Đang tải... (xem toàn văn)
Mục tiêu của đề tài: Phân lập, xác định một số đặc tính của virus gây bệnh Marek trên đàn gà nuôi công nghiệp đã được tiêm vắc xin phòng bệnh Marek nhưng vẫn có biểu hiện mắc bệnh tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. Đánh giá khả năng gây bệnh, đặc điểm gây bệnh lý của chủng virus phân lập được và nghiên cứu ứng dụng liệu pháp phối hợp chất tăng cường miễn dịch trong sử dụng vắc xin phòng bệnh Marek.
ĐẠI HỌC THÁI NGUN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM HÀ VĂN QUYẾT Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA VIRUS GÂY BỆNH MAREK Ở GÀ NI CƠNG NGHIỆP TẠI PHÍA BẮC VIỆT NAM VÀ GIẢI PHÁP NÂNG CAO HIỆU LỰC VẮC XIN PHỊNG BỆNH” TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ THÚ Y Luận án được hồn thành tại: TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÁI NGUN Người hướng dẫn khoa học: 1. GS.TS. Nguyễn Quang Tun Người hướng dẫn khoa học: 2. PGS.TS. Phạm Cơng Hoạt Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Đại học Họp tại: Trường Đại học Nơng Lâm Đại học Thái Ngun Vào hồi …… giờ … ngày… tháng ……năm 2017 Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Thư viện quốc gia Trung tâm học liệu Đại học Thái Ngun Thư viện trường Đại học Nơng Lâm Đại học Thái ngun DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Hà văn Quyết, Tạ Xuân Tề, Phạm Thi Tâm, Phạm Công Hoạt, Nguyễn Quang Tuyên “Phân lập và xác định độc lực của chủng virus gây bệnh Marek trên gà nuôi một số tỉnh miền Bắc” , tạp chí Nơng nghiệp và Phát triển nơng thơn số 240 năm 2014 Hà văn Quyết, Phạm Thi Tâm, Phạm Công Hoạt, Nguyễn Quang Tun “Xác định đặc tính gây bệnh của chủng virus gây bệnh trên gà ni”, tạp chí Nơng nghiệp và Phát triển nơng thơn số 282; 283 năm 2016 3. Hà văn Quyết, Phạm Thi Tâm, Phạm Cơng Hoạt, Nguyễn Quang Tun “Nghiên cứu ảnh hưởng của interferonđến khả năng tạo đáp ứng miễn dịch bảo hộ của vắc xin phịng bệnh Marek”, tạp chí Nơng nghiệp và Phát triển nơng thơn số 260 năm 2015 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Trong những năm qua, chăn ni gà nước ta có sự phát triển mạnh mẽ theo hướng chăn ni cơng nghiệp tập trung, đóng góp lớn cho sự phát triển kinh tế xã hội các địa phương. Theo báo cáo của Tổng cục Thống kê (2016), năm 2016 cả nước có khoảng 252 triệu con gà; với sản lượng trên 500 ngàn tấn thịt, 8,5 tỷ quả trứng, cho thu nhập khoảng 63 ngàn tỷ đồng, chiếm 29,5% trong tổng giá trị ngành nơng nghiệp, chiếm 3,15% trong GDP. Tuy nhiên, chăn ni gà cịn gặp nhiều rủi ro về giá cả, thị trường, đặc biệt là các loại dịch bệnh ln tiềm ẩn, ảnh hưởng nhiều tới hiệu sản xuất Một trong những căn bệnh khá phổ biến thường xun xảy ra trên đàn gà ni cơng nghiệp, đặc biệt là đàn gà đẻ, đó là bệnh Marek, do Gallid herpesvirus gây ra, virus thường tồn tại trên biểu mơ của nang lơng của gà nên có khả năng lây lan nhanh và mạnh qua đường hơ hấp Bệnh Marek có hai biểu hiện chính là gây tăng sinh các tổ chức lypmpho và suy giảm miễn dịch gà. Trên thực tế những năm gần đây một số trang trại chăn ni gà của nơng dân, cơng ty CP, Japfa comfeed,… ở miền Bắc tình hình nhiễm bệnh Marek khá phức tạp gây thiệt hại lớn cho người chăn ni. Qua thực tế cho thấy việc phịng bệnh cho đàn gà bằng vắc xin Marek nhập ngoại được các cơng ty và hộ chăn ni thực hiện tương đối đầy đủ, tuy nhiên đáp ứng miễn dịch của gà ở một số trang trại khơng cao, tỷ lệ bảo hộ của vắc xin chưa đảm bảo. Hiện tượng gà vẫn bị bệnh sau khi tiêm vắc xin Marek có nhiều ngun nhân trong đó ngun nhân kỹ thuật về sự phù hợp chủng là quan trọng. Các loại vắc xin hiện đang sử dụng được tạo ra từ những chủng kinh điển, sử dụng lâu dài trên tồn thế giới khơng hồn tồn phù hợp với các biến chủng mới, độc lực cao xuất hiện thường xun ở các vùng địa lý khác nhau [(Baigent SJ et