Đang tải... (xem toàn văn)
Các loài vi tảo là thực phẩm chủ yếu cho các loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ ăn lọc (hàu, vẹm, điệp và nghêu). Có khoảng 75 loài vi tảo có khả năng sản sinh các độc tố mạnh. Chúng gây độc cho con người thông qua chuỗi thức ăn gây nên một số bệnh về dạ dày, ruột và thần kinh với con người. Trên thế giới có 5 nhóm độc tố nhuyễn thể chính bao gồm: nhóm độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ - Paralytic Shellfish Poisoning (PSP), nhóm độc tố nhuyễn thể gây tiêu chảy - Diarrhetic Shellfish Poisoning (DSP), nhóm độc tố nhuyễn thể gây mất trí nhớ - Amnesic Shellfish Poisoning (ASP), nhóm độc tố nhuyễn thể gây độc hệ thần kinh - Neurologic Shellfish Poisoning (NSP) và nhóm độc tố nhuyễn thể Azaspriaxit (AZA). Bài viết xây dựng và thẩm định phương pháp xác định hàm lượng Saxitoxin trong phần ăn được của M. lyrata bằng hệ thống LC-MS/MS AB Sciex Triple Quad 5500.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2018 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘC TỐ BIỂN SAXITOXIN (THUỘC NHÓM PSP) TRONG PHẦN ĂN ĐƯỢC CỦA LOÀI NGHÊU TRẮNG (MERETRIX LYRATA) BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS Lê Anh Tuấn*, Nguyễn Hữu Phát* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Các loài vi tảo thực phẩm chủ yếu cho loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ ăn lọc (hàu, vẹm, điệp nghêu) Có khoảng 75 lồi vi tảo có khả sản sinh độc tố mạnh Chúng gây độc cho người thông qua chuỗi thức ăn gây nên số bệnh dày, ruột thần kinh với người Trên giới có nhóm độc tố nhuyễn thể bao gồm: nhóm độc tố nhuyễn thể gây liệt - Paralytic Shellfish Poisoning (PSP), nhóm độc tố nhuyễn thể gây tiêu chảy - Diarrhetic Shellfish Poisoning (DSP), nhóm độc tố nhuyễn thể gây trí nhớ Amnesic Shellfish Poisoning (ASP), nhóm độc tố nhuyễn thể gây độc hệ thần kinh - Neurologic Shellfish Poisoning (NSP) nhóm độc tố nhuyễn thể Azaspriaxit (AZA) Mục tiêu: Xây dựng thẩm định phương pháp xác định hàm lượng Saxitoxin phần ăn M lyrata hệ thống LC-MS/MS AB Sciex Triple Quad 5500 Phương pháp nghiên cứu: Sử dụng hệ thống LC-MS/MS AB Sciex Triple Quad 5500 để phân tích Kết quả: Giới hạn định lượng Saxitoxin 0,015 mg/kg với độ thu hồi từ 83 – 86% Kết luận: Phương pháp có độ nhạy phù hợp với MRL EU cơng bố, có độ ổn định độ đáp ứng với thông số theo yêu cầu trình thẩm định phương pháp Từ khóa: saxitoxin, meretrix lyratab ABSTRACT VALIDATION OF A LIQUID CHROMATOGRAPHY TANDEM MASS SPECTROMETRY METHOD FOR THE ANALYSIS OF SAXITOXIN (PSP GROUP) IN EDIBLE PART OF WHITE CLAM (MERETRIX LYRATA) Le Anh Tuan, Nguyen Huu Phat * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 – No - 2019: 446 – 452 Background: Microscopic planktonic algae of the world’s oceans are critical food for filter-feeding bivalve shellfish (oysters, mussels, scallops, clams) Some species (about 75) which have the capacity to produce potent toxins (called phycotoxins) that can find their way through levels of the food chain (e.g: molluscs, crustaceans and finfish) and are ultimately consumed by humans causing a variety of gastrointestinal and neurological illnesses Until now, five