Nghiên cứu tác dụng sinh học và bước đầu tìm hiểu cơ chế hóa sinh của rau má ( centella asiatica) trên mô hình chuột nhắt mất tế bào thần kinh bởi trimethyltin

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ PHƯƠNG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG SINH HỌC VÀ BƯỚC ĐẦU TÌM HIỂU CƠ CHẾ HĨA SINH CỦA RAU MÁ (Centella asiatica) TRÊN MƠ HÌNH CHUỘT NHẮT MẤT TẾ BÀO THẦN KINH BỞI TRIMETHYLTIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ HÀ NỘI - 2020 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ PHƯƠNG MÃ SINH VIÊN: 1501403 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG SINH HỌC VÀ BƯỚC ĐẦU TÌM HIỂU CƠ CHẾ HÓA SINH CỦA RAU MÁ (Centella asiatica) TRÊN MƠ HÌNH CHUỘT NHẮT MẤT TẾ BÀO THẦN KINH BỞI TRIMETHYLTIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ Người hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Thị Lập PGS.TS Phạm Thị Nguyệt Hằng Nơi thực Bộ mơn Hóa sinh Viện Dược liệu HÀ NỘI - 2020 LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Phạm Thị Nguyệt HằngTrưởng khoa Dược lý- Hóa sinh, Viện dược liệu người trực tiếp hướng dẫn em hồn thành khóa luận Tiếp đến, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Lập- Bộ mơn Hóa sinh, Trường Đại học Dược Hà Nội Cô người nhận em vào môn tạo điều kiện tốt để em tiến hành hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến anh chị khoa Dược lý- Hóa sinh, Viện Dược liệu giúp đỡ, hướng dẫn em tạo điều kiện tốt để em hồn thành khóa luận tốt nghiệp khoa Nhân dịp này, em xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu tồn thể thầy giáo Trường Đại học Dược Hà Nội dạy dỗ tạo điều kiện cho em suốt thời gian học tập trường Cuối cùng, em xin bày tỏ yêu thương biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè bên em, động viên ủng hộ em, chỗ dựa vững tinh thần cho em em gặp khó khăn học tập sống Do thời gian thực nghiệm kiến thức thân có hạn, khóa luận cịn có nhiều thiếu sót Em mong nhận góp ý, nhận xét thầy cơ, bạn bè để khóa luận hồn thiện Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Sinh viên Trần Thị Phương MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan suy giảm trí nhớ 1.1.1 Sơ lược suy giảm trí nhớ .3 1.1.2 Dịch tễ học 1.1.3 Nguyên nhân chế bệnh sinh 1.1.4 Thuốc điều trị 1.1.5 Một số mơ hình suy giảm trí nhớ thực nghiệm 10 1.1.6 Phương pháp nhuộm Nissl .12 1.2 Tổng quan dược liệu nghiên cứu: Rau má (Centella asiatica (L.) Urb.) 13 1.2.1 Tên gọi 13 1.2.2 Đặc điểm thực vật, phân bố 13 1.2.3 Bộ phận dùng làm thuốc .13 1.2.4 Thành phần hóa học 14 1.2.5 Tác dụng dược lý 14 1.2.6 Tính vị, cơng 16 1.2.7 Một số thuốc cổ truyền có Rau má 17 1.2.8 Một số nghiên cứu liên quan Rau má với suy giảm trí nhớ 17 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Nguyên liệu thiết bị 20 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .20 2.1.2 Động vật thí nghiệm 20 2.1.3 Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm .20 2.2 Nội dung nghiên cứu 21 2.3 Phương pháp nghiên cứu 23 2.3.1 Nghiên cứu tác dụng cải thiện suy giảm trí nhớ cao chiết cồn Rau má mơ hình chuột bị tế bào thần kinh trimethyltin 23 2.3.2 Phương pháp nhuộm Nissl- nhuộm hóa mơ để tìm hiểu chế hóa sinh bảo vệ tế bào thần kinh cao chiết cồn Rau má 24 2.4 Phân tích số liệu 25 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .27 3.1 Đánh giá tác dụng cải thiện suy giảm trí nhớ cao chiết cồn Rau má mơ hình chuột bị tế bào thần kinh trimethyltin 27 3.1.1 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ cao chiết cồn Rau má mơ hình thử nghiệm thay đổi vị trí đồ vật (OLT) .27 3.1.2 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ cao chiết cồn Rau má mơ hình mê lộ chữ Y cải tiến (Y-maze) 29 3.2 Tìm hiểu chế hóa sinh bảo vệ tế bào thần kinh cao chiết cồn Rau má phương pháp nhuộm Nissl 30 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .44 DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Tiếng Anh Tiếng Việt 5-HT 5-hydroxytryptamine Serotonin Ach Acetylcholin Acetylcholin AchE Acetylcholinesterase Acetylcholinesterase AD Alzheimer Disease Bệnh Alzheimer ADDLs Aβ-derived oligomers Các oligomer có nguồn gốc βAP AICD APP-intracellular domain Phần APP tế bào ApoE4 Apolipoprotein E4 Apolipoprotein E4 APP Amyloid Precursor Protein Protein tiền chất amyloid CAE Centella asiatica Extract Cao chiết cồn Rau má CTF C- terminal fragment DA Dopamine Đoạn cuối C (trong phân tử APP) Dopamin DLB Dementia Lewis body Suy giảm trí nhớ thể Lewy HPA MDA Hypothalamus - Pituitary - Trục tuyến yên- đồi- Adrenal thượng thận Malondialdehyd Thông số stress oxy hóa MEAN Giá trị trung bình lơ MHPG 3-Methoxy-4- Chất chuyển hóa hydroxyphenylglycol norepinephrin NE Norepinephrine Norepinephrin NFTs Neurofibrilary Tungles Đám rối thần kinh NMDA N-methyl D-aspartate N-methyl D-aspartat OLT Object Location Test Thử nghiệm thay đổi vị trí đồ vật PBS Phosphate Suffer Saline Dung dịch đệm phosphat PS Presenilin Presenilin Chuột gây mơ hình RM150 TMT dùng cao chiết cồn Rau má liều 150 mg/kg thể trọng Chuột gây mô hình RM300 TMT dùng cao chiết cồn Rau má liều 300 mg/kg thể trọng ROS Reactive oxygen species Các phần tử oxy hoạt động SEM Standard Error of the Mean Sai số chuẩn TMT Trimethytin Trimethytin VaD Vascular dementia Suy giảm trí nhớ mạch máu βAP β-amyloid Peptid β-amyloid peptid DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Hóa chất 20 Bảng 2.2: Trang thiết bị 21 DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Sơ đồ phân tử APP trình gây AD [17] Hình 1.2: Cây Rau má (Centella asiatica (L.) Urb.) .13 Hình 2.1:Sơ đồ tiến hành thực nghiệm theo thời gian……………………………… 22 Hình 2.2: Mơ hình thử nghiệm thay đổi vị trí đồ vật (OLT) 23 Hình 2.3: Sơ đồ tiến hành thử nghiệm mê lộ chữ Y cải tiến (Y-maze) 24 Hình 3.1: Kết thử nghiệm thay đổi đồ vật (OLT) chuột suy giảm trí nhớ gây TMT ngày thứ 32 ………………………………………………………………… 28 Hình 3.2: Kết pha kiểm tra thử nghiệm mê lộ chữ Y cải tiến chuột suy giảm trí nhớ gây TMT ngày thứ 35 29 Hình 3.3: Hình ảnh mơ học hồi hải mã chuột sau nhuộm Nissl chụp vật kính 4x 31 Hình 3.4: Hình ảnh mô học vùng CA3 hồi hải mã chuột sau nhuộm Nissl chụp vật kính 20x 32 Hình 3.5: Hình ảnh mơ học vùng CA1 hồi hải mã chuột sau nhuộm Nissl chụp vật kính 20x 33 Hình 3.6: Kết phân tích mật độ điểm sáng vùng CA3 hồi hải mã não chuột sau nhuộm Nissl 34 Hình 3.7: Kết phân tích mật độ điểm sáng vùng CA1 hồi hải mã não chuột sau nhuộm Nissl 35 ĐẶT VẤN ĐỀ Suy giảm trí nhớ hội chứng ảnh hưởng đến trí nhớ, suy nghĩ, hành vi khả thực hoạt động hàng ngày Chứng trí nhớ khơng ảnh hưởng người có mà cịn người chăm sóc gia đình họ [59] Chứng sa sút trí tuệ phổ biến bệnh Alzheimer (AD) thường có tính chất mạn tính, tiến triển dần dần, thưởng trở nên tồi tệ sau vài năm Theo số liệu thống kê năm 2012, số người mắc chứng trí nhớ tồn giới ước tính khoảng 35,6 triệu Con số tăng gấp đôi vào năm 2030 nhiều gấp ba vào năm 2050 Tại Việt Nam, năm 2017, trí nhớ nguyên nhân thứ gây tử vong [49] Việc điều trị có ảnh hưởng kinh tế xã hội liên quan đến chi phí điều trị, chi phí chăm sóc, chi phí xã hội Hiện nay, thuốc điều trị đa số tân dược có nhiều tác dụng khơng mong muốn Do việc nghiên cứu phát triển loại thuốc hiệu việc ngăn chặn điều trị sa sút trí tuệ mà cịn sử dụng lâu dài mà có tác dụng khơng mong muốn cần thiết Hiện nay, xu hướng sử dụng sản phẩm có nguồn gốc từ dược liệu tăng cao, việc sử dụng sản phẩm hỗ trợ điều trị điều trị cho bệnh thần kinh không ngoại lệ Một số dược liệu nghiên cứu hỗ trợ điều trị suy giảm trí nhớ bạch quả, hồng liên, nhân sâm [41, 57, 58] Rau má thảo dược phổ biến, dễ tìm áp dụng nhiều thuốc y học cổ truyền với nhiều tác dụng khác Một số nghiên cứu trước chứng minh Rau má có nhiều tác dụng hệ thần kinh, khả điều trị trầm cảm, động kinh cải thiện tình trạng thiếu hụt học tập, suy giảm trí nhớ Trong hệ thống y học Hindu truyền thống Ấn Độ (Ayurveda), rau má thảo dược giúp hồi sinh dây thần kinh tế bào não [25] Tuy nhiên, nay, nghiên cứu nước ta lợi ích tiềm rau má thu hái Việt Nam hệ thần kinh cụ thể suy giảm trí nhớ cịn hạn chế Nhận thấy tiềm rau má hệ thần kinh, nghiên cứu thực nhằm hai mục tiêu cụ thể: Chương 4: Bàn luận 4.1 Về đối tượng nghiên cứu, mơ hình gây suy giảm trí nhớ chuột TMT mức liều cao chiết cồn Rau má Như đề cập phần tổng quan, có nhiều phương pháp để gây mơ hình suy giảm trí nhớ đối tượng sử dụng để đánh giá thuốc có tác dụng cải thiện trí nhớ phong phú thuốc tiến hành thử chuột, ruồi giấm hay mơ hình tế bào ni cấy [7, 11, 33, 35, 39, 48, 52] Tuy nhiên việc sử dụng chuột đối tượng để nghiên cứu đánh giá tác dụng chiếm đa số điểm tương đồng gen biểu bệnh Hơn nữa, với mơ hình động vật thực nghiệm chuột tương đối dễ dàng để triển khai mô hình nguồn cung cấp dồi dào, chi phí thấp dễ dàng chăm sóc q trình thực thực nghiệm Về Rau má, thảo dược có ngun liệu dồi dào, dễ tìm kiếm, dễ sử dụng quan trọng Rau má tiến hành nhiều nghiên cứu tác dụng hệ thần kinh đặc biệt tác dụng cải