Xây dựng phương pháp định tính và định lượng alisol a alisol b23 acetat trong dược liệu trạch tả ( alisma plantago aquatica) trồng tại việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC ĐỖ THỊ THU TRANG XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG ALISOL A & ALISOL B 23 – ACETAT TRONG DƢỢC LIỆU TRẠCH TẢ (Alisma plantago – aquatica) TRỒNG TẠI VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Hà Nội 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC ĐỖ THỊ THU TRANG XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG ALISOL A & ALISOL B 23 – ACETAT TRONG DƢỢC LIỆU TRẠCH TẢ (Alisma plantago – aquatica) TRỒNG TẠI VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Khóa: QH.2013.Y Người hướng dẫn: TS Nguyễn Thị Phƣơng Ths Nguyễn Thúc Thu Hƣơng Hà Nội 2018 LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến T.S Nguyễn Thị Phƣơng (Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu) Ths Nguy ễ n Thúc Thu Hƣơng (Bộ môn Dược liệu Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược, ĐHQGHN) người thầy hướng dẫn, bảo, góp ý đưa ý kiến q báu để em hồn thiện khóa luận Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Dược liệu PGS.TS Phƣơng Thiện Thƣơng nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn cán bộ, nhân viên khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu, đặc biệt anh Nguy ễn Đình Quân anh Lê Ngọc Duy – người theo sát, hướng dẫn cho em suốt trình thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô Khoa Y – Dược dạy dỗ, trang bị kiến thức cho em suốt năm theo học trường Sau cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè ln bên cạnh, ủng hộ, độ ng viên em suốt trình học tập, nghiên cứu hồn thành khóa luận Em xin chân thành c ảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2018 Sinh viên Đỗ Thị Thu Trang MỤC LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Trạch tả (Alisma orientale (Sam.) Juzep.) .2 1.1.1 Tên khoa học 1.1.2 Đặc điểm thực vật phân bố 1.1.3 Bộ phận dùng 1.1.4 Thành phần hóa học 1.1.5 Một số tác dụng dược lý 1.2 Tổng quan alisol A alisol B 23 – acetat .9 1.2.1 Tổng quan alisol A 1.2.2 Tổng quan alisol B 23 – acetat 11 1.3 Một số nghiên cứu định tính, định lượng AA AB23 Trạch tả 13 1.3.1 Các nghiên cứu giới 13 1.3.2 Các nghiên cứu nước 14 1.3.3 Tiêu chuẩn v ề dượ c liệu Trạch tả số Dược điển 14 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu 16 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.1.2 Hóa chất dung mơi 17 2.1.3 Thiết bị dùng nghiên cứu .17 2.2 Nội dung nghiên cứu 17 2.2.1 Định tính AA AB23 sắc ký lớp mỏng 17 2.2.2 Định lượng AA HPLC 17 2.2.3 Phân tích mẫu thực 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1 Định tính AA AB23 sắc ký lớp mỏng 18 2.3.2 Định lượng AA HPLC 19 2.3.3 Phân tích mẫu thực 22 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 3.1 Định tính AA AB23 TLC .23 3.1.1 Định tính AB23 .23 3.1.2 Định tính AA 24 3.1.3 Định tính AA AB23 số mẫu Trạch tả sắc ký lớp mỏng 25 3.2 Định lượng AA HPLC 27 3.2.1 Lựa chọn pha tĩnh 27 3.2.