Nghiên cứu một số đặc tính của virus gây bệnh Marek ở gà nuôi công nghiệp tại phía Bắc Việt Nam và giải pháp nâng cao hiệu lực vắc xin phòng bệnh (tt)Nghiên cứu một số đặc tính của virus gây bệnh Marek ở gà nuôi công nghiệp tại phía Bắc Việt Nam và giải pháp nâng cao hiệu lực vắc xin phòng bệnh (tt)Nghiên cứu một số đặc tính của virus gây bệnh Marek ở gà nuôi công nghiệp tại phía Bắc Việt Nam và giải pháp nâng cao hiệu lực vắc xin phòng bệnh (tt)Nghiên cứu một số đặc tính của virus gây bệnh Marek ở gà nuôi công nghiệp tại phía Bắc Việt Nam và giải pháp nâng cao hiệu lực vắc xin phòng bệnh (tt)Nghiên cứu một số đặc tính của virus gây bệnh Marek ở gà nuôi công nghiệp tại phía Bắc Việt Nam và giải pháp nâng cao hiệu lực vắc xin phòng bệnh (tt)Nghiên cứu một số đặc tính của virus gây bệnh Marek ở gà nuôi công nghiệp tại phía Bắc Việt Nam và giải pháp nâng cao hiệu lực vắc xin phòng bệnh (tt)Nghiên cứu một số đặc tính của virus gây bệnh Marek ở gà nuôi công nghiệp tại phía Bắc Việt Nam và giải pháp nâng cao hiệu lực vắc xin phòng bệnh (tt)Nghiên cứu một số đặc tính của virus gây bệnh Marek ở gà nuôi công nghiệp tại phía Bắc Việt Nam và giải pháp nâng cao hiệu lực vắc xin phòng bệnh (tt)Nghiên cứu một số đặc tính của virus gây bệnh Marek ở gà nuôi công nghiệp tại phía Bắc Việt Nam và giải pháp nâng cao hiệu lực vắc xin phòng bệnh (tt)Nghiên cứu một số đặc tính của virus gây bệnh Marek ở gà nuôi công nghiệp tại phía Bắc Việt Nam và giải pháp nâng cao hiệu lực vắc xin phòng bệnh (tt)
Trang 1HÀ VĂN QUYẾT
Tên đề tài:
“NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA VIRUS GÂY BỆNH MAREK Ở GÀ NUÔI CÔNG NGHIỆP TẠI PHÍA BẮC VIỆT NAM VÀ GIẢI PHÁP NÂNG CAO HIỆU LỰC
VẮC XIN PHÒNG BỆNH”
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ THÚ Y
THÁI NGUYÊN - 2017
Trang 2Người hướng dẫn khoa học: 1 GS.TS Nguyễn Quang Tuyên
Người hướng dẫn khoa học: 2 PGS.TS Phạm Công Hoạt
Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận
án cấp Đại học
Họp tại: Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên
Vào hồi …… giờ … ngày… tháng ……năm 2017
Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
Trang 3- Thư viện trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái nguyên
Trang 41 Hà văn Quyết, Tạ Xuân Tề, Phạm Thi Tâm, Phạm Công Hoạt,
Nguyễn Quang Tuyên “Phân lập và xác định độc lực của chủng
virus gây bệnh Marek trên gà nuôi ở một số tỉnh miền Bắc”, tạp chí
Nông nghiệp và Phát triển nông thôn số 240 năm 2014
2 Hà văn Quyết, Phạm Thi Tâm, Phạm Công Hoạt, Nguyễn Quang
Tuyên “Xác định đặc tính gây bệnh của chủng virus gây bệnh trên
gà nuôi”, tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn số 282; 283
năm 2016