thiện suy giảm trí nhớ Có nhiều nghiên cứu cao chiết nước, cao chiết phân đoạn, nước ép hay hoạt chất cụ thể Rau má acid asiatic, asiaticosid madecassosid … cho thấy tác dụng cải thiện trí nhớ [50] Phân tích sắc ký lỏng hiệu cao định lượng cho thấy chiết suất cồn Rau má có madecassosid thành phần cao nhất, asiaticosid, acid asiatic [22, 28] Đây thành phần cho có khả cải thiện suy giảm trí nhớ [50] Vì vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu tác dụng cải thiện suy giảm trí nhớ cao chiết cồn Rau má Một số nghiên cứu cao chiết cồn Rau má liều 300 mg/kg thể trọng/ ngày có tác dụng bảo vệ thần kinh quan trọng tỏ hiệu việc bảo vệ não chuột chống lại tổn thương oxy hóa liên quan đến tuổi [50, 54] Mặt khác, với mơ hình gây suy giảm trí nhớ stress điện mạn tính, sau đánh giá thử nghiệm mê cung nước (water maze) chiết xuất cồn Rau má cho thấy khả tăng hình thành trí nhớ liều 300mg/kg thể trọng/ ngày [64] Vì vậy, thử nghiệm tiến hành nghiên cứu tác dụng cải thiện trí nhớ cao chiết cồn liều 150 mg/ kg thể trọng/ ngày 300 mg /kg thể trọng/ngày Trimethyltin (TMT) chất độc thần kinh mạnh, gây chết neuron chọn lọc định vị hệ thống limbic (hệ viền) đặc biệt vùng đồi thị mô 36 hình động vật thí nghiệm người vơ tình tiếp xúc TMT sử dụng rộng rãi để nhận mơ hình thực nghiệm thối hóa thần kinh vùng đồi thị liên quan đến suy giảm nhận thức động kinh thùy thái dương Các cá nhân tiếp xúc biểu đặc điểm bệnh lý thần kinh hành vi tương tự đặc điểm gợi mơ hình động vật thí nghiệm nhiễm độc TMT [21, 37] gây mơ hình suy giảm trí nhớ cách đưa mơ hình thối hóa thần kinh TMT mơ hình đầy tiềm Trên thực tế, bệnh thối hóa thần kinh, đột biến chuột tương ứng với đột biến liên quan đến bệnh người dẫn đến kiểu hình thối hóa thần kinh [48] so với phương pháp sử dụng biến đổi gen, phương pháp sử dụng hóa chất gây thối hóa thần kinh tiến hành đơn giản gây biểu thực tế động vật thực nghiệm Tuy nhiên, TMT chất gây độc nên cần phải trọng đến liều sử dụng để tránh gây độc làm chết động vật thực nghiệm 4.2 Về đánh giá tác dụng điều trị suy giảm trí nhớ cao chiết cồn Rau má 4.2.1 Về kết thử nghiệm thay đổi vị trí đồ vật (OLT) Thử nghiệm thay đổi vị trí đồ vật thử nghiệm đánh giá hành vi dựa khả học tập phụ thuộc vào không gian dựa tính tị mị, thích tính lồi gặm nhấm Khả nhận thức bị ảnh hưởng thay đổi cách xếp vật thể thí nghiệm, thay đổi vị trí tiếp cận chuột Bộ nhớ vị trí đối tượng bị gián đoạn với thay đổi vị trí tương đối đối tượng thành tín hiệu ngồi trường điều kiện thiếu tín hiệu ngồi trường, cho thấy phân biệt đối tượng bị dịch chuyển phản ánh nhớ không gian Thông qua số đường thay đổi cân nội môi canxi, viêm thần kinh chết tế bào theo chương trình, TMT gây tổn thương định đến tế bào thần kinh hồi hải mã, nơi mà trí nhớ khơng gian hình thành Thử nghiệm thay đổi vị trí đồ vật (OLT) thử nghiệm phụ thuộc vào trí nhớ khơng gian, tức thử nghiệm phụ thuộc vào hồi hải mã Vì vậy, mơ hình gây suy giảm trí nhớ TMT, tiến hành thử nghiệm thay đổi vị trí đồ vật (OLT) để đánh giá tác dụng cao chiết cồn Rau má hồi hải mã, đánh giá tác dụng cải thiện suy giảm trí nhớ Rau má 37 Trong mơ hình gây suy giảm trí nhớ scopolamine MK 801, thử nghiệm OLT chứng minh hành vi vai trò vùng CA1 hồi hải mã [7] Thử nghiệm OLT tiến hành để đánh giá trí nhớ ngắn hạn phụ thuộc vào khơng gian Vì tính thích lạ lồi gặm nhấm, chuột dành nhiều thời gian để khám phá vật bị thay đổi vị trí Trong pha học tập, chuột, đồ vật đặt vào mới, nên thời gian khám pha đồ vật gần lơ chuột (p > 0,05) (Hình 3.1A) Trong pha kiểm tra, có vật thay đổi vị trí, vị trí tương đối đồ vật thay đổi Lô sinh lý, chuột dành nhiều thời gian để khám phá đồ vật thay đổi vị trí so với vật vị trí cũ theo chúng (p < 0,05) (Hình 3.1B) lơ bệnh lý lại khơng có khác biệt thời gian khám phá đồ vật (p > 0,05) (Hình 3.1B) Điều chứng tỏ việc sử dụng TMT gây mơ hình thành cơng Với lô chuột sử dụng CAE liều 150mg/kg thể trọng không cho thấy khác biệt thời gian khám phá đồ vật (Hình 3.1B), chứng tỏ thử nghiệm OLT, cao chiết cồn Rau má liều 150mg/kg thể trọng khơng cho thấy tác dụng cải thiện trí nhớ ngắn hạn Tuy nhiên, lô chuột sử dụng CAE liều 300mg/kg thể trọng cho thấy chuột khám phá đồ vật thay đổi vị trí nhiều so với vật vị trí cũ (p < 0,05) (Hình 3.1B), chứng tỏ cho thấy tác dụng cải thiện trí nhớ ngắn hạn CAE liều 300mg/kg thể trọng Tuy nhiên, cần phải tiến hành thăm dò thêm mức liều khoảng cách gần mức liều 300mg/kg thể trọng để tìm mức liều thấp có