al., 2006); (Schat KA và Baranowski E, 2007). Trong khi chưa có một vắc xin phù hợp, đáp ứng u cầu về hiệu quả bảo hộ thực tế, việc nâng cao hiệu quả của vắc xin thương mại hiện có là vấn đề cần được quan tâm. Gần đây, giải pháp sử dụng phối hợp vắc xin với các chất tăng cường đáp ứng miễn dịch, làm tăng khả năng bảo hộ chéo cho các biến chủng virus trên thực địa có những triển vọng khả quan và đang được ứng dụng rộng rãi. Vấn đề đặt ra là liệu có thể lựa chọn được chất tăng cường miễn dịch của vắc xin trong phịng bệnh Marek ở nước ta. Để bước đầu có những cơ sở khoa học và thực tiễn cho những ứng dụng này, chúng tơi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu một số đặc tính của virus gây bệnh Marek ở gà ni cơng nghiệp tại phía Bắc Việt Nam giải pháp nâng cao hiệu lực vắc xin phòng bệnh”. 2. Mục tiêu của đề tài Phân lập, xác định số đặc tính virus gây bệnh Marek trên đàn gà ni cơng nghiệp đã được tiêm vắc xin phịng bệnh Marek nhưng vẫn có biểu hiện mắc bệnh tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. Đánh giá khả năng gây bệnh, đặc điểm bệnh lý của chủng virus phân lập được và nghiên cứu ứng dụng liệu pháp phối hợp chất tăng cường miễn dịch trong sử dụng vắc xin phịng bệnh Marek. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài Nghiên cứu đặc tính sinh học và độc lực của chủng gây bệnh trên thực địa tại Việt Nam sẽ cung cấp cơ sở khoa học cơ bản nhất cho việc đánh giá diễn biến tình hình dịch bệnh Mareck ở nước ta, đồng thời chủng phân lập cũng là nguồn gene virus cho sự phát triển các nghiên cứu tiếp theo về sinh bệnh học, chẩn đốn phát hiện và chế tạo vắc xin phịng bệnh Marek. Kết quả đánh giá hiệu quả bảo hộ khi dùng phối hợp các chất tăng cường miễn dịch với vắc xin cung cấp cơ sở khoa học về đáp ứng miễn dịch học ở gia cầm (trong điều kiện thí nghiệm) và định hướng cho phát triển nhóm chất bổ trợ vắc xin trong tương lai. Mở ra một hướng nghiên cứu nâng cao hiệu quả phịng bệnh của vắc xin Marek nói riêng và vắc xin phịng bệnh virus phổ biến ở gia cầm nói chung (trong điều kiện thực địa) 3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Kết quả phân lập và xác định đặc tính sinh học của chủng virus Marek lưu hành Việt Nam có thể là nguồn gene phục vụ nghiên cứu mức độ tương đồng của chủng vắc xin và chế tạo vắc xin nội địa phịng bệnh Marek trong tương lai Kết quả thử nghiệm xác định chất bổ trợ có tác dụng tăng cường hiệu lực của vắc xin có ý nghĩa trước mắt là có thể ứng dụng kết hợp với vắc xin sẵn có làm tăng hiệu quả phịng bệnh Marek, giảm thiệt hại do bệnh này gây ra và tăng thu nhập cho người chăn ni, góp phần thúc đẩy ngành chăn ni gia cầm phát triển; kế đó có thể tiếp tục nghiên cứu lựa chọn chất tăng cường đáp ứng miễn dịch hiệu quả nhất, nâng cao hiệu quả của giải pháp phịng bệnh Marek. Thơng tin và tài liệu của đề tài có thể hỗ trợ nguồn thơng tin giúp người chăn nuôi và cán bộ thú y, các nhà quản lý và đào tạo cập nhật về bệnh Marek gà trong giai đoạn hiện nay Việt Nam nhằm hoạch định và thực hiện tốt hơn các biện pháp phịng chống bệnh với hiệu quả cao 4. Những đóng góp mới của đề tài Chủng virus MDV 6.13 là chủng virus gây bệnh Marek lần đầu tiên được phân lập và xác định đặc tính gene học, độc lực, gây bệnh cho gà ở Việt Nam Lần đầu tiên chúng tôi đánh giá hiệu quả bảo hộ thực tế của một loại vắc xin đa giá nhập ngoại bằng chủng virus phân lập tại Việt Nam Bước đầu khám phá khả năng sử dụng các chất bổ trợ tăng cường miễn dịch để nâng cao hiệu bảo hộ vắc xin thương mại, xác định được chất phối hợp nâng cao hiệu quả sử dụng vắc xin phịng bệnh Marek trên gà tại Việt Nam 5. Bố cục của luận án Luận án gồm 102 trang (khơng kể phần tài liệu tham khảo và phụ lục). Phần mở đầu 3 trang, tổng quan tài liệu 26 trang, nội dung và phương pháp nghiên cứu 11 trang, kết quả nghiên cứu và thảo luận 60 trang, kết luận và đề nghị 2 trang. Luận án có 21 bảng thể hiện kết quả nghiên cứu, 35 hình ảnh và biểu đồ, 131 tài liệu tham khảo (trong đó có 11 tài liệu tiếng việt và 120 tài liệu tiếng nước ngồi). Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU Chương NỘI DUNG, ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung nghiên cứu 2.1.1 Phân lập virus gây bệnh Marek gà ni cơng nghiệp số tỉnh phía Bắc Việt Nam 2.1.2. Nghiên cứu xác định độc lực và kết quả gây bệnh thực nghiệm của virus phân lập được trên các giống và lứa tuổi gà 2.1.3 Nghiên cứu đặc trưng gây bệnh lý virus phân lập gà thí nghiệm 2.1.4 Nghiên cứu thử nghiệm phối hợp chất bổ trợ tăng cường miễn dịch với vắc xin để tăng cường hiệu vắc xin phòng bệnh Marek 2.2 Đối tượng, nguyên liệu nghiên cứu 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu - Virus gây bệnh Marek phân lập mẫu bệnh phẩm gà nuôi công nghiệp nghi mắc bệnh Marek số địa phương phía Bắc Việt Nam Đáp ứng miễn dịch gà ni cơng nghiệp sau khi được tiêm phịng bằng vắc xin Marek kết hợp với các chất bổ trợ tăng cường miễn dịch 2.2.2 Nguyên vật liệu Trứng gà sạch được mua từ Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số I được ấp nở trong điều kiện sạch bệnh. Gà sau khi nở 1 ngày tuổi được sử dụng trong các thí nghiệm của nghiên cứu Bệnh phẩm được lấy từ gà có biểu hiện mắc bệnh Marek ở thành phố Hà Nội, tỉnh Vĩnh Phúc và Phú Thọ. Vắc xin đa giá MD Vac CFL chủng Rispens và HVT do hãng Zoetis Inc của Mỹ sản xuất, được nhập khẩu bởi cơng ty TNHH TM & DP Sang, thành phố Hồ Chí Minh Các chất tăng cường miễn dịch CPG ODN, Poly I:C, Interferon là các chất sinh tổng hợp nhập ngoại được sử dụng trong thí nghiệm 2.2.3 Mơi trường, hóa chất, thiết bị dùng nghiên cứu Các Kit ELISA (ELISA Kit, code: Catalog No. CSB E10071Ch, Flarebio Biotech LLC) Real time PCR kit (Cat No./ID: 218073, Qiagen) Các loại mơi trường Thơng dụng dùng trong nghiên cứu Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm: Các máy móc dụng cụ thí nghiệm thơng dụng; máy ly tâm, tủ cấy tế bào, máy chạy phản ứng PCR, máy đọc kết quả ELISA, nồi hấp tiệt trùng, kính hiển vi điện tử, tủ lạnh… có tại phịng thí nghiệm trường Đại học Nơng lâm Thái Ngun và khoa Cơng nghệ sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội 2.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 2.3.1 Địa điểm nghiên cứu Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên, Khoa Công nghệ sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội 3.3.2 Thời gian nghiên cứu Từ tháng 1/2013 7/2016 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp thu thập xử lý mẫu Các mẫu máu chống đơng, lách, thận, gan, lơng vũ được thu từ gà khoảng 60 100 ngày tuổi có biểu hiện điển hình của bệnh Marek được thu từ các trại gà ni tại các tỉnh Vĩnh Phúc, Phú Thọ và thành phố Hà Nội. Các đàn gà này đã được sử dụng vắc xin lúc 1 ngày tuổi. 12 Ở gà Ri tỷ lệ gà có biểu hiện mắc bệnh tương ứng là 100%; 90%; 66,67% 26,67%. Tỷ lệ chết là 53,33%; 43,33%; 33,33% và 3,33% Ở gà Lương Phượng tỷ lệ gà có biểu hiện mắc bệnh tương ứng là 100%; 100%; 83,33% và 56,67%. Tỷ lệ chết tương ứng là 73,33%; 50%; 43,33% và 6,67% Ở gà Ross 308 tỷ lệ gà có biểu hiện mắc bệnh tương ứng là 100%; 100%; 96,67% và 60%. Tỷ lệ chết tương ứng là 86,67%; 63,33%; 53,33và 26,67% Kết quả này cho thấy tỷ lệ gà mắc bệnh và gà chết giảm dần theo sự tăng lên ngày tuổi của gà. Mặt khác, các giống gà nhập ngoại mẫn cảm với virus gây bệnh Marek hơn so với gà nội địa ở tất cả các độ tuổi 13 Bảng 3.4. Mức độ gây bệnh của chủng MDV phân lập được trên các giống gà ở các độ tuổi khác nhau Giống gà Gà ri Số gà tỷ lệ có có biểu biểu Ngày hiện buổi bệnh bệnh Marek Marek (n) (%) Một ngày tuổi (n=30) 30 Một tuần tuổi (n=30) 27 Một tháng