3 Hà văn Quyết, Phạm Thi Tâm, Phạm Công Hoạt, Nguyễn Quang
Tuyên “Nghiên cứu ảnh hưởng của interferonđến khả năng tạo đáp
ứng miễn dịch bảo hộ của vắc xin phòng bệnh Marek”, tạp chí Nông
nghiệp và Phát triển nông thôn số 260 năm 2015
Trang 5MỞ ĐẦU
1 Tính cấp thiết của đề tài
Trong những năm qua, chăn nuôi gà ở nước ta có sự phát triểnmạnh mẽ theo hướng chăn nuôi công nghiệp tập trung, đóng góp lớncho sự phát triển kinh tế xã hội ở các địa phương Theo báo cáo củaTổng cục Thống kê (2016), năm 2016 cả nước có khoảng 252 triệucon gà; với sản lượng trên 500 ngàn tấn thịt, 8,5 tỷ quả trứng, cho thunhập khoảng 63 ngàn tỷ đồng, chiếm 29,5% trong tổng giá trị ngànhnông nghiệp, chiếm 3,15% trong GDP Tuy nhiên, chăn nuôi gà còngặp nhiều rủi ro về giá cả, thị trường, đặc biệt là các loại dịch bệnhluôn tiềm ẩn, ảnh hưởng nhiều tới hiệu quả sản xuất Một trong nhữngcăn bệnh khá phổ biến thường xuyên xảy ra trên đàn gà nuôi côngnghiệp, đặc biệt là đàn gà đẻ, đó là bệnh Marek, do Gallid herpesvirusgây ra, virus thường tồn tại trên biểu mô của nang lông của gà nên cókhả năng lây lan nhanh và mạnh qua đường hô hấp
Bệnh Marek có hai biểu hiện chính là gây tăng sinh các tổchức lypmpho và suy giảm miễn dịch ở gà Trên thực tế những nămgần đây một số trang trại chăn nuôi gà của nông dân, công ty CP,Japfa comfeed,… ở miền Bắc tình hình nhiễm bệnh Marek khá phứctạp gây thiệt hại lớn cho người chăn nuôi Qua thực tế cho thấy việcphòng bệnh cho đàn gà bằng vắc xin Marek nhập ngoại được cáccông ty và hộ chăn nuôi thực hiện tương đối đầy đủ, tuy nhiên đápứng miễn dịch của gà ở một số trang trại không cao, tỷ lệ bảo hộ củavắc xin chưa đảm bảo Hiện tượng gà vẫn bị bệnh sau khi tiêm vắcxin Marek có nhiều nguyên nhân trong đó nguyên nhân kỹ thuật về
sự phù hợp chủng là quan trọng Các loại vắc xin hiện đang sử dụngđược tạo ra từ những chủng kinh điển, sử dụng lâu dài trên toàn thếgiới không hoàn toàn phù hợp với các biến chủng mới, độc lực cao
Trang 6xuất hiện thường xuyên ở các vùng địa lý khác nhau [(Baigent SJ etal., 2006); (Schat KA và Baranowski E, 2007)
Trong khi chưa có một vắc xin phù hợp, đáp ứng yêu cầu vềhiệu quả bảo hộ thực tế, việc nâng cao hiệu quả của vắc xin thươngmại hiện có là vấn đề cần được quan tâm Gần đây, giải pháp sửdụng phối hợp vắc xin với các chất tăng cường đáp ứng miễn dịch,làm tăng khả năng bảo hộ chéo cho các biến chủng virus trên thựcđịa có những triển vọng khả quan và đang được ứng dụng rộng rãi.Vấn đề đặt ra là liệu có thể lựa chọn được chất tăng cường miễn dịchcủa vắc xin trong phòng bệnh Marek ở nước ta Để bước đầu cónhững cơ sở khoa học và thực tiễn cho những ứng dụng này, chúng
tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu một số đặc tính của virus gây bệnh Marek ở gà nuôi công nghiệp tại phía Bắc Việt Nam và giải pháp nâng cao hiệu lực vắc xin phòng bệnh”
2 Mục tiêu của đề tài
Phân lập, xác định một số đặc tính của virus gây bệnh Marektrên đàn gà nuôi công nghiệp đã được tiêm vắc xin phòng bệnhMarek nhưng vẫn có biểu hiện mắc bệnh tại một số tỉnh phía BắcViệt Nam Đánh giá khả năng gây bệnh, đặc điểm bệnh lý của chủngvirus phân lập được và nghiên cứu ứng dụng liệu pháp phối hợp chấttăng cường miễn dịch trong sử dụng vắc xin phòng bệnh Marek
3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài
- Nghiên cứu đặc tính sinh học và độc lực của chủng gây bệnhtrên thực địa tại Việt Nam sẽ cung cấp cơ sở khoa học cơ bản nhấtcho việc đánh giá diễn biến tình hình dịch bệnh Mareck ở nước ta,đồng thời chủng phân lập cũng là nguồn gene virus cho sự phát triểncác nghiên cứu tiếp theo về sinh bệnh học, chẩn đoán phát hiện vàchế tạo vắc xin phòng bệnh Marek
Trang 7- Kết quả đánh giá hiệu quả bảo hộ khi dùng phối hợp các chấttăng cường miễn dịch với vắc xin cung cấp cơ sở khoa học về đápứng miễn dịch học ở gia cầm (trong điều kiện thí nghiệm) và địnhhướng cho phát triển nhóm chất bổ trợ vắc xin trong tương lai Mở ramột hướng nghiên cứu nâng cao hiệu quả phòng bệnh của vắc xinMarek nói riêng và vắc xin phòng bệnh virus phổ biến ở gia cầm nóichung (trong điều kiện thực địa).
3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
- Kết quả phân lập và xác định đặc tính sinh học của chủngvirus Marek lưu hành ở Việt Nam có thể là nguồn gene phục vụnghiên cứu mức độ tương đồng của chủng vắc xin và chế tạo vắc xinnội địa phòng bệnh Marek trong tương lai
- Kết quả thử nghiệm xác định chất bổ trợ có tác dụng tăng cườnghiệu lực của vắc xin có ý nghĩa trước mắt là có thể ứng dụng kết hợp vớivắc xin sẵn có làm tăng hiệu quả phòng bệnh Marek, giảm thiệt hại dobệnh này gây ra và tăng thu nhập cho người chăn nuôi, góp phần thúcđẩy ngành chăn nuôi gia cầm phát triển; kế đó có thể tiếp tục nghiên cứulựa chọn chất tăng cường đáp ứng miễn dịch hiệu quả nhất, nâng caohiệu quả của giải pháp phòng bệnh Marek
- Thông tin và tài liệu của đề tài có thể hỗ trợ nguồn thông tingiúp người chăn nuôi và cán bộ thú y, các nhà quản lý và đào tạo cậpnhật về bệnh Marek ở gà trong giai đoạn hiện nay ở Việt Nam nhằmhoạch định và thực hiện tốt hơn các biện pháp phòng chống bệnh vớihiệu quả cao
4 Những đóng góp mới của đề tài
- Chủng virus MDV 6.13 là chủng virus gây bệnh Marek lầnđầu tiên được phân lập và xác định đặc tính gene học, độc lực, gâybệnh cho gà ở Việt Nam
Trang 8- Lần đầu tiên chúng tôi đánh giá hiệu quả bảo hộ thực tế của mộtloại vắc xin đa giá nhập ngoại bằng chủng virus phân lập tại Việt Nam.