tác dụng cải thiện trí nhớ ngắn hạn Kết thử nghiệm có kết phù hợp với thử nghiệm OLT chứng minh acid asiatic cải thiện suy giảm trí nhớ acid valproic gây hay thử nghiệm đánh giá tác dụng acid asiatic cải thiện trí nhớ không gian tiến hành chủng chuột Spraque-Dawley, điều giúp thêm chứng cho thấy tác dụng cải thiện trí nhớ cao chiết cồn Rau má [53, 56] Với thử nghiệm OLT chuột gây mơ hình suy giảm trí nhớ scopolamine hay biến đổi gen tạo chuột PLB1Triple cho thấy khác biệt đáp ứng chuột phụ thuộc vào tuổi, cho thấy đáp ứng chuột già so với chuột non [7, 51] Vì vậy, để hạn chế sai lệch tuổi chuột, thí nghiệm chúng tơi tiến hành đối tượng chuột có số ngày tuổi chuột non với tuần tuổi để có đáp ứng tương đồng đáp ứng tốt với thử nghiệm 38 Mặc dù khả nhận thức chuột không bị ảnh hưởng vị trí tiếp cận chuột, nghiên cứu này, chuột đặt vị trí tiếp cận với đồ vật để hạn chế tối đa sai lệch thí nghiệm 4.2.2 Về kết thử nghiệm mê lộ chữ Y cải tiến (Y-maze) Mê lộ chữ Y cải tiến sử dụng để đánh giá trí nhớ ngắn hạn chuột Sự xen kẽ tự phát, thước đo trí nhớ làm việc khơng gian, đánh giá cách cho phép chuột khám phá ba nhánh mê cung thúc đẩy tò mò bẩm sinh loài gặm nhấm để khám phá khu vực khơng ý trước Theo tính chuột, có nhớ làm việc nguyên vẹn nhớ cánh tay vào trước cho thấy xu hướng vào cánh tay vào gần Bộ nhớ tham chiếu khơng gian chi phối hồi hải mã, kiểm tra cách đặt chuột thử nghiệm vào mê lộ chữ Y cải tiến với cánh tay đóng lại q trình học tập Sau khoảng thời gian thử nghiệm chuột nên nhớ cánh tay chưa khám phá trước nên ghé thăm cánh tay thường xuyên Trí nhớ không gian hỗ trợ tương tác hồi hải mã (HPC), hạt nhân đồi thị trước (ATN) mạng lưới khu vực vỏ não bao gồm vỏ não parahippocampal, vỏ võng mạc (RSC) sau vỏ não đỉnh Trong vùng hồi hải mã có vai trị quan trọng việc hình thành ký ức [44] Thử nghiệm mê lộ chữ Y cải tiến (Y-maze) thử nghiệm phụ thuộc vào trí nhớ không gian, tức đáp ứng chuột thử nghiệm phụ thuộc vào hồi hải mã; đồng thời, nghiên cứu tiến hành gây mơ hình suy giảm trí nhớ TMT, chất độc gây tổn thương đến tế bào thần kinh hồi hải mã thông qua số đường thay đổi nồng độ canxi nội mơi, viêm thần kinh…Vì tiến hành thử nghiệm mê lộ chữ Y cải tiến (Y-maze) để đánh giá tác dụng cao chiết cồn Rau má hồi hải mã đánh giá khả cải thiện suy giảm trí nhớ Rau má Kết thử nghiệm Y-maze cho thấy thời gian khám phá cánh cửa lô bệnh lý khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô sinh lý (p < 0,01) (Hình 3.2) Điều chứng tỏ sử dụng TMT gây mơ hình suy giảm trí nhớ thành cơng thử nghiệm Y-maze Kết thử nghiệm cho thấy lô chuột điều trị CAE liều 150mg/kg thể trọng hay 300 mg/kg thể trọng có thời gian khám phá cánh cửa nhiều khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lơ bệnh lý với giá trị p p < 39 0,01 p < 0,05 (Hình 3.2) Điều chứng tỏ, thử nghiệm mê lộ chữ Y cải tiến (Y-maze) cho thấy cao chiết cồn Rau má có tác dụng làm giảm suy giảm trí nhớ chuột gây bới TMT Mặc dù Y-maze thử nghiệm phổ biến để đánh giá trí nhớ động vật thực nghiệm, chưa có thử nghiệm Y-maze tiến hành với đối tượng Rau má Một số nghiên cứu sử dụng thử nghiệm mê cung cộng mê cung nước thay sử dụng thử nghiệm Y-maze để đánh giá khả định hướng không gian chuột Tuy nhiên nguyên tắc sử dụng thử nghiệm tương đồng Kết thử nghiệm mê lộ chưc Y cải tiến (Y-maze) tương đồng với kết thử nghiệm mê cung nước mê cung cộng đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ khơng gian Rau má [36] 4.3 Về chế hóa sinh cao chiết cồn Rau má hệ thần kinh nhằm cải thiện suy giảm trí nhớ Lưu trữ nhớ định vị thùy thái dương, vùng đồi thị số cấu trúc đường đường định nhân màng cứng đồi thị [13] Hồi hải mã phần hệ viền (hệ limbic) có vai trị trực tiếp đến khả học tập ghi nhớ đặc biệt có vai trị quan trọng trí nhớ không gian cho khả điều hướng Hồi hải mã gồm phần hải mã đích danh (cịn gọi sừng Amon) hồi (gyrus dentatus), hải mã đích danh gồm CA1, CA2, CA3, CA4 Khi suy giảm trí nhớ, hồi hải mã vùng não ảnh hưởng với triệu chứng ban đầu suy giảm trí nhớ ngắn hạn phương hướng [5] Bộ nhớ bao gồm ba trình, đăng ký, hợp truy xuất Nó tạo thay đổi khả truyền synap từ tế bào thần kinh sang tế bào thần kinh khác kết hoạt động thần kinh trước Do thay đổi liên tiếp, đường phát triển, để dẫn truyền tín hiệu thông qua mạch thần kinh não Những đường gọi dấu vết nhớ Con đường giúp ghi nhớ hồi hải mã thông qua chế Thông tin vào vỏ não nội khứu (entorhinal cortex), xuất thông tin CA1 Thông tin đến CA1 thông