Tìm hiểu bệnh ty thể ở người bằng phương pháp sinh học phân tử : Đề tài NCKH. QT.08.31

ĐẠI HỌC QUÓC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN TÌM HIỂU BỆNH TY THẺ NGƯỜI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ M à SĨ : QT 08-31 CHỦ TRÌ ĐÈ TÀI: CHU VĂN MẲN Đ A ' H Ọ C Q U Ố C G tA HẢ N Ị ' Th ị n g ti n t h ■/ 1É Dĩ / ‘-J HÀ NỘI - 2009 Báo cáo đề tài QT 08-31 Tên đề tài: Tìm hiểu bệnh ty thể người phưomg pháp sinh học phân tử M à S Ố : Q T 08-31 Chủ trì đề tài: Chu văn Mẩn Các cán tham gia: - PGS.TS Phan Tuấn Nghĩa, ĐHKHTN, ĐHQG Hà nội - Trịnh Lê Phương, Khoa Sinh ĐHKHTN, ĐHQG Hà nội Báo cáo đề tài QT 08-31 Tên đề tài: Tìm hiểu bệnh ty thể người phương pháp sinh học phân tử Mà SỐ: Q T 08-31 Chủ trì đề tài: Chu văn Man Các cán tham gia: - PGS.TS Phan Tuấn Nghĩa, ĐHKHTN, ĐHQG Hà nội - Trịnh Lê Phương, Khoa Sinh ĐHKHTN, ĐHQG Hà nội Mục tiêu nội dung nghiên cứu: + Xác định phương pháp tách chiết ADN ty thể từ máu ngoại vi người, +Tìm hiểu khả xác định đột biển gen ty