- Bước đầu khám phá khả năng sử dụng các chất bổ trợ tăngcường miễn dịch để nâng cao hiệu quả bảo hộ của vắc xin thươngmại, xác định được chất phối hợp nâng cao hiệu quả sử dụng vắc xinphòng bệnh Marek trên gà tại Việt Nam
5 Bố cục của luận án
Luận án gồm 102 trang (không kể phần tài liệu tham khảo và phụlục) Phần mở đầu 3 trang, tổng quan tài liệu 26 trang, nội dung vàphương pháp nghiên cứu 11 trang, kết quả nghiên cứu và thảo luận 60trang, kết luận và đề nghị 2 trang Luận án có 21 bảng thể hiện kết quảnghiên cứu, 35 hình ảnh và biểu đồ, 131 tài liệu tham khảo (trong đó có
11 tài liệu tiếng việt và 120 tài liệu tiếng nước ngoài)
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Chương 2 NỘI DUNG, ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nội dung nghiên cứu
2.1.1 Phân lập virus gây bệnh Marek ở gà nuôi công nghiệp tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam
2.1.2 Nghiên cứu xác định độc lực và kết quả gây bệnh thực nghiệm của virus phân lập được trên các giống và lứa tuổi gà
Trang 92.1.3 Nghiên cứu các đặc trưng gây bệnh lý của virus phân lập được đối với gà thí nghiệm
2.1.4 Nghiên cứu thử nghiệm phối hợp chất bổ trợ tăng cường miễn dịch với vắc xin để tăng cường hiệu quả của vắc xin phòng bệnh Marek
2.2 Đối tượng, nguyên liệu nghiên cứu
2.2.1 Đối tượng nghiên cứu
- Virus gây bệnh Marek phân lập được ở mẫu bệnh phẩm của
gà nuôi công nghiệp nghi mắc bệnh Marek tại một số địa phươngphía Bắc Việt Nam
- Đáp ứng miễn dịch ở gà nuôi công nghiệp sau khi được tiêmphòng bằng vắc xin Marek kết hợp với các chất bổ trợ tăng cườngmiễn dịch
2.2.2 Nguyên vật liệu
- Trứng gà sạch được mua từ Công ty Vắc xin và Sinh phẩm
số I được ấp nở trong điều kiện sạch bệnh Gà sau khi nở 1 ngày tuổiđược sử dụng trong các thí nghiệm của nghiên cứu
- Bệnh phẩm được lấy từ gà có biểu hiện mắc bệnh Marek ởthành phố Hà Nội, tỉnh Vĩnh Phúc và Phú Thọ
- Vắc xin đa giá MD - Vac CFL chủng Rispens và HVT dohãng Zoetis Inc của Mỹ sản xuất, được nhập khẩu bởi công tyTNHH TM & DP Sang, thành phố Hồ Chí Minh
- Các chất tăng cường miễn dịch CPG ODN, Poly I:C,Interferon - là các chất sinh tổng hợp nhập ngoại được sử dụngtrong thí nghiệm
2.2.3 Môi trường, hóa chất, thiết bị dùng trong nghiên cứu
- Các Kit ELISA (ELISA Kit, code: Catalog No CSB - E10071Ch,Flarebio Biotech LLC)
Trang 10- Real - time PCR kit (Cat No./ID: 218073, Qiagen).
- Các loại môi trường Thông dụng dùng trong nghiên cứu
- Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm: Các máy móc dụng cụ thínghiệm thông dụng; máy ly tâm, tủ cấy tế bào, máy chạy phản ứngPCR, máy đọc kết quả ELISA, nồi hấp tiệt trùng, kính hiển vi điện
tử, tủ lạnh… có tại phòng thí nghiệm trường Đại học Nông lâm TháiNguyên và khoa Công nghệ sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội
2.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.3.1 Địa điểm nghiên cứu
Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên, Khoa Công nghệ sinh học
- Viện Đại học Mở Hà Nội
3.3.2 Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 1/2013 - 7/2016
