Nghiên cứu được thực hiện nhằm thu nhận và bán tinh sạch chitosanase từ chủng nấm mốc Aspergillus toxicarius. Enzyme được khảo sát pH trích ly để thu nhận bằng đệm acetate pH 4; 4,5; 5; 5,5 và đệm phosphate pH 6; 6,5; 7; 7,5. Enzyme chitosanase được bán tinh sạch bằng phương pháp kết tủa, sử dụng 2 dung môi là acetone, ethanol theo tỷ lệ 1:2; 1:3; 1:4 (v/v) và muối ammonium sulfate có nồng độ 30-80% (w/v). Thời gian bảo quản các loại dịch enzyme (thô, bán tinh sạch và enzyme cô đặc) được theo dõi trong 10 ngày ở nhiệt độ từ 2-4 °C. Quá trình sấy phun được khảo sát với nồng độ maltodextrin bổ sung 15; 20; 25% (w/v). Kết quả cho thấy, hoạt tính enzyme cao nhất khi tách chiết bằng đệm acetate pH 5,5; bán tinh sạch hiệu quả nhất với tỷ lệ enzyme:acetone 1:3 (v/v). Hoạt tính enzyme chitosanase thô ổn định trong khoảng thời gian 10 ngày bảo quản và khi bổ sung maltodextrin ở nồng độ 25% (w/v) sau sấy hoạt tính chitosanase cao nhất là 88,012 (UI/g).
Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Thực phẩm 19 (1) (2019) 59-68 NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THU NHẬN VÀ BÁN TINH SẠCH CHITOSANASE TỪ NẤM MỐC Aspergillus toxicarius Đào Thị Mỹ Linh*, Nguyễn Thị Quỳnh Mai, Nguyễn Thị Thùy Trang Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM *Email: linhdtm@cntp.edu.vn Ngày nhận bài: 03/7/2019; Ngày chấp nhận đăng: 06/9/2019 TÓM TẮT Nghiên cứu thực nhằm thu nhận bán tinh chitosanase từ chủng nấm mốc Aspergillus toxicarius Enzyme khảo sát pH trích ly để thu nhận đệm acetate pH 4; 4,5; 5; 5,5 đệm phosphate pH 6; 6,5; 7; 7,5 Enzyme chitosanase bán tinh phương pháp kết tủa, sử dụng dung môi acetone, ethanol theo tỷ lệ 1:2; 1:3; 1:4 (v/v) muối ammonium sulfate có nồng độ 30-80% (w/v) Thời gian bảo quản loại dịch enzyme (thô, bán tinh enzyme cô đặc) theo dõi 10 ngày nhiệt độ từ 2-4 °C Quá trình sấy phun khảo sát với nồng độ maltodextrin bổ sung 15; 20; 25% (w/v) Kết cho thấy, hoạt tính enzyme cao tách chiết đệm acetate pH 5,5; bán tinh hiệu với tỷ lệ enzyme:acetone 1:3 (v/v) Hoạt tính enzyme chitosanase thô ổn định khoảng thời gian 10 ngày bảo quản bổ sung maltodextrin nồng độ 25% (w/v) sau sấy hoạt tính chitosanase cao 88,012 (UI/g) Từ khóa: Aspergillus toxicarius, acetone, bán tinh sạch, chitosanase, ethanol MỞ ĐẦU Chitosanase nhóm enzym đặc biệt thủy phân chitosan để tạo chitooligomer monomer glucosamine N-acetyl-d-glucosamine Dựa phương thức hoạt động có hai loại enzyme chitosanase tìm hiểu gồm exo (EC 3.2.1.165) endochitosanase (EC 3.2.1.132) Endochitosanase thủy phânβ-1,4 liên kết đuôi Gln (glucosamine) chitosan bị acetyl hóa phần sử dụng để sản xuất chitooligosaccharides (COS) cách khử đuôi chitosan rong đó, exochitinase cơng chitosan từ đầu khơng khử COS chitosan