qua hai đường chính, trực tiếp gián tiếp Con đường trực tiếp (con đường xuyên qua- perforant path) đường truyền thông tin từ lớp III vỏ não nội khứu đến CA1 Con đường gián tiếp thông qua mạch ba synap, sợi trục có nguồn gốc từ lớp II vỏ não nội khứu truyền 40 đến tế bào hạt hồi (synap đầu tiên) Từ đó, thơng tin theo sợi rêu (mossy path) đến CA3 (synap thứ hai) Tiếp theo, sợi trục CA3 truyền thông tin đến CA1 (synap thứ ba) Các thông tin theo sợi trục từ CA1 sau truyền trở lại vỏ não nội khứu, hoàn thành mạch thần kinh [5, 45] Các nghiên cứu vùng CA1 ngày chiếm ưu phần tương đối dễ để đạt mô tả vùng tế bào Hơn nữa, đường truyền thông tin từ CA3 đến CA1 đường thống để hoạt hóa dẫn truyền qua synap tính dẻo neuron; việc giữ cho tế bào vùng CA1 CA3 nguyên vẹn dễ dàng so với vùng khác [5] Ngồi ra, nghiên cứu này, chúng tơi gây mơ hình suy giảm trí nhớ TMT, chất độc ảnh hưởng đến vùng CA1 CA3 Vì vậy, nghiên cứu này, vùng CA1 CA3 tiến hành quan sát hình thái tế bào phân tích cho thấy khả bảo vệ tế bào có vai trị quan trọng hình thành trí nhớ cao chiết Rau má Theo kết nghiên cứu Hình 3.4 Hình 3.5, đặc điểm hình thái CA1 CA3 lơ bệnh lý bắt màu nhạt hơn, mật độ tế bào bắt màu khơng cịn thấy rõ tế bào so với lơ sinh lý Hơn nữa, kết phân tích mật độ điểm sáng (Hình 3.6 Hình 3.7) có khác biệt có ý nghĩa thống kê lơ bệnh lý so với lô sinh lý vùng CA1 CA3, mật độ điểm sáng phản ánh độ đậm nhạt số lượng tế bào bắt màu Như khẳng định việc gây mơ hình suy giảm trí nhớ TMT làm tế bào thần kinh thành công Cùng phương pháp quan sát hình thái phân tích mật độ điểm sáng cho thấy tác dụng hồi phục tế bào sau tổn thương TMT gây CAE liều 150mg/kg thể trọng CAE liều 300mg/kg thể trọng Trong nghiên cứu này, vùng chụp cường độ ánh sáng để hạn chế khác biệt sáng tối phân tích mật độ điểm sáng Kết thay đổi số lượng, hình thái tế bào vùng CA3 CA1 tương đồng với số nghiên cứu tác dụng cao chiết nước Rau má hồi phục tế bào [20] Như kết nhằm giúp khẳng định thêm vai trò cao chiết cồn Rau má suy giảm trí nhớ khả bảo vệ, làm phục hồi, kích thích tăng trưởng tế bào thần kinh Nhận định tương đồng với quan điểm đưa nghiên cứu tác dụng CAE chủng chuột SpraqueDawley, CAE cho có khả ngăn ngừa thiếu hụt trí nhớ động vật thơng qua việc tăng sinh tế bào thần kinh [53] 41 Cao chiết cồn Rau má mang lại tiềm điều trị điều trị bệnh Alzheimer thông qua việc ức chế AChE, chống viêm hoạt động stress oxy hóa Tác dụng thấy qua mơ hình in vitro (tế bào SH-SY5Y RAW 264,7) mơ hình in vivo (chuột Sprague Dawley) CAE làm giảm nồng độ cytokin/ chất trung gian gây viêm stress oxy hóa giải phóng phụ thuộc nồng độ [28, 50] Ở mơ hình chuột Tg256, chuột 5XFAD, chiết xuất nước Rau má (CAW) cải thiện chức nhận thức mơ hình bệnh Alzheimer (AD) thơng qua tăng NRF2 vùng hải mã NRF2 khác, dấu hiệu mật độ synap tăng nhẹ vùng đồi thị vỏ não trước trán Ngồi ra,thơng qua việc tăng cường biểu NRF2 enzym chống oxy hóa, chức ty thể hồi hải mã cải thiện [27, 43] Nhiều thành phần hóa chiết xuất nước Rau má có cao chiết cồn Rau má [22] Vì chế cải thiện suy giảm trí nhớ Rau má thông qua việc tăng số lượng tăng cường biểu yếu tố phiên mã điều hòa chống oxy hóa (NRF2) Việc tăng cường AMP vịng (cAMP) có vai trị tăng cường nhận thức thần kinh AD rối loạn thần kinh khác, vai trị cAMP việc điều hòa tái tạo tế bào thần kinh Một số nghiên cứu chiết xuất nước Rau má có khả làm tăng phosphoryl hóa protein liên kết với yếu tố đáp ứng AMP vòng (CREB), yếu tố phiên mã quy định biểu gen quan trọng trí nhớ dài hạn, từ Rau má cho thấy khả cải thiện tình trạng suy giảm trí nhớ [26, 62] Với tương đồng thành phần hóa học chiết xuất nước Rau má cao chiết cồn Rau má [22], chế cao chiết cồn Rau má khả cải thiện suy giảm trí nhớ Trong nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành nhuộm Nissl để đánh giá khả bảo vệ tế bào Rau má củng cố thêm chế tác động Rau má não bộ, đặc biệt vùng CA3 CA1 hồi hải mã, vùng mà có vai trị quan việc hình thành lưu trữ trí nhớ, đặc biệt trí nhớ khơng gian Cơ chế hóa sinh cao chiết cồn Rau má việc cải thiện suy giảm trí nhớ nhiều đường khác ức chế AchE, kích hoạt yếu tố phiên mã điều hịa chống oxy hóa NRF2 giúp tăng hoạt động ty thể, làm tăng phosphoryl hóa protein liên kết với yếu tố đáp ứng AMP theo chu kỳ điều hòa nồng độ cAMP protein Tau để ngăn chặn oligome hóa độc tính thần kinh βAP Mặc dù số chế hóa sinh 42 đưa ra, nhiên giới hạn nghiên cứu này, cho thấy chế cải thiện suy giảm trí nhớ Rau má chế bảo vệ tế