2.4 Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Phương pháp thu thập và xử lý mẫu
Các mẫu máu chống đông, lách, thận, gan, lông vũ được thu từ
gà khoảng 60 - 100 ngày tuổi có biểu hiện điển hình của bệnh Marekđược thu từ các trại gà nuôi tại các tỉnh Vĩnh Phúc, Phú Thọ và thànhphố Hà Nội Các đàn gà này đã được sử dụng vắc xin lúc 1 ngày tuổi.Các mẫu sau khi lấy được cho vào ống nghiệm và túi nylon vô trùngbảo quản lạnh và nhanh chóng đưa về phòng thí nghiệm
2.4.2 Các phương pháp nghiên cứu và bố trí thí nghiệm
- Phân lập virus Marek bằng phương pháp nuôi cấy trên tế bào
sơ phôi vịt
- Phương pháp tiêm truyền qua phôi trứng để xác định độc lựccủa virus gây bệnh Marek
- Phản ứng PCR xác định gen Meq gây hình thành khối u của
virus gây bệnh Marek
Trang 11- Phương pháp giải trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự
động: Gen Meq trên gel được tinh sạch và xác định trình tự bằng
máy giải trình tự gen tự động ABI 3100
- Xác định mức độ hình thành các Cytokine bằng phương phápELISA phát hiện các hiệu giá của IFN - α, IFN - β, IFN - , IL - 12,
Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả phân lập MDV
3.1.1 Kết quả mổ khám gà nghi mắc bệnh Marek ở một số địa phương
Số gà có khối
u ở các tổ chức
Tỷ lệ (%)
Trang 12Tính chung 126 90 71,43
Kết quả bảng 3.1 cho thấy tỷ lệ gà có khối u ở các tổ chức bêntrong cơ thể là 71,43%, dao động tùy địa phương thu thập mẫu.Những đàn gà này đã được sử dụng vắc xin phòng bệnh Marek Sựkhác nhau về tỷ lệ gà có bệnh tích (cùng có triệu chứng bệnh Marek)phản ánh sự biến động về tình trạng sức khỏe của đàn tại thời điểmnhiễm bệnh hơn là đánh giá hiệu quả vắc xin Mặt khác, cũng có thể
do các chủng virus gây bệnh có độc lực khác nhau
3.1.2 Phản ứng PCR xác định gen đặc hiệu của virus Marek
Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR phát hiện gen Meq
(M: thang chuẩn; 1 8: các mẫu có sản phẩm PCR có gen Meq; 9
-12: sản phẩm PCR không có gen Meq) Phản ứng PCR đã phát hiện được 8 mẫu lách có gen Meq, điều
đó có nghĩa là có 8/126 cá thể gà nhiễm bệnh Marek (6,34%) Điềuđáng lưu ý là các tỉnh Vĩnh Phúc, Hà Nội, Phú Thọ có quy mô chănnuôi gà công nghiệp lớn và các trang trại lấy mẫu đều thực hiệnphòng ngừa bệnh Marek bằng vắc xin đúng theo quy trình Như vậy,hiện tượng gà nhiễm bệnh sau khi đã sử dụng vắc xin là vấn đề cầnđược đánh giá, xem xét về các khía cạnh, bao gồm: sự biến chủngcủa virus, sự thay đổi độc lực của chủng gây bệnh, sự suy giảm hiệulực của vắc xin
3.1.3 Nuôi cấy phân lập virus Marek
Trang 13Mẫu lách và lông vũ của 8 cá thể gà có bệnh tích điển hình và
có gen mã hóa kháng nguyên đặc hiệu của MDV được tiến hành nuôicấy trên đĩa tế bào xơ phôi vịt một lớp Kết quả đã phân lập được 01chủng virus phát triển ổn định đến đời tiếp truyền thứ 3, hiệu ứnghủy hoại tế bào (Cytopathic Effect - CPE) xuất hiện ổn định sau 5ngày nuôi cấy ở điều kiện 37°C, 5% CO2.Chủng virus này ký hiệu làMDV 6.13 được giữ trong tế bào xơ phôi vịt và bảo quản ở - 196°Ctrong dung dịch 10% dimethyl sulphoxide
3.1.4 Kết quả xác định trình tự gen Meq