để tạo Gln (glucosamine) N-acetyl-d-glucosamine (NAG) [1] Chitosanase thường cho có vai trị quan trọng phòng bệnh chống lại mầm bệnh xâm nhập có khả thủy phân polysaccharides vách tế bào nấm bệnh Ngoài ra, chitosanase sử dụng thủy phân chất chitosan chitin để tạo chitosan oligomer kích thước đặc trưng phù hợp với yêu cầu ngành công nghiệp dược phẩm, y sinh, nông nghiệp, công nghệ sinh học ngành công nghiệp thực phẩm [2] Chitosanase vi khuẩn nghiên cứu rộng rãi, đặc biệt từ Bacillus spp Streptomyces spp tính xúc tác, chế enzyme protein cấu trúc uy nhiên, so với chitosanase từ vi khuẩn, chitosanases xạ khuẩn, nấm nghiên cứu [3] Các enzyme thu nhận dạng sản phẩm khác chế phẩm thơ (trích ly từ mơi trường lên men), chế phẩm kỹ thuật hay bán tinh (đã tinh chế sơ bộ) tinh khiết (đã loại hoàn toàn protein enzyme tạp) để phục vụ nhu cầu đa dạng thị trường [4] Enzyme bán tinh thường thu nhận từ môi trường nuôi cấy theo quy trình sau: trích lý enzyme thơ, sau thực kết tủa sử dụng tác nhân dung môi hữu (ethanol, acetone), kết tủa điểm đẳng điện dùng muối ammonium 59 Đào Thị Mỹ Linh, Nguyễn Thị Quỳnh Mai, Nguyễn Thị Thùy Trang sulfate, tiếp tục cô đặc enzyme màng lọc tiếp tuyến [2] Hiện nay, nghiên cứu Aspergillus toxicarus chưa có nhiều công bố Do nghiên cứu thực nhằm đánh giá khả thu nhận enzyme chitosanase từ chủng nấm mốc NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu Chủng Aspergillus toxicarius có khả sinh tổng hợp enzyme chitosanase phân lập sàng lọc cung cấp từ ngân hàng giống Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm Tp Hồ Chí Minh Cám gạo trấu thu mua ây Ninh Chitosan mua từ Công ty NHH M V chitosan VN Số 23/6 Ngô hời Nhiệm, Tp Rạch Giá, Kiên Giang, Việt Nam Giống bào tử: hút 10 mL dung dịch tween 80 (0,1% v/v) khử trùng, cho vào ống giống thạch nghiêng có mơi trường PDA ni ủ ngày nhiệt độ từ 27-30 °C chứa nhiều bào tử, lắc đều, tách lớp bào tử mặt thạch chuyển dung dịch bào tử sang ống nghiệm vô trùng Mật độ bào tử xác định phương pháp buồng đếm hồng cầu đo mật độ quang bước sóng 610 nm tương ứng nồng độ pha loãng Dựng đường chuẩn tương quan giá trị OD mật độ bào tử Giá trị OD từ 1,5-1,6 mật độ đạt 107 bào tử/mL Bảo quản dịch bào tử nhiệt độ °C sử dụng Chuẩn bị môi trường bán rắn nuôi cấy Aspergillus toxicarius thu nhận chitosanase thô gồm 10 g chất cám gạo trấu theo tỷ lệ tương ứng 7:3 Bổ sung mL dung dịch muối khống (có thành phần gồm (g/L): NaNO3 1, K2HPO4 1, MgSO4.7H2O 1, NaCl chitosan 3) để ẩm độ mơi trường 50%, sau mơi trường hấp khử trùng nhiệt độ 121°C 15 phút Để nguội môi trường cấy dịch giống 1% (v/w), nuôi nhiệt độ phịng 72 [5] ly enzyme thô: nấm mốc sau thời gian nuôi cấy, enzyme trích ly từ giá thể lên men cách bổ sung 45 mL dung dịch đệm acetate 0,2 M, pH 