groups of shellfish toxins have been distinguished, namely: paralytic shellfish toxins causing paralytic shellfish poisoning (PSP); diarrhoeic shellfish toxins causing diarrhoeic shellfish poisoning (DSP); amnesic shellfish toxins causing amnesic shellfish poisoning (ASP); neurotoxic shellfish toxins causing neurotoxic shellfish poisoning (NSP); and azaspiraxit shellfish toxins causing azaspiraxit shellfish poisoning (AZP) Objectives: Validation of method for the analysis of Saxitoxin (PSP group) in edible part of Meretrix lyrata Methods: Chemical method is based on liquid chromatography (LC) coupled with (tandem) mass spectrometry (MS/MS) *Viện Y tế Cơng cộng TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS Nguyễn Hữu Phát 446 ĐT: 0969241883 Email: huuphatk@gmail.com Chuyên Đề Y Tế Công Cộng Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Results: The accuracy ranged from 83 to 86%, and the detection limit is 0.005 mg/kg Conclusions: Results of the validation process confirmed its fitness for purpose as a quantitative method Based on these values for precision and recovery, it was concluded that the method is suitable for official control purposes to quantitatively determine Saxitoxin Key words: saxitoxin, meretrix lyrata ĐẶT VẤN ĐỀ Các loài vi tảo thực phẩm chủ yếu cho loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ ăn lọc (hàu, vẹm, điệp nghêu) Trong số 5000 loài tảo biển biết, có khoảng 300 lồi xuất với số lượng lớn nở hoa có khả làm thay đổi màu nước biển hay gọi “thủy triều đỏ” Một vài loài làm biến đổi màu nước vô hại Mặt khác, số lồi nở hoa q dày đặc nên chúng làm chết cá động vật không xương sống suy giảm oxy Một số lồi tảo khác gây hại cho cá động vật không xương sống cách phá hủy gây tắt nghẽn mang chúng Hơn nữa, có khoảng 75 lồi vi tảo có khả sản sinh độc tố mạnh Chúng gây độc cho người thông qua chuỗi thức ăn gây nên số bệnh dày, ruột thần kinh với người Đến nay, năm nhóm độc tố nhuyễn thể biết gồm: Nhóm độc tố nhuyễn thể gây liệt (Paralytic Shellfish poisoning - PSP); Nhóm độc tố nhuyễn thể gây tiêu chảy (Diarrhetic Shellfish Poisoning - DSP); Nhóm độc tố nhuyễn thể gây trí nhớ (Amnesic Shellfish Poisoning - ASP); Nhóm độc tố nhuyễn thể gây độc thần kinh (Neurotoxin Shellfish Poisoning - NSP); Các độc tố nhóm Azaspiraxit (AZP) – có tác động tương tự DSP Trong số độc tố biển biết đến, độc tố thuộc nhóm ASP, DSP PSP độc tố quốc gia tổ chức quốc tế quan tâm nhiều Nhóm độc tố PSP xác định dựa phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao với đầu dò huỳnh quang Các độc tố PSP chiết khỏi mẫu thử acetic axit Dịch chiết chứa độc tố PSP bơm vào thiết bị HPLC Tại hệ thống phản ứng sau cột, độc tố PSP ơxy hố periodic axit môi trường kiềm Chuyên Đề Y Tế Công Cộng tạo thành dẫn xuất có tính huỳnh quang Các dẫn xuất phân tích HPLC với detector huỳnh quang Phương pháp hướng dẫn thực TCVN 8339:2010(5) Hiện nay, bối cảnh độc chất tồn dư thực phẩm xuất với tần suất ngày nhiều, chủng loại đa dạng cấu trúc phức tạp Sự xuất độc chất gây khó khăn q trình kiểm nghiệm dựa nguyên lý sắc ký ghép nối đầu quang phổ (tử ngoại – khả kiến, huỳnh quang), vốn có độ đặc hiệu thấp dễ gây dương tính giả Do đó, việc sử dụng phương pháp kiểm nghiệm dựa nguyên lý sắc ký ghép khối phổ đa tầng lựa chọn hữu hiệu kiểm nghiệm có liên quan đến độc chất chất cấm thực phẩm Trong số thiết bị sắc ký lỏng ghép khối phổ hệ thống sắc ký lỏng ghép nối với đầu dò tứ cực lựa chọn tối ưu cho kiểm nghiệm định tính định lượng độc chất thực phẩm Do đó, nghiên cứu thực xây dựng thẩm định phương pháp xác định hàm lượng Saxiton phần ăn M lyrata hệ thống LC-MS/MS AB Sciex Triple Quad 5500 Mục tiêu nghiên cứu Giới hạn dư lượng tối đa (MRL) độc tố biển nhuyễn thể EU ban hành vào năm 2004(4) áp dụng cho độc tố PSP, ASP (tính theo domoic axit) Okadaic 800 µg/kg, 20 mg/kg 160 µg/kg Bên cạnh đó, giới hạn hàm lượng độc tố PSP, ASP DSP nhuyễn thể Việt Nam quy định “TCVN 8681:2011 Nhuyễn thể hai mảnh vỏ đông lạnh”(6) với mức cho phép (mg/kg) 0,8; 20 “không phát hiện” Trong giới hạn nghiên cứu này, quy trình 447 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2018 phân tích xác định Saxitoxin (đại diện cho nhóm PSP) phần ăn loài Nghêu trắng (Meretrix lyrata) tập trung nghiên cứu ĐỐITƯỢNG- PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Nghêu trắng hay gọi Nghêu Bến Tre (Sowerby, 1851), có tên khoa học Meretrix lyrata, cịn có tên gọi khác Lyrate Asiatic, phân bố phía Tây Thái Bình Dương, từ Đài Loan đến Việt Nam Ở Việt Nam, Nghêu thường phân bố nhiều vùng ven biển phía Nam, bao gồm tỉnh: Tiền Giang, Bến Tre, Trà Vinh, Sóc Trăng, Bạc Liêu Cà Mau Nghêu loài động vật thân mềm hai mảnh vỏ, sống lớp trầm tích đáy vùng cửa sơng, có nguồn thức ăn lồi vi tảo hạt rắn chứa chất hữu lơ lửng nước tích lũy bề mặt lớp trầm tích Nhóm độc tố nhuyễn thể gây liệt (Paralytic Shellfish poisoning - PSP) nhóm chất có độc tính cao tạo dinoflagellates cyanobacteria Sự tích lũy độc tố PSP qua chuỗi thức ăn gây nguy ảnh hưởng cho sức khỏe người ăn phải Độc tố PSP khóa kênh natri (sodium channels) màng thần kinh, gây nên triệu chứng tê liệt, khó thở, suy cơ, trường hợp ngộ độc nặng dẫn đến tử vong Trường hợp ngộ độc ghi nhận làm người chết vào năm 1920 California (Mỹ) Saxitoxin (STX) chất có độc tính cao, có liều gây chết trung bình LD50 cho người 5,7 µg/kg(1) (Bảng 1, Hình 1) Bảng 1: Cơng thức cấu tạo nhóm độc tố nhuyễn thể gây liệt (PSP) Tên hợp chất R1 R2 R3 R4 Saxitoxin (STX) H H H OCONH2 Decarbamoyl H H H OH saxitoxin (dcSTX) Neosaxitoxin (NEO) OH H H OCONH2 Gonyautoxin (GTX1) OH H OSO3H OCONH2 Gonyautoxin (GTX2) H H OSO3H OCONH2 Gonyautoxin (GTX3) H OSO3H H OCONH2 Gonyautoxin (GTX4) OH OSO3H H OCONH2 Gonyautoxin (GTX5) H H H OCONHSO3H 448 Hình 1: Cơng thức cấu tạo nhóm độc tố nhuyễn thể gây liệt (PSP) Phương pháp nghiên cứu Quy trình vận hành thiết bị xử lý mẫu tối ưu từ thông số ban đầu Luckas et al (2015)(2) Mcnabb et al (2005)(3) Các bước tiến hành cụ thể sau: (1) Mẫu nghêu tách bỏ vỏ, thu lấy phần thịt ăn sau xay nhuyễn máy đồng mẫu cân g mẫu vào ống ly tâm 50 mL; (2) Thêm 10 mL HCl 0,1 N, đồng máy phút; (3) Đậy kín nắp, đun sôi 15 phút bếp cách thủy; (4) Để nguội nhiệt độ phòng, ly tâm, chuyển dịch ly tâm vào bình 20 mL; (5) Thực tương tự bước (iv) với mL HCl 0,1 N; (6) Gộp dịch chiết lần vào bình định mức 20 mL, định