Tham khảo nghiên cứu của Laurent et al (2001) [79], bằng cặp mồi Meq đã khuếch đại được đoạn gen có kích thước khoảng 1081
bp Kết quả thu được ở hình 3.5 cho thấy một sản phẩm PCR với duynhất một băng ADN sáng, rõ nét và không có sản phẩm phụ Kíchthước này phù hợp theo tính toán lý thuyết và tương ứng với kích
thước của đoạn mã hoá của gen Meq của virus gây bệnh Marek ở gà Tuy nhiên, để khẳng định chính xác sản phẩm thu được là gen Meq
chúng tôi đã tiến hành tách dòng, xác định trình tự nucleotide và sosánh với trình tự gen này trên Gene bank
Hình 3.6 Kết quả tách plasmid từ khuẩn lạc trắng
Vạch điện di tương ứng với kích thước của gen Meq được tinh
sạch và xác định trình tự bằng máy giải trình tự gen tự động ABI
3100 Sử dụng phần mềm Blast để xác định mức độ tương đồng của
Trang 14trình tự gen Meq thu được với các trình tự của GenBank Kết quả cho thấy trình tự gen Meq của chủng MDV 6.13 tương đồng 95% với trình tự gen Meq của Gallid herpesvirus Với mức độ tương đồng
thấp như vậy chứng tỏ MDV đã có sự biến chủng có độc lực cao và
có khả năng gây bệnh cả khi gà đã được tiêm vắc xin phòng bệnh
3.2 Khả năng gây bệnh của MDV phân lập
3.2.1 Khả năng gây bệnh của MDV phân lập trên các giống gà thí nghiệm
Bảng 3.2 Mức độ gây bệnh của chủng MDV
phân lập trên các giống gà thí nghiệm
Triệu chứng của gà mắc bệnh
Tỷ lệ các triệu chứng bệnh Marek
Số gà chết do bệnh Marek (n)
Tỷ lệ chết
do bệnh Marek (%)
Gà Ross
308
(n=120)
107 89,17 Gầy ốm, mào tái 89,17 69 57,5
Đi loạng choạng 60 Liệt, sệ cánh 45,83
Trang 15Liệt chân 33,33 Viêm mống mắt, mù 4,17
3.2.2 Khả năng gây bệnh của MDV phân lập trên các giống gà thí nghiệm ở các độ tuổi khác nhau
Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy, tỷ lệ mắc bệnh của gà thí nghiệm
ở các độ tuổi có sự sai khác rõ rệt giữa gà 1 ngày tuổi, 1 tuần tuổi, 1tháng tuổi và 3 tháng tuổi Cụ thể:
Ở gà Ri tỷ lệ gà có biểu hiện mắc bệnh tương ứng là 100%; 90%;66,67% và 26,67% Tỷ lệ chết là 53,33%; 43,33%; 33,33% và 3,33%
Ở gà Lương Phượng tỷ lệ gà có biểu hiện mắc bệnh tương ứng
là 100%; 100%; 83,33% và 56,67% Tỷ lệ chết tương ứng là 73,33%;50%; 43,33% và 6,67%
Ở gà Ross 308 tỷ lệ gà có biểu hiện mắc bệnh tương ứng là100%; 100%; 96,67% và 60% Tỷ lệ chết tương ứng là 86,67%;63,33%; 53,33và 26,67%
Kết quả này cho thấy tỷ lệ gà mắc bệnh và gà chết giảm dầntheo sự tăng lên ngày tuổi của gà Mặt khác, các giống gà nhậpngoại mẫn cảm với virus gây bệnh Marek hơn so với gà nội địa ở tất
cả các độ tuổi
Trang 17Bảng 3.4 Mức độ gây bệnh của chủng MDV phân lập được trên các giống gà ở các độ tuổi khác
Tỷ lệ các triệu chứng bệnh Marek (%)
Số gà chết do bệnh Marek (n)
Tỷ lệ chết do bệnh Marek (%)
Số gà
có biểu hiện bệnh Marek (n)
tỷ lệ có biểu hiện bệnh Marek (%)
Triệu chứng của gà mắc bệnh
Tỷ lệ các triệu chứng bệnh Marek (%)
Số gà chết do bệnh Marek (n)
Tỷ lệ chết do bệnh Marek (%)
Số gà
có biểu hiện bệnh Marek (n)
tỷ lệ có biểu hiện bệnh Marek (%)
Triệu chứng của gà mắc bệnh
Tỷ lệ các triệu chứng bệnh Marek (%)
Số gà chết do bệnh Mare k (n)
Tỷ lệ chết do bệnh Mare