tuổi 20 (n=30) 3 tháng tuổi Triệu chứng của gà mắc bệnh Gà Lương Phượng Tỷ lệ Số gà Số gà tỷ lệ có các chết Tỷ lệ có biểu biểu triệu chết do hiện chứng bệnh bệnh Marek bệnh bệnh bệnh Marek (%) Marek Marek Marek (n) (n) (%) (%) Gầy ốm mào tái 100,00 Đi loạng choạng 100,00 100,00 Liệt, sê cánh 73,33 Liệt chân 20,00 Viêm mống mắt, mù 3,33 Gầy ốm mào tái 90,00 Đi loạng choạng 76,67 90,00 Liệt, sê cánh 43,33 Liệt chân 10,00 Viêm mống mắt, mù Gầy ốm mào tái 66,67 Đi loạng choạng 26,67 66,67 Liệt, sê cánh 26,67 Liệt chân 3,33 Viêm mống mắt, mù 26,67 Gầy ốm mào tái 26,67 Đi loạng choạng 13,33 16 13 10 53,33 43,33 33,33 30 100 30 100 25 83,33 17 56,67 Triệu chứng của gà mắc bệnh Gầy ốm mào tái Đi loạng choạng Liệt, sê cánh Liệt chân Viêm mống mắt, mù Gầy ốm mào tái Đi loạng choạng Liệt, sê cánh Liệt chân Viêm mống mắt, mù Gầy ốm mào tái Đi loạng choạng Liệt, sê cánh Liệt chân Viêm mống mắt, mù Gầy ốm mào tái Đi loạng choạng Gà Ross 308 Số gà Tỷ lệ Tỷ lệ các chết chết triệu do chứng bện bện bệnh h h Marek Mare Mare (%) k k (%) (n) Gầy ốm mào tái 100,00 Đi loạng choạng 100,00 100 Liệt, sê cánh 83,33 26 86,67 Liệt chân 53,33 Viêm mống mắt, mù 13,33 Gầy ốm mào tái 96,67 Đi loạng choạng 90,00 100 Liệt, sê cánh 53,33 19 63,33 Liệt chân 36,67 Viêm mống mắt, mù 3,33 Gầy ốm mào tái 76,67 Đi loạng choạng 33,33 96,67 Liệt, sê cánh 33,33 16 53,33 Liệt chân 30,00 Viêm mống mắt, mù 60 Gầy ốm mào tái 83,33 26,67 Đi loạng choạng 16,67 Tỷ lệ Số gà Số gà tỷ lệ có các Tỷ lệ chết có biểu biểu triệu chết do Triệu chứng hiện chứng bệnh của gà bệnh bệnh bệnh bệnh Marek mắc bệnh Marek Marek Marek Marek (%) (n) (n) (%) (%) 100,00 100,00 76,67 26,67 6,67 90,00 83,33 50,00 16,67 66,67 30,00 26,67 13,33 83,33 13,33 22 73,33 30 15 50 30 13 43,33 29 6,67 18 14 Giống gà Số gà tỷ lệ có có biểu biểu Ngày hiện buổi bệnh bệnh Marek Marek (n) (%) (n=30) Gà ri Triệu chứng của gà mắc bệnh Liệt, sê cánh Liệt chân Viêm mống mắt, mù Gà Lương Phượng Tỷ lệ Số gà Số gà tỷ lệ có các chết Tỷ lệ có biểu biểu triệu chết do hiện chứng bệnh bệnh Marek bệnh bệnh bệnh Marek (%) Marek Marek Marek (n) (n) (%) (%) 13,33 3,33 3,33 Triệu chứng của gà mắc bệnh Liệt, sê cánh Liệt chân Viêm mống mắt, mù Gà Ross 308 Số gà Tỷ lệ Tỷ lệ các chết chết triệu do chứng bện bện bệnh h h Marek Mare Mare (%) k k (%) (n) Liệt, sê cánh 13,33 Liệt chân 13,33 Viêm mống mắt, mù Tỷ lệ Số gà Số gà tỷ lệ có các Tỷ lệ chết có biểu biểu triệu chết do Triệu chứng hiện chứng bệnh của gà bệnh bệnh bệnh bệnh Marek mắc bệnh Marek Marek Marek Marek (%) (n) (n) (%) (%) 6,67 6,67 15 3.3 Biểu bệnh tích gà thí nghiệm chủng MDV phân lập gây nên 3.3.1 Biểu bệnh tích đại thể tổ chức gà thí nghiệm Trong nghiên cứu này, biểu bệnh tích chủng MDV6.13 gây cho gà thí nghiệm được phát hiện dựa trên sự xuất hiện các khối u và hiện tượng viêm, sưng dây thần kinh. Kết quả thu được thể hiện trong bảng 3.6 Bảng 3.6. Biểu hiện bệnh tích do MDV gây cho gà thí nghiệm Giống gà Số gà có bệnh tích điển hình (n) Tỷ lệ gà có bệnh tích điển hình (%) Gà Ri (n=120) 92 76,67 Gà Lương Phượn g (n=120) 109 90,83 Gà Ross 308 (n=120) 118 98,33 0 Đối chứng (n=40) Cơ quan có bệnh tích Gan Lách Thận Tim Dạ dày tuyến Thần kinh Gan Lách Thận Tim Dạ dày tuyến Thần kinh Gan Lách Thận Tim Dạ dày tuyến Thần kinh Gan Lách Thận Tim Tần suất xuất hiện bệnh tích (%) 76,67 72,50 42,50 14,17 12,50 9,17 90,83 85,00 66,67 25,83 27,50 32,50 98,33 84,17 80,83 35,00 30,83 45,83 16 Dạ dày tuyến Thần kinh Tỷ lệ gà có biểu hiện bệnh tích chiếm tới 76,67%, 90,83% và 98,33% tương ứng với các lơ gà Ri, Lương Phượng và Ross 308. Mặt khác, trong cùng một giống gà thì những biến đổi gan trong các trường hợp mổ khám chiếm tỷ lệ cao nhất, chiếm tới 76,67%, 90,83% và 98,33% tương ứng với các lơ gà Ri, Lương Phượng và Ross 308 (Hình 3.13) Hình 3.13. Hình