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 28 3.2.4 Thẩm định phương pháp định lượng 30 3.3 Ứng dụng phương pháp 35 3.4 Bàn luận 35 3.4.1 Tính cấp thiết việc tiêu chuẩn hóa dược liệu Trạch tả Việt Nam 35 3.4.2 Xây dựng phương pháp định tính 36 3.4.4 Phương pháp định lượng .37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên tiếng Anh AA Alisol A ACN Acetonitrile AB23 Alisol B 23 - ac AOAC EtOH HPLC Association of O Chemists Ethanol High performan chromatography kl/kl LOD Limid of Detec LOQ Limid of Qualif MeOH Methanol MS Mass Spectrom RSD Relative Standa S/N Signal/Noise STT TLC UVVIS v/v Thin layer chro Ultraviolet Visi Volume/volume DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Bảng 1.1 Một số nghiên cứu th lượng AA AB23 Trạch tả Bảng 1.2 Chương trình dung mơi th Hồng Kơng Bảng 2.1 Mẫu Trạch tả Bảng 3.1 Kết khảo sát dung mô Bảng 3.2 Kết khảo sát tỷ lệ dun Bảng 3.3 Kết khảo sát thời gian Bảng 3.4 Kết đánh giá tính thíc Bảng 3.5 Quan hệ tuyến tính n pic AA Bảng 3.6 Kết đánh giá độ lặp lạ 10 Bảng 3.7 Kết th ẩm định độ đún 11 Bảng 3.8 Kết qu ả định lượng AA tr Trạch tả DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ STT Tên h Hình 1.1 Hình ảnh Hình 1.2 Thân rễ thân Hình 1.3 Cơng thức s rễ Trạch tả Hình 1.4 Cơng thức s rễ Trạch tả Hình Cơng thức thân rễ Trạch tả Hình 1.6 Cơng thức cấu t Hình 1.7 Cơng thức cấu t Hình 2.1 Hình ảnh dược l Viện Dược liệu Hình 3.1 Khảo sát định t 10 Hình 3.2 Khảo sát định tí 11 Hình 3.3 Sắc ký đồ định t Trạch tả Hình 3.4 Sắc ký đồ định t 12 mẫu Trạch tả 13 14 15 Hình 3.5 Sắc ký đồ khảo Hình 3.6 Sơ đồ quy trình Hình 3.7 Sắc ký đồ đánh phương pháp HPLC - UV 16 Hình 3.8 Sắc ký đồ m 17 Hình 3.9 Đường chuẩn củ ĐẶT VẤN ĐỀ Trạch tả có tên khoa học Alisma orientale (Sam.) Juzep., tên đồng danh (Alisma plantago – aquatica) Thuộc họ Trạch tả Alismataceae Bộ phận dùng làm thuốc thân rễ khôn cạo vỏ Trạch tả vị thuốc quý sử dụng lâu đời Y học cổ truyền Việt Nam Trung Hoa với tác dụng: lợi tiểu, hạ mỡ máu, tăng cường miễn dịch, kháng viêm, giảm đường huyết… Nhóm chất có hoạt tính sinh học Trạch tả hợp chất triterpenoids, có alisol A alisol B 23 - acetat AB23 chứng minh có tác dụng lợi tiểu, chống viêm gan nhiễm mỡ không rượu, giảm ung thư buồng trứng, chống dị ứng… Alisol A hướng tác dụng chủ yếu tế bào viêm gan cịn có tác d ụng khác kháng khuẩn, tăng cường miễn dịch… Việt Nam, việc đánh giá chất lượng dược liệu Trạch tả thường sử dụng theo Dược điển Việt Nam IV, nhiên tiêu chuẩn hạn chế, chưa đáp ứng yêu cầu đánh giá nên chất lượng dược liệu Trạch tả thị trường chưa đảm bảo Các nghiên cứu phân tích thành phần hóa học giới hầu hết sử dụng alisol B 23 - acetat làm tiêu chí đánh giá chất lượng dược liệu Trạch t ả Tuy nhiên, alisol B 23 - acetat alisol A chiếm hàm lượ ng lớn, có nhiều tác dụng quý với tiềm nghiên cứu, phát triển để ứng d ụng điều trị Vì vậy, alisol A thành phần quan trọng, sử dụng làm ―maker‖ kiểm nghiệm chất lượng dược liệu Trạch tả Ở Từ nh ững thực tiễn trên, nhằm xây dựng phương pháp đánh giá chất lượng dược liệu Trạch tả, thực đề tài “Xây dựng phƣơng pháp định tính định lƣợng alisol A alisol B 23 - acetat dƣợc liệu Trạch tả (Alisma plantago – aquatica) trồng Việt Nam” với mục tiêu: - - Xây dựng phương pháp định tính định lượng alisol A alisol B 23 – acetat dược liệu Trạch tả trồng Việt Nam Áp dụng phương pháp phân tích số mẫu Trạch tả Datafile Name:T 120-20ul-005.lcd Sample