phủ trở lại lên mặt cột, bề mặt này sẽ không bị xáo trộn khi giải ly