bào, hồi phục tế bào sau tổn thương Vì vậy, bước đầu xác định chế cao chiết cồn Rau má với tác dụng cải thiện suy giảm trí nhớ hình thái mơ học 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận  Về tác dụng cải thiện suy giảm trí nhớ cao chiết cồn Rau má: - Trong thử nghiệm thay đổi vị trí đồ vật, cao chiết cồn Rau má liều 300mg/kg thể trọng cho thấy khả cải thiện suy giảm trí nhớ chuột tế bào thần kinh Trimethyltin với thời gian chuột khám phá vật vị trí gấp 2,4 lần vật vị trí cũ (p < 0,05) - Trong thử nghiệm mê lộ chữ Y cải tiến, cao chiết cồn Rau má mức liều 150mg/kg thể trọng 300 mg/kg thể trọng cho thấy khả cải thiện suy giảm trí nhớ chuột tế bào thần kinh Trimethyltin với phần trăm thời gian chuột khám phá cánh cửa gấp 1,6 lần (p < 0,01) 1,5 lần (p < 0,05) so với lô bệnh lý  Về chế hóa sinh cải thiện suy giảm trí nhớ cao chiết cồn Rau má: Ở cao chiết cồn Rau má liều 150mg/kg thể trọng 300 mg/mg thể trọng sử dụng cho thấy bảo vệ tế bào thần kinh quan sát phân tích sau nhuộm Nissl, chế cao chiết cồn Rau má giúp cải thiện suy giảm trí nhớ làm tăng khả bảo vệ thần kinh, hồi phục tế bào thần kinh vùng CA1 CA3 hồi hải mã Kiến nghị - Thực thêm thử nghiệm khác để đánh giá toàn diện cao chiết cồn Rau má suy giảm trí nhớ đánh giá khả học tập, vận động,… - Thực thêm số nghiên cứu góp phần tìm hiểu rõ ràng chế hóa sinh khả bảo vệ tế bào thần kinh cao chiết cồn Rau má - Thực thêm nghiên cứu cao chiết phân đoạn Rau má với thành phần hóa học cụ thể để nâng cao hiệu cải thiện suy giảm trí nhớ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đỗ Huy Bích, Đàm Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mã, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn,(2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, II NXB Khoa học kỹ thuật tr.586 Hoàng Thị Kim Huyền, J.R.B.J.B.,(2014), Dược lâm sàng- Những nguyên lý sử dụng thuốc điều trị Nhà xuất Y học, Hà Nội Đỗ Tất Lợi,(2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam Nhà xuất Y học Hà Nội tr.631-632 Hồng Thị Bích Ngọc, Hóa sinh bệnh Alzheimer, Tạp chí Thần Kinh học Hội thần kinh học Việt Nam Tiếng Anh Andersen, P., et al.,(2006), The hippocampus book Oxford university press p.135155 Arora, D., M Kumar, and S Dubey, (2002), "Centella asiatica-a Review of It's Medicinal Uses and Pharmacological Effects." Journal of Natural remedies, 2(2), p 143-149 Assini, F.L., M Duzzioni, and R.N Takahashi, (2009), "Object location memory in mice: pharmacological validation and further evidence of hippocampal CA1 participation." Behavioural brain research, 204(1), p 206-211 Chang, L and R Dyer, (1983), "A time-course study of trimethyltin induced neuropathology in rats." Neurobehavioral toxicology and teratology, 5(4), p 443-459 Chatterjee, M., P Verma, and G Palit, (2010), "Comparative evaluation of Bacopa monniera and Panax quniquefolium in experimental anxiety and depressive models in mice." 10 Chen, Y., et al., (2003), "Effect of total triterpenes from Centella asiatica on the depression behavior and concentration of amino acid in forced swimming mice." Zhong yao cai= Zhongyaocai= Journal of Chinese medicinal materials, 26(12), p 870-873 11 Cheng, K.K., et al., (2013), "Highly stabilized curcumin nanoparticles tested in an in vitro blood–brain barrier model and in Alzheimer’s disease Tg2576 mice." The AAPS journal, 15(2), p 324-336 12 Crane, P.K., et al., (2013), "Glucose levels and risk of dementia." New England Journal of Medicine, 369(6), p 540-548 13 Dobbing, J and J Sands, (1979), "Comparative aspects of the brain growth spurt." Early human development, 3(1), p 79-83 14 Ellman, G.L., et al., (1961), "A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity." Biochemical pharmacology, 7(2), p 88-95 15 Evon Linstow Roloff, E., et al., (2007), "Dissociation of cholinergic function in spatial and procedural learning in rats." Neuroscience, 146(3), p 875-889 16 Evrard, P.A., et al., (1998), "Simultaneous microdialysis in brain and blood of the mouse: extracellular and intracellular brain colchicine disposition." Brain research, 786(1-2), p 122-127 17 Farooqui, A.A.,(2017), Neurochemical aspects of Alzheimer's disease: risk factors, pathogenesis, biomarkers, and potential treatment strategies Academic Press.p.9-10 18 Farooqui, A.A., (2019), "Molecular Mechanisms of Dementia." ScienceDirect, p 73-112 19 Fiedorowicz, A., et al., (2001), "Dentate granule neuron apoptosis and glia activation in murine hippocampus induced by trimethyltin exposure." Brain research, 912(2), p 116-127 20 Gadahad, M.R.K., M Rao, and G Rao, (2008), "Enhancement of hippocampal CA3 neuronal dendritic arborization by Centella asiatica (Linn) fresh leaf extract treatment in adult rats." Journal of the Chinese Medical Association, 71(1), p 6-13 21 Geloso, M.C., V Corvino, and F Michetti, (2011), "Trimethyltin-induced hippocampal degeneration as a tool to investigate neurodegenerative processes." Neurochemistry international, 58(7), p 729-738 22 Ghosh, K and N Indra, (2014), "Phytochemistry, in vitro free radical scavenging, chelating and toxicity of Centela asiatica L.