Name:04 Sample ID:04 mAU 225 210nm,4nm 200 175 150 125 100 75 50 25 0.0 1.0 Phụ lục 4: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn Sắc ký đồ dung dịch chuẩn nồng độ 4.168µg/ml Dataf ile Name:alisolA-4.168-ug-ml-20ul-001.lcd Sample Name:std Sample ID:08 m AU 5 210nm,4nm 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 -0.5 0.0 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn nồng độ 10.42 µg/ml mAU 13 12 11 10 0.0 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn nồng độ 20.84 µg/ml Dataf ile Name:alisolA-20.84-ug-ml-20ul-001.lcd Sample Name:std Sample ID:06 m AU 27 0.0 210nm,4nm 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 m in Sắc ký đồ dung dịch chuẩn nồng độ 41.68 µg/ml Dataf ile Name:alisolA-41.68-ug-ml-20ul-001.lcd Sample Name:std Sample ID:05 mAU 210nm,4nm 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 0 1.0 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn nồng độ 104.2 µg/ml Dataf ile Name:alisolA-104.2-ug-ml-20ul-001.lcd Sample Name:std Sample ID:04 m AU 210nm,4nm 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0.0 1.0 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn nồng độ 208.4 µg/ml Dataf ile Name:alisolA-208.4-ug-ml-20ul-001.lcd Sample Name:std Sample ID:03 mAU 210nm,4nm 275 250 225 200 175 150 125 100 75 50 25 0 1.0 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn nồng độ 416.8 µg/ml Dataf ile Name:alisolA-416.8-ug-ml-20ul-001.lcd Sample Name:std Sample ID:02 m AU 210nm,4nm 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0.0 1.0 Phụ lục 5: Sắc ký đồ định lƣợng mẫu thử Sắc ký đồ định lượng mẫu M1 Dataf ile Name:T1-20ul-001.lcd Sample Name:01 Sample ID:01 m AU 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0.0 Sắc ký đồ định lượng mẫu M2 mAU 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 -5 0.0 Sắc ký đồ định lượng mẫu M3 m AU 200 210nm,4nm 175 150 100 125 75 50 25 0.0 1.0 Sắc ký đồ định lượng mẫu M4 Dataf ile Name:T4-20ul-004.lcd Sample Name:03 Sample ID:03 m AU 210nm,4nm 200 175 150 125 100 75 50 25 0 1.0 Sắc ký đồ định lượng mẫu M5 Dataf ile Name:T5-20ul-005.lcd Sample Name:04 Sample ID:04 m AU 210nm,4nm 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0.0 1.0 Sắc ký đồ định lượng mẫu M6 Dataf ile Name:T6-20ul-006.lcd Sample Name:05 Sample ID:05 m AU 150 210nm,4nm 140 130 120 110 Alisol A/1156186 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 m in Sắc ký đồ định lượng mẫu M7 Dataf ile Name:T7-20ul-007.lcd Sample Name:06 Sample ID:06 m AU 210nm,4nm 225 200 175 75 50 25 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 m in ... dƣợc liệu Trạch tả (Alisma plantago – aquatica) trồng Việt Nam? ?? với mục tiêu: - - Xây dựng phương pháp định tính định lượng alisol A alisol B 23 – acetat dược liệu Trạch tả trồng Việt Nam Áp... QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC ĐỖ THỊ THU TRANG XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG ALISOL A & ALISOL B 23 – ACETAT TRONG DƢỢC LIỆU TRẠCH TẢ (Alisma plantago – aquatica) TRỒNG TẠI VIỆT NAM. .. lƣợng AA AB23 Trạch tả 1.3.1 Các nghiên cứu giới Bảng 1.1 Một số nghiên cứu giới định lượng AA AB23 Trạch tả TLTK Đối tƣợng phâ [55] AA, alisol A acetate AB23 [54] Alisol A 24-ac AB23 [22] AB23