ảnh bệnh tích ở các tổ chức của gà gây nhiễm với chủng MDV 6.13 (A. Dây thần kinh đùi sưng to; B. Dây thàn kinh xương chậu sưng to; D. Lách sưng to, có u kết hạt; E F.Gan sưng to, có u kết hạt, u lan tỏa; G; Ống dẫn trứng sưng to, u lan tỏa) 3.3.2 Biểu bệnh tích vi thể tổ chức gà thí nghiệm Trong nghiên cứu này, mẫu tổ chức vi thể của các mơ gan, thận, lách, tim, dạ dày tuyến, dây thần kinh được sử dụng để theo dõi những biến đổi sau khi gà được gây nhiễm với chủng MDV 6.13. Kết quả trình bày trong bảng 3.7 Bảng 3.7. Tần suất xuất hiện các tổn thương vi thể trong các tổ chức của gà thí nghiệm Lồi gà Gan Lách Thậ n Gà ri 93,33 86,67 33,33 (Đơn vị tính: %) Dạ Thầ dày n Tim tuyế kinh n đùi 20,00 20,00 26,67 17 Gà Lương Phượng 93,33 93,33 53,33 33,33 40,00 46,67 Bà Ross 308 100,0 100,0 53,33 40,00 53,33 53,33 Kết quả ở bảng 3.7 cho thấy: các tế bào lympho xâm nhiễm mạnh nhất hai cơ quan gan và lách, tỷ lệ xuất hiện gan là 93,33%, 93,33% 100%; lách 86,67%, 93,33% 100% tương ứng với các giống gà Ri, Lương Phượng, Ross 308. Theo dõi từng giống gà chúng tơi nhận thấy 100% gà Ross 308 đều có biểu hiện xâm nhiễm lympho trong gan và lách, điều này chứng tỏ giống gà này mẫn cảm với virus gây bệnh Marek hơn hai giống gà cịn lại Hình 3.25. Các biến đổi bệnh tích vi thể trong các tổ chức ở gà thí nghiệm: Gan (A), lách (B), thận (C), dây thần kinh (D) 3.3.3 Kết xác định khả gây bệnh phôi gà MDV phân lập Thí nghiệm trên phơi gà 11 ngày tuổi cho thấy, 100% phơi bị gây nhiễm với MDV 6.13 bị chết sau 24 72 giờ gây nhiễm (Bảng 3.8). Bên cạnh sự xuất hiện các nốt u màu trắng điển hình của MDV, các phơi đều có biểu hiện xuất huyết trên tồn thân. Bảng 3.8. Biểu hiện bệnh tích do MDV trên phơi gà 11 ngày tuổi Thí nghiệm Tỷ lệ phơi chết có bệnh tích (%) Thời gian bắt đầu gây chết phơi (gi ờ) Thời gian phơi chết hồn tồn (gi ờ) Trung bình số nốt u trên màng CAM MDV 6.13 (1000PFU/ml) (n=10) 100 24 giờ 72h 24,88 ± 1,27 18 Đối chứng âm (n=5) (*) Hình 3.22. Bệnh tích trên màng CAM phơi gà 14 tuổi do MDV gây nên (A: Màng CAM bình thường, B: Màng CAM với các nốt u trắng do MDV gây nên) 3.4 Kết nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố tăng cường miễn dịch đến hiệu bảo hộ vắc xin phòng bệnh Marek Sau 3 tháng theo dõi các lơ gà thí nghiệm với các cơng thức kết hợp tiêm vắc xin với các chất tăng cường miễn dịch, bao gồm: IFN, poly I:C, CpG ODN 1 ngày tuổi và sau đó gà được cơng cường độc với chủng MDV 6.13 với liều 2000 PFU/con ở 21 ngày tuổi chúng tơi đã thu được các kết quả về ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến hiệu quả bảo hộ của vắc xin phịng bệnh Marek trong bảng 3.10 Bảng 3.10. Ảnh hưởng các yếu tố tăng cường miễn dịch đến hiệu quả bảo hộ của vắc xin phịng bệnh Marek Bố trí thí nghiệm Tỷ lệ gà chết sau khi cơng cường độc (%) Gà Gà Gà Ri lương Ross phượng 308 Tỷ lệ gà có biểu hiện lâm sàng sau khi cơng cường độc (%) Gà Gà Ross Gà Ri lương 308 phượng 19 HVT/Rispens + 3,33 IFN 500 UI/con HVT/Rispens + 3,33 poly I:C 400 µg/con HVT/Rispens + CpG OND 10 0,00 µg/con HVT/Rispens + poly I:C 200 0,00 µg/con+CpG OND 5 µg/con Vắc xin đa giá 10,00 HVT/Rispens Khơng sử dụng vắc 70,00 xin 3,33 16,67 3,33 3,33 20,00 6,67 16,67 3,33 10,00 20,00 3,33 6,67 0,00 3,33 6,67 3,33 10,00 0,00 3,33 10,00 30,00 40,00 20,00 40,00 50,00 80,00 80,00 100,00 100,00 100,00 Qua bảng 3.10 cho thấy các lơ gà có sử dụng phối hợp các chất tăng cường miễn dịch có tỷ lệ gà được bảo hộ cao hơn so với lơ gà chỉ tiêm vắcxin, làm giảm tỷ lệ chết và tỷ lệ có biểu hiện lâm sàng. Nhìn chung các chất này đều có khả năng làm tăng hiệu quả bảo hộ của vắc xin đối với virus Marek có độc lực cao. Trong đó, vắc xin kết hợp với CpG ODN giúp lơ gà Ri khơng có con gà nào có biểu hiện lâm sàng và cũng khơng có con nào bị chết; tỷ lệ này tương ứng là 3,33% và 3,33% ở gà Lương Phượng; 6,67% và 6,67% ở gà Ross 308 3.4.