(Apiaceae) ethanolic leaf extract." Int J Pharm Sci Rev Res, 29, p 328-34 23 Gill, S.S., et al., (2009), "Syncope and its consequences in patients with dementia receiving cholinesterase inhibitors: a population-based cohort study." Archives of Internal Medicine, 169(9), p 867-873 24 Giridharan, V.V., et al., (2011), "Ocimum sanctum Linn leaf extracts inhibit acetylcholinesterase and improve cognition in rats with experimentally induced dementia." Journal of medicinal food, 14(9), p 912-919 25 Gohil, K.J., J.A Patel, and A.K Gajjar, (2010), "Pharmacological review on Centella asiatica: a potential herbal cure-all." Indian journal of pharmaceutical sciences, 72(5), p 546 26 Gray, N.E., et al., (2018), "Centella asiatica: phytochemistry and mechanisms of neuroprotection and cognitive enhancement." Phytochemistry Reviews, 17(1), p 161194 27 Gray, N.E., et al., (2018), "Centella asiatica attenuates hippocampal mitochondrial dysfunction and improves memory and executive function in β-amyloid overexpressing mice." Molecular and Cellular Neuroscience, 93, p 1-9 28 Hafiz, Z.Z., et al., (2020), "Inhibitory Effects of Raw-Extract Centella asiatica (RECA) on Acetylcholinesterase, Inflammations, and Oxidative Stress Activities via In Vitro and In Vivo." Molecules, 25(4), p 892 29 International, A.s.D., (2015), "The global impact of dementia: An analysis of prevalence, incidence, cost and trends." World Alzheimer Report 2015 30 Jamil, S.S., Q Nizami, and M Salam, (2007), "Centella asiatica (Linn.) Urban—a review." 31 Joseph T.DiPiro, R.T.T., Gary C Yee, L Micheal Posey, Pharmacotherapy 10th A Pathophysiologic Approach McGraw-Hill Holding LLC 32 Kádár, A., et al., (2009), "Improved method for combination of immunocytochemistry and Nissl staining." Journal of neuroscience methods, 184(1), p 115-118 33 Kasture, V.S and S.B Kasture, (2006), "Bacopa monniera." Oriental Pharmacy and Experimental Medicine, 6(4), p 253-263 34 Kim, J.Y., et al., (2015), "Ilex latifolia prevents amyloid β protein (25–35)-induced memory impairment by inhibiting apoptosis and tau phosphorylation in mice." Journal of medicinal food, 18(12), p 1317-1326 35 Kulshreshtha, D and R Rastogi, (1973), "Identification of ebelin lactone from Bacoside A and the nature of its genuine sapogenin." Phytochemistry, 12(8), p 20742076 36 Kumar, A., S Dogra, and A Prakash, (2009), "Neuroprotective effects of Centella asiatica against intracerebroventricular colchicine-induced cognitive impairment and oxidative stress." International Journal of Alzheimer’s disease, 2009 37 Lattanzi, W., et al., (2013), "Gene expression profiling as a tool to investigate the molecular machinery activated during hippocampal neurodegeneration induced by trimethyltin (TMT) administration." International journal of molecular sciences, 14(8), p 16817-16835 38 Le, X.T., et al., (2013), "Bacopa monnieri ameliorates memory deficits in olfactory bulbectomized mice: possible involvement of glutamatergic and cholinergic systems." Neurochemical research, 38(10), p 2201-2215 39 Le, X.T., et al., (2015), "Protective effects of Bacopa monnieri on ischemia-induced cognitive deficits in mice: the possible contribution of bacopaside I and underlying mechanism." Journal of ethnopharmacology, 164, p 37-45 40 Lokanathan, Y., et al., (2016), "Recent updates in neuroprotective and neuroregenerative potential of Centella asiatica." The Malaysian journal of medical sciences: MJMS, 23(1), p 41 Man, S.C., et al., (2012), "Systematic review on the efficacy and safety of herbal medicines for vascular dementia." Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2012 42 Matsuyama, S.S., et al., (1989), "Colchicine and the blood brain barrier: Implications for Alzheimer patients." Age, 12(3), p 107-108 43 Matthews, D.G., et al., (2019), "Centella Asiatica Improves Memory and Promotes Antioxidative Signaling in 5XFAD Mice." Antioxidants, 8(12), p 630 44 Miller, A.M., et al., (2014), "Cues, context, and long-term memory: the role of the retrosplenial cortex in spatial cognition." Frontiers in human neuroscience, 8, p 586 45 Milner, B., L.R Squire, and E.R Kandel, (1998), "Cognitive neuroscience and the study of memory." Neuron, 20(3), p 445-468 46 Mook‐Jung, I., et al., (1999), "Protective effects of asiaticoside derivatives against beta‐amyloid neurotoxicity." Journal of neuroscience research, 58(3), p 417-425 47 Mundy, W.R and T.M Freudenrich, (2006), "Apoptosis of cerebellar granule cells induced by organotin compounds found in drinking water: involvement of MAP kinases." Neurotoxicology, 27(1), p 71-81 48 Penney, J., W.T Ralvenius, and L.-H Tsai, (2019), "Modeling Alzheimer’s disease with iPSC-derived brain cells." Molecular Psychiatry, p 1-20 49 Ritchie, H., (2018), What people die from? Our world in data 50 Roy, D.C., S.K Barman, and M.M Shaik, (2013), "Current updates on Centella asiatica: phytochemistry, pharmacology and traditional uses." Medicinal Plant Research, 3(4) 51 Ryan, D., et al., (2013), "Spatial learning impairments in PLB1 triple knock-in Alzheimer mice are task-specific and age-dependent." Cellular and molecular life sciences, 70(14), p 2603-2619 52 Sasaguri, H., et al., (2017), "APP mouse models for Alzheimer's disease preclinical studies." The EMBO journal, 36(17), p 2473-2487 53 Sirichoat, A., et al., (2015), "Effects of asiatic acid on spatial working memory and cell proliferation in the adult rat hippocampus." Nutrients, 7(10), p 8413-8423 54 Subathra, M., et al., (2005), "Emerging role of Centella asiatica in improving agerelated neurological antioxidant status." Experimental gerontology, 40(8-9), p 707-715 55 Thies, W and L Bleiler, (2013), Alzheimer’s Association (2013) Alzheimer’s disease facts and figures Alzheimers Dement 9: 208–245 56 Umka Welbat, J., et al., (2016), "Asiatic acid prevents the deleterious effects of valproic acid on cognition and hippocampal cell proliferation and survival." Nutrients, 8(5), p 303 57 W.Kowall, A.E.B.a.N.,(2011), The handbook of Alzheimer and other dementias 58 Wang, Z., et al., (2020), "Rhizoma Coptidis for Alzheimer’s Disease and Vascular Dementia: A Literature Review." Current vascular pharmacology 59 WHO, (2012), Dementia: a public health priority, in Dementia 60 WHO, (2015), Dementia 2015 61 Wu, Y.-Y., et al., (2013), "Lithium attenuates scopolamine-induced memory deficits with inhibition of GSK-3β and preservation of postsynaptic components." Journal of Alzheimer's Disease, 37(3), p 515-527 62 Xu, Y., et al., (2008), "Gotu Kola (Centella asiatica) extract enhances phosphorylation of cyclic AMP response element binding protein in neuroblastoma cells expressing amyloid beta peptide." Journal of Alzheimer's Disease, 13(3), p 341-349 63 Yamada, M., et al., (2011), "Ameliorative effects of yokukansan on learning and memory deficits in olfactory bulbectomized mice." Journal of ethnopharmacology, 135(3), p 737-746 64 Yolanda, D.A., et al., (2015), "The dose variations effect of Centella Asiatica ethanol extract on escape latency’s distance morris water maze after chronic electrical stress." KnE Life Sciences, p 146-153 65 Zhao, Q., et al., (2007), "Chotosan, a kampo formula, ameliorates chronic cerebral hypoperfusion-induced deficits in object recognition behaviors and central cholinergic systems in mice." Journal of pharmacological sciences, 103(4), p 360-373 66 Zweig, J.A., et al., (2020), "Loss of NRF2 leads to impaired mitochondrial function, decreased synaptic density and exacerbated age-related cognitive deficits." Experimental Gerontology, 131, p 110767 ... Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ PHƯƠNG MÃ SINH VIÊN: 1501403 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG SINH HỌC VÀ BƯỚC ĐẦU TÌM HIỂU CƠ CHẾ HĨA SINH CỦA RAU MÁ (Centella asiatica) TRÊN MƠ HÌNH CHUỘT NHẮT MẤT... hay bột Rau má? ?? Mặc dù có nhiều nghiên cứu tác dụng rau má, chưa có nghiên cứu đánh giá tác dụng tìm hiểu chế hóa sinh rau má hệ thần kinh, đặc biệt suy giảm trí nhớ mà nghiên cứu Rau má phần nhiều... hay thiếu hụt chất thần kinh Thể Lewy (LB) tích lũy bao gồm tế bào thần kinh, bạch cầu toan, tế bào thần kinh có hình cầu cổ điển có hình dạng đa bào hình thoi Các tế bào thần kinh LB chủ yếu bao