mức đến vạch nước cất; (7) Lọc dịch chiết qua phin lọc có đường kính lỗ lọc 0,45 µm, pha lỗng lần pha động Trước áp dụng phương pháp phân tích vào thực tế, cần phải tiến hành xác nhận giá trị sử dụng phương pháp (hay thẩm định) nhằm đảm bảo độ tin cậy kết thu Các bước tiến hành tiêu chí đánh giá kết trình xác nhận giá trị sử dụng phương pháp thực theo hướng dẫn tài liệu “Thẩm định phương pháp phân tích Hóa học Vi sinh vật”(7), bao gồm thông số như: xác định số điểm IP; xây dựng đường chuẩn; xác định giới hạn phát – giới hạn định lượng phương pháp Chuyên Đề Y Tế Công Cộng Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 (LOD - LOQ); độ lặp lại; độ tái lặp độ Các bước thực xác nhận giá trị sử dụng phương pháp cụ thể sau: Khoảng tuyến tính Tiến hành đo dung dịch chuẩn chất Saxitoxin Khoảng tuyến tính lựa chọn cho thiết lập phương trình đường thẳng biểu diễn phụ thuộc tín hiệu đo vào nồng độ có hệ số R2 ≥0,99 Giới hạn định luợng (MLOQ) phương pháp Ước lượng LOD lý thuyết cách: (1) Phân tích mẫu chuẩn có nồng độ thấp dần, LOD lý thuyết giá trị nồng độ mà có Signal/Noise ≥ 3; (2) Phân tích mẫu thêm nồng độ 5-7 lần LOD lý thuyết (nồng độ LOQ lý thuyết); (3) Tính giá trị trung bình XTB, độ lệch chuẩn SD từ kết phân tích, (4) MLOD tính theo cơng thức: MLOD =3×SD; (5) Đánh giá MLOD tính theo tỉ số R, với: R = XTB/(3xSD); (6) Nếu < R< 10 ta chấp nhận giá trị MLOD vừa tính được, R 10 chứng tỏ MLOD thực tế nhỏ giá trị vừa tính được, cần thêm chuẩn nồng độ thấp tính toán lại giá trị MLOD; (7) Giới hạn định lượng tính theo cơng thức MLOQ = 3xMLOD Độ lặp lại Lựa chọn giá trị nồng độ phân bố khoảng làm việc để đánh giá độ lặp lại, có giá trị nồng độ MLOQ, nồng độ thực phân tích lặp lại lần, độ lặp lại đánh giá thông qua giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD% = (SDx100)/XTB Độ tái lặp nội phịng thí nghiệm Thực phân tích lặp lại mẫu thêm chuẩn nồng độ thực đánh giá độ lặp lại với thay đổi số điều kiện phân Chuyên Đề Y Tế Công Cộng Nghiên cứu Y học tích như: thiết bị phân tích, ngày phân tích, nhân viên phân tích Tập hợp kết phân tích điều kiện tái lặp nội lặp lại, ứng với giá trị nồng độ tính giá trị trung bình XTB, độ lệch chuẩn SD từ 12 kết phân tích Hiệu suất thu hồi Dựa vào kết nồng độ tính (Cthu hồi) mẫu thêm chuẩn trình đánh giá độ lặp lại độ tái lặp nội phịng thí nghiệm với nồng độ lý thuyết (Clý thuyết) thêm vào, hiệu suất thu hồi tính tốn theo cơng thức: H% = Cthu hồix100/Clý thuyết Độ không đảm bảo đo Mọi phép đo có sai số định Do vậy, ĐKĐBĐ phần quan trọng kết đo, ĐKĐBĐ tính thơng qua độ tái lặp nội phịng thí nghiệm kết hợp với độ chệch phương pháp Cách tính ĐKĐBĐ gồm bước sau: (1) Tính ĐKĐBĐ theo độ tái lặp nội phịng thí nghiệm (n: số lần phân tích lặp lại nồng độ), RSD% RSD% lớn số giá trị RSD ứng với nồng độ khảo sát; (2) Tính bias nồng độ, sau tính ; (3) Độ không đảm bảo đo mẫu thêm chuẩn , ước lượng dựa độ không đảm bảo đo thể tích thêm chuẩn độ khơng đảm bảo đo chất chuẩn ; (4) Tính ĐKĐBĐ theo độ chệch phương pháp ; (5) Tính ĐKĐBĐ tổng hợp (6) Tính ĐKĐBĐ mở rộng số phủ, độ tin cậy 95%) ; ( hệ 449 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2018 Thông số KẾT QUẢ Điều