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố tăng cường miễn dịch hình thành đáp ứng miễn dịch gà thí nghiệm với vắc xin phòng bệnh Marek 3.4.1.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố tăng cường miễn dịch hình thành kháng thể bảo hộ vắc xin phịng bệnh Marek Qua bảng 3.11 cho thấy, ở các lơ gà được tiêm vắc xin bổ sung CpG ODN và phức hợp poly I:C CpG ODN cho hiệu giá kháng thể trung hịa cao nhất trong ở tháng thứ hai của cả ba giống 20 gà, đạt 1280, ngưỡng hiệu giá này tiếp tục duy trì đến tháng thứ 3 đối với gà Lương Phượng và Ross 308 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến sự hình thành kháng thể bảo hộ của vắc xin phịng bệnh Marek Gà Ri Gà Lương Phượng Gà Ross 308 Cơng thức thí nghiệm Tháng Tháng Tháng Tháng Tháng Tháng Tháng Tháng Tháng thứ thứ thứ thứ thứ thứ thứ thứ thứ nhất hai ba hai ba nhất hai ba HVT/Rispens + IFN ϒ 640 320 320 640 640 320 640 320 320 500 UI/con HVT/Rispens + poly I:C 320 640 320 640 640 640 640 640 640 400 µg/con HVT/Rispens + CpG 640 1280 640 640 1280 640 1280 1280 640 OND 10 µg/con HVT/Rispens + poly I:C 200 µg/con +CpG 640 1280 640 640 1280 1280 640 1280 1280 OND 5 µg/con Vắc xin đa giá 230 320 320 320 640 320 640 320 320 HVT/Rispens Không sử dụng vắc xin 0 0 0 3.4.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố tăng cường miễn dịch đến hình thành khối u tổ chức gà thí nghiệm cơng cường độc Sau 3 tháng theo dõi thí nghiệm, tồn bộ gà thí nghiệm được mổ khám để xác định tần suất hình thành khối u Kết quả thí nghiệm được trình bày trong hình bảng 3.18 Bảng 3.18. Ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến sự hình thành khối u ở gà sau cơng cường độc (Tỷ lệ % gà có khối u) HVT/Rispens HVT/Rispens Vắc xin đa HVT/Rispens HVT/Rispens + poly I:C Đối chứng Giống gà + CpG giá + IFN ϒ + poly I:C 200 µg/con + khơng tiêm thí nghiệm ODN 10 HVT/Rispens 500 UI/con 400 µg/con CpG ODN 5 vắc xin µg/con µg/con Gà Ri 26,67 20,00 20,00 13,33 13,33 73,33 Gà 30,00 20,00 20,00 13,33 16,67 86,67 21 Lương Phượng Gà Ross 308 36,67 23,33 23,33 16,67 16,67 96,67 Qua bảng 3.18 chúng tơi nhận thấy: Ở gà được tiêm vắc xin kết hợp chất bổ trợ đã giúp giảm mạnh tỷ lệ gà có bệnh tích hình thành khối u sau khi cơng cường độc với chủng MDV 6.13, cụ thể: Các lơ gà sử dụng bổ sung IFN γ 500 UI/con và poly I:C 400 µg/con có mức độ giảm tần suất xuất khối u tương đương nhau, cụ thể: ở 3 giống gà Ri, Lương Phượng, Ross 308 là: 20%, 20% và 23,33%; Các lô gà sử dụng bổ sung CpG ODN 10 µg/con riêng lẻ hoặc kết hợp với poly I:C 400 µg/con cho mức độ giảm tần suất xuất khối u tương đương nhau: giống gà Ri, Lương Phượng, Ross 308 là: 13,33% và 16,67%. Như vậy, CpG ODN có hiệu quả hỗ trợ vắc xin ức chế sự hình thành khối u tốt hơn so với poly I:C và IFN. Kết quả này hồn tồn logic với các nghiên cứu của các nội dung trước về mức độ bảo hộ, hiệu giá kháng thể trung hòa và mức độ tổng hợp các Cytokine liên quan đến đáp ứng miễn dịch tự nhiên chống lại MDV. 3.4.3 Tỷ lệ giảm số copy gen Meq quan có chức miễn dịch gà thí nghiệm công cường độc sau sử dụng vắc xin chất tăng cường miễn dịch * Tỷ lệ giảm số copy gen Meq túi Fabricius Trong thí nghiệm này cho thấy, ở túi Fabricius, mức độ giảm các bản copy của gen Meq cũng phụ thuộc vào việc có hay khơng sử dụng chất tăng cường miễn dịch cũng như sử dụng bổ sung loại nào, kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 3.20 22 Bảng 3.20. Mức độ giảm các bản copy của gen Meq trong túi Fabricius Tháng theo dõi Vắc xin đa giá HVT/Rispens Giống gà Gà Ri Tháng thứ hai Tháng thứ ba HVT/Rispens + HVT/Rispens + poly I:C CpG 200 µg/con + CpG ODN 10 µg/con ODN 5 µg/con Số Số bản Số bản Số lần lần copy copy giảm giảm 12.836.82 12.854.90 