5,5 lắc máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút 20 phút Lọc dịch qua giấy lọc, ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút 10 phút thu dung dịch enzyme thơ [5] Hóa chất dùng nghiên cứu gồm: Ethanol 96o, Glucosamin-HCl 96% (Viện Kiểm nghiệm thuốc rung ương); NaOH, NaNO3, KCl, KH2PO4, MgSO4.7H2O, FeSO4.7H2O, (NH4)2HPO4, NaCl, Na2HPO4, NaH2PO4, tween 80, CH3COOH, CH3COONa.3H2O, muối seignette (KNaC4H4O6.4H2O), DNS, (NH4)2SO4, acetone, H3PO4 (Trung Quốc); Coomassive Brilliant Blue (Đức), maltodextrin (Himedia) Các thiết bị sử dụng gồm: Nồi hấp tiệt trùng ALP, tủ cấy mốc, máy lắc LM-420D, máy đo pH Lab 845, cân điện tử số, máy đo quang phổ SP-300 Spectrophotometer, máy ly tâm Hermle Z206A, máy khuấy từ IKA C-MAG HS10, máy sấy phun LabPlant SD-06AG, thiết bị lọc tiếp tuyến (QuixStand System) cột lọc hollow fiber cartridge kích thước kDa 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng pH dịch trích ly đến hoạt tính enzyme chitosanase Bổ sung vào môi trường sau lên men 45 mL dung dịch trích ly có pH khảo sát 4,0; 4,5; 5,0; 5,5 (đệm acetate); 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 (đệm phosphate), lắc máy lắc với 60 Nghiên cứu trình thu nhận bán tinh chitosanase từ nấm mốc Aspergillus toxicarius tốc độ 150 vịng/20 phút nhiệt độ phịng Lọc dịch qua bơng thấm nước giấy lọc, thu dịch có chứa chitosanase thơ cần xác định hoạt tính enzyme 2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng tác nhân tủa trình tinh enzyme hêm vào 20 mL dịch enzyme thô tác nhân tủa: acetone ethanol tỷ lệ 1:2; 1:3; 1:4 (v/v); muối ammonium sulfate bổ sung theo phân đoạn 30-80% Ủ lạnh 2-4°C Ly tâm 4.000 vịng/15 phút Kết tủa thu được, hồn ngun với đệm acetate pH 5,5 thể tích ban đầu 20 mL Đối với mẫu kết tủa muối ammonium sulfate tiến hành thẩm tích màng cellophane (màng bán thấm) qua đêm (24 10 oC) nhằm loại bỏ hết muối Đánh giá hoạt tính enzyme hàm lượng protein 2.2.3 Khảo sát q trình đặc enzyme chitosanase phương pháp lọc tiếp tuyến Enzyme cô đặc: dịch enzyme thô cô đặc thiết bị lọc tiếp tuyến QuixStand System, sử dụng cột lọc cut-off kDa, với tốc độ bơm nhập liệu 85 vòng/phút điều ch nh cho áp suất bề mặt màng không 15 psi Dịch lọc màng (dòng retentate) sử dụng cho phần sấy phun tạo chế phẩm chitosanase dạng bột [6] 2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng thời gian bảo quản dịch enzyme chitosanase Dịch enzyme thô, dịch enzyme bán tinh lựa chọn thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tác nhân tủa dịch enzyme cô đặc sau lọc tiếp tuyến giữ lạnh nhiệt độ 2-4 °C vịng 10 ngày, hoạt tính enzyme chitosanase xác định thời gian bảo quản 2.2.5 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất trợ sấy đến hoạt tính enzyme chitosanase