kiện phân tích Bảng 2: Thơng số DP, CE, số IP cặp ion mẹ / ion Saxitoxin Saxitoxin ESI + + Ion mẹ Ion 300 282 300 204 DP 50 50 CE 30 30 Giá trị 6,1->10,0 Thông số khối phổ CUR – Tốc độ dịng khí N2 làm IS – Thế ion hóa CAD – Khí va đập TEM – Nhiệt độ hóa dung mơi GS1 – Khí phun sương GS2 – Khí thổi khơ IP Bảng 3: Thơng số sắc kí lỏng (LC) khối phổ (MS/MS) phân tích Saxitoxin Thơng số Giá trị Thơng số sắc kí lỏng (A) Acetonitrile chứa 10mM HFBA Hệ pha động (B) H2O chứa 10mM HFBA Cột C18 Inertsil 150mm x 5µm Tốc độ dịng 0,8 mL/phút Thời gian %A %B Chương trình gradient 0,01 20 80 80 80 20 20 psi 5500 V medium o 500 C 40 psi 40 psi Áp dụng thông số lựa chọn vào phân tích dung dịch mẫu thêm chuẩn, kết cho thấy píc chất phân tích tách rời khỏi píc nhiễu có hình dạng sắc nét phù hợp để phân tích định lượng (Hình 2) XIC of +MRM (3 pairs): 300.000/282.000 Da ID: STX from Sample 35 (C3-06) of Data20181119-STX.wiff (Turbo Spray) Intensity, cps 6780 6000 20 20 80 Max 5485.0 cps 4.78 4000 7.79 2000 2.84 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.02 3.5 4.0 4.94 5.64 4.42 6.15 6.43 4.5 5.0 5.5 6.0 Time, XIC of +MRM (3 pairs): 300.000/282.000 Da ID: STX from Sample 35 (C3-06) of Data20181119-STX.wiff (Turbo Spray) 6.5 6.847.24 7.34 7.0 8.13 7.5 8.0 8.63 8.86 8.5 9.0 9.70 9.5 Max 5485.0 cps 4.78 Intensity, cps 5000 4000 3000 7.79 2000 4.94 1000 0.0 2.84 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.02 3.5 4.0 5.64 6.15 6.43 4.42 4.5 5.0 5.5 6.0 Time, XIC of +MRM (3 pairs): 300.000/204.000 Da ID: STX from Sample 35 (C3-06) of Data20181119-STX.wiff (Turbo Spray) 7.0 7.5 8.13 8.0 8.63 8.86 8.5 9.0 9.70 9.5 Max 6780.0 cps 4.77 6780 6000 Intensity, cps 6.5 6.84 7.24 7.34 4000 2000 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 Time, 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 Hình 2: Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn Saxitoxin không phát thêm chuẩn nồng Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp độ gần LOQ kết cho hiệu suất thu Độ đặc hiệu/chọn lọc phương pháp hồi tốt Như vậy, phương pháp có độ chọn lọc Hợp chất Saxitoxin định lượng khối cao cho Saxitoxin phổ MS/MS có số điểm IP 4, phù hợp với yêu Khoảng tuyến tính đường chuẩn cầu cho độ đặc hiệu phương pháp Phương trình đường chuẩn (dạng đường Trong trình thực xác định giá trị sử tuyến tính bậc I) Saxitoxin có nồng độ từ 10 dụng phương pháp mẫu blank cho kết 450 Chuyên Đề Y Tế Cơng Cộng Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 µg/L đến 100 µg/L cho hệ số R2 tốt (R2 >0,99), khoảng nồng độ làm việc Bên cạnh đó, kết đánh giá hiệu ứng cho Nghiên cứu Y học thấy ảnh hưởng lên thăng/gián tín hiệu đo nằm mức 20% tất nồng độ (Hình 3) Hình 3: Phương trình đường chuẩn Saxitoxin ba nồng độ khảo sát có RSD% H% đáp Giới hạn phát phương pháp (MLOD) ứng tiêu chí theo AOAC cho nồng độ giới hạn định lượng (LOQ) Như vậy, phương pháp cho độ lặp lại hiệu Kết phân tích lặp lại 12 lần mẫu thêm suất thu hồi phù hợp với yêu cầu chuẩn nồng độ 15 µg/kg tương ứng với Độ tái lặp nội phịng thí nghiệm Saxitoxin sử dụng cho việc xác định hệ số (Reproductibility within laboratory) R Ở nồng độ thêm chuẩn cho giá trị 4