99,54 99,40 7 13.183.49 13.341.95 99,35 98,17 11.038.30 11.493.65 99,20 95,27 20.961.49 21.193.07 99,75 98,66 10.586.19 10.814.20 99,60 97,50 1 1.277.777.77 1.309.780.00 1.095.000.00 2.090.909.09 1.054.384.61 Đối chứng âm Số lần giảm Số bản copy Số lần giảm Số bản copy Số lần giảm 18.267.016 69,95 15.978.214 79,97 13.941.929 91,65 54,18 17.569.148 74,55 15.369.397 85,22 50,35 14.967.195 73,16 13.309.833 82,27 83,93 23.417.058 89,29 21.885.169 95,54 71,30 13.529.894 77,93 11.381.527 92,64 64,11 12.059.100 68,79 9.515.318 87,18 8.343.849 99,42 8.589.205 96,58 829.545.455 87,48 17.040.824 89,98 15.886.172 96,52 15.362.52 99,81 15.494.47 98,96 1.533.333.33 77,12 9.789.176 77,79 8.089.876 94,13 7.639.446 99,68 8.147.871 93,46 761.500.000 64,93 8.851.346 69,50 7.032.909 87,47 6.433.471 95,62 6.922.117 88,87 615.168.539 24.912.535 Gà Lương 14.788.003 Phượng Gà Ross 12.939.408 308 Gà Ri HVT/Rispens + poly I:C 400 µg/con Số bản copy Tháng Gà Lương 24.174.603 thứ nhất Phượng Gà Ross 21.747.766 308 Gà Ri HVT/Rispens + IFN ϒ 500UI/con 17.527.816 Gà Lương 9.874.222 Phượng Gà Ross 9.474.334 308 23 Từ kết quả bảng 3.20 cho thấy, các lơ gà chỉ sử dụng vắc xin, tỷ lệ giảm số bản copy của gen Meq trong túi Fabricius trong 3 tháng thí nghiệm gà Ri là 69,95%, 83,93%, 87,48%; gà Lương Phượng là: 54,18%, 71,30%, 77,12%; gà Ross 308 là 50,35%, 64,11%, 64,93%. Các lô gà sử dụng kết hợp vắc xin và CpG ODN 5 µg/con cho tỷ lệ giảm trong ba tháng theo dõi số bản copy gen Meq trong túi Fabricius đạt cao nhất, cụ thể: ở các lơ gà Ri đạt 99,54 99,81%, gà Lương Phượng đạt 99,35 99,68% và gà Ross 308 đạt 99,2 99,42%. Các lơ gà sử dụng bổ sung IFN γ 500 UI/con không làm giảm số bản copy túi Fabricius của gen Meq đáng kể so với lô gà chỉ sử dụng vắc xin * Tỷ lệ giảm số copy gen Meq tuyến ức gà thí nghiệm cơng cường độc sau sử dụng vắc xin chất tăng cường miễn dịch 24 Bảng 3.21. Mức độ giảm số bản copy của gen Meq trong tuyến ức của gà thí nghiệm cơng cường độc sau khi sử dụng vắc xin và các chất tăng cường miễn dịch Tháng theo dõi Tháng thứ nhất Tháng thứ hai Tháng thứ ba Vắc xin đa giá HVT/Rispens Giống gà Gà Ri Gà Lương Phượng Gà Ross 308 Gà Ri Gà Lương Phượng Gà Ross 308 Gà Ri Gà Lương Phượng Gà Ross 308 HVT/Rispens + IFN ϒ 500UI/con HVT/Rispens + poly I:C 400 µg/con HVT/Rispens + HVT/Rispens + poly I:C CpG 200 µg/con + CpG ODN 10 µg/con ODN 5 µg/con Đối chứng âm Số Số Số bản Số bản copy lần lần copy giảm giảm 14.627.712 99,49 14.649.800 99,34 1.455.311.111 Số bản copy Số lần giảm 21.717.820 67,01 Số Số bản Số lần Số bản copy lần copy giảm giảm 18.655.443 78,01 16.020.598 90,84 18.490.084 50,93 12.946.109 72,74 11.188.072 84,17 25.681.586 30.181.326 48,85 69,87 17.339.951 72,35 15.349.877 81,73 12.650.453 99,17 13.187.695 95,13 1.254.545.455 26.389.303 79,91 23.013.961 91,63 21.185.144 99,54 21.630.621 97,49 2.108.769.231 18.581.158 40,18 13.828.318 53,99 11.909.385 20.044.749 77,25 75,98 11.468.462 80,22 10.013.061 91,88 9.234.166 99,63 9.404.068 97,83 920.000.000 18.853.677 80,78 16.318.440 93,33 15.286.560 99,63 15.540.816 98,00 1.523.000.000 8.790.913 62,98 8.642.705 64,06 6.117.022 90,51 5.565.457 99,48 6.191.587 89,42 553.651.685 6.144.517 60,07 5.654.123 65,28 4.304.888 85,74 3.884.866 95,01 4.226.994 87,32 369.101.124 8.818.697 84,66 9.482.429 7.529.154 99,31 9.605.263 98,04 99,16 7.875.432 94,80 941.700.000 746.590.909 25 Qua theo dõi kết quả trên, ở tuyến ức, các lô gà chỉ sử dụng vắc xin, tỷ lệ giảm số bản copy của gen Meq trong tuyến ức trong 3 tháng thí nghiệm ở gà Ri là 67,01 75,98%, gà Lương Phượng là: 40,18 62,98%; gà Ross 308 là 48,85 77,25%. Các lơ gà sử dụng kết hợp vắc xin và CpG ODN 5 µg/con cũng cho tỷ lệ giảm số bản copy gen Meq đạt cao nhất, cụ thể: các lơ gà Ri đạt 99,49 99,63%, gà Lương Phượng đạt 99,16 99,48% và gà Ross 308 đạt 95,01 99,63 Như vậy, qua các kết quả xác định tỷ lệ giảm số bản copy gen Meq trong lách, túi Fabricius tuyến ức gà thí nghiệm cơng cường độc sau khi sử dụng vắc xin và các chất tăng cường miễn dịch, số bản copy của gen Meq tỷ lệ thuận với số lượng virus có trong mơ phân tích và tốc độ nhân lên của virus. Các kết quả cũng cho thấy CpG ODN có hiệu quả cao nhất trong việc ức chế sự nhân lên của MDV trong cơ thể gà thí nghiệm. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Từ những kết quả của đề tài luạn án đã thu được như trên, chúng tơi có một số kết luận sau: 1.1. Phân lập virus Marek Đã phân lập chủng virus Marek (MDV 6.13) gây bệnh cho gà tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam, chủng virus này phát triển ổn định sau 3 đời ni cấy trên tế bào xơ phơi vịt và có hiệu giá là 3x107PFU/ml Đã xác định được trình tự gen Meq của chủng MDV 6.13 tương đồng tới 95,0% so với gen Meq của Gallid herpesvirus của Gene bank. Chủng MDV 6.13 phân lập có đặc tính di truyền gần giống với chủng virus Marek độc lực cao lưu hành tại Trung Quốc. 1.2. Về độc lực và khả năng gây bệnh Chủng MDV 6.13 có độc lực mạnh,ổn định, có khả năng gây bệnh cho gà mọi lứa tuổi và các giống gà. Gà Ri có sức đề kháng với virus gây bệnh Marek cao hơn giống gà Lương Phượng và Ross 308 nhập ngoại. 26 Gà được gây bệnh thí nghiệm với chủng MDV 6.13 có biểu hiện triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đặc trưng như các tài liệu trong và ngồi nước đã mơ tả. Gà mắc bệnh Marek sống sót thải trùng ở mức cao đến 3 tháng 1.3. Về gây tổn thương bệnh lý của chủng virus MDV 6.13 Các biến đổi bệnh lý đặc trưng ở gà thí nghiệm là sự xuất hiện khối u ở nội tạng, tỷ lệ cao nhất là ở gan (từ 93,33 100%); sau đó đến lách (86,67 100%), thấp nhất là ở thận (33,33 53,33%) và dây thần kinh bị viêm, sưng to, phình đoạn với tỷ lệ từ 26,67 53,33%. Bệnh tích xuất hiện tổ chức phụ thuộc vào giống gà, thấp gà Ri (76,67%), cao gà Lương Phượng (90,83%) và cao nhất là ở gà Ross 308 (98,33%). Các tổn thương vi thể chủ yếu là xâm lấn tế bào lympho vào các tổ chức, nhiều nhất là ở gan và lách. Mức độ xâm nhiễm tế bào lympho vào các tổ chức phụ thuộc vào giống gà, trong đó thấp nhất ở gà Ri và cao nhất ở gà Ross 308 Chủng virus Marek MDV 6.13 gây nhiễm vào phơi gà 9 ngày tuổi gây chết 100% phơi sau 24 72 giờ Trên tế bào xơ phơi vịt một lớp, virus Marek phân lập hủy hoại tế bào mạnh nhất sau 96 giờ ni cấy và tới 96 98% với liều gây nhiễm 1.000 PFU/ml 1.4. Nâng cao hiệu quả phịng bệnh bằng vắc xin Phối hợp tiêm vắc xin với chất tăng cường miễn dịch như IFN γ, CpG ODN, Poly I:C phịng bệnh Marek cho gà đã làm tăng tỷ lệ bảo hộ, giảm mức độ nhân lên của virus và giảm mức độ tổn thương ở gà bệnh; trong đó CpG ODN cho hiệu quả cao nhất. Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu độc lực của virus phân lập được từ các ổ dịch đã được tiêm phịng vắc xin để có cơ sở lựa chọn vắc xin phịng bệnh phù hợp. Xác định liều lượng, thời điểm, phương thức bổ sung CpG ODN với vắc xin để đạt được hiệu lực phòng bệnh Marek cao nhất. ... số? ?đặc? ?tính? ?của? ?virus? ?gây? ?bệnh? ?Marek? ?ở? ?gà? ?ni cơng? ?nghiệp? ?tại phía Bắc? ? Việt Nam giải pháp? ? nâng cao hiệu lực vắc xin phòng? ?bệnh? ??. 2. Mục tiêu? ?của? ?đề tài Phân lập, xác định số. .. nghiên cứu 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu - Virus gây bệnh Marek phân lập mẫu bệnh phẩm gà nuôi công nghiệp nghi mắc bệnh Marek số địa phương phía Bắc Việt Nam Đáp ứng miễn dịch ? ?gà? ?ni cơng? ?nghiệp? ?sau khi được ... bệnh Marek gà nuôi cơng nghiệp số tỉnh phía Bắc Việt Nam 2.1.2.? ?Nghiên? ?cứu? ?xác định độc? ?lực? ?và? ?kết quả ? ?gây? ?bệnh? ?thực nghiệm? ?của? ?virus? ?phân lập được trên các giống? ?và? ?lứa tuổi? ?gà 2.1.3 Nghiên cứu