Tiến hành sấy phun dung dịch enzyme chitosanase cô đặc với thông số cố định: nhiệt độ vào 150 °C nhiệt độ 58 °C, tốc độ bơm nhập liệu 300mL/giờ, chất trợ sấy maltodextrin, nồng độ chất trợ sấy 15; 20 25% Đánh giá hoạt tính enzyme theo nghiệm thức khảo sát 2.2.6 Phương pháp phân tích Xác định hoạt tính enzyme chitosanase Một đơn vị hoạt độ (UI) chitosanase định nghĩa lượng enzyme xúc tác thủy phân chitosan, giải phóng µmol đường khử phút điều kiện phản ứng pH 5,5 [7] rong đó: H : Hoạt tính enzyme chitosanase (UI/mL), x: Lượng đường khử sinh (µmol/mL), F: Hệ số pha lỗng, V: thể tích dung dịch phản ứng (mL), v: Thể tích enzyme đem phản ứng (mL), t: Thời gian phản ứng (phút), 5: Hệ số quy đổi mL dịch enzyme Tiến hành xác định hoạt tính chitosanase: hỗn hợp phản ứng gồm 0,2 mL chitosanase thêm vào 0,8 mL dung dịch chitosan 0,3% pha đệm acetate 0,2M pH 5,5, để 37 oC, 60 phút Sau thêm mL DNS 1% Đun sôi phút, làm lạnh nhanh Ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút Lọc lấy dịch đo quang phổ bước sóng 540 nm Mẫu đối chứng tiến hành tương tự cho enzyme với DNS đun sôi phút để bất hoạt enzyme Dựa vào đường chuẩn glucosamine HCL xác định lượng đường khử sinh 61 Đào Thị Mỹ Linh, Nguyễn Thị Quỳnh Mai, Nguyễn Thị Thùy Trang Xác định hàm lượng protein Hàm lượng protein enzyme xác định phương pháp Bradford Các protein phản ứng với thuốc thử Bradford hình thành hợp chất màu có khả hấp thụ ánh sáng bước sóng 595 nm Cường độ màu tỷ lệ với nồng độ protein dung dịch Bovine serum albumin (BSA) sử dụng xây dựng đường chuẩn có hàm lượng protein từ 10-50 mg/mL, dựa vào đường chuẩn protein suy hàm lượng protein dung dịch mẫu phân tích [8] Xử lý số liệu: ất thí nghiệm lặp lại lần, số liệu thu nhận xử lý phần mềm Microsoft excel 2010, Statgraphics centurion XVI OriginPro 8.5 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hƣởng pH dịch trích ly đến hoạt tính enzyme chitosanase Mơi trường sau ni cấy trích ly thu enzyme với loại đệm pH khác Kết ghi nhận Hình cho thấy, trích ly đệm acetate pH 4,0; 4,5; 5,0 đệm phosphate pH 7,5 hoạt tính enzyme thu thấp, 0,348; 0,273; 0,261 0,309 UI/mL, hoạt tính thấp trích ly đệm acetate pH 5,0 Hoạt tính enzyme đạt cao trích ly đệm acetate pH 5,5 với hoạt tính 0,563 UI/mL (cao gấp 2,1 lần so với đệm acetate pH 5,0), tương đối cao trích ly đệm phosphate pH 6,0 với hoạt tính thu 0,417 UI/mL Khi trích ly đệm phosphate pH 6,5 7,0 hoạt tính enzyme thu 0,391 0,370 UI/mL 0,563 0,7 0,3 f b e 0,309 g 0,261 d 0,273 0,4 0,37 0,5 0,391 0,417 h 0,348 Ho¹t tÝnh Enzyme (UI/mL) 0,6 c a 0,2 0,1 0,0 4,5 5,5 6,5 7,5 pH trÝch ly Hình Ảnh hưởng pH dịch trích ly đến hoạt tính enzyme chitosanase Các ký tự abcdefgc giá trị trung bình cột, sai khác ký tự có ý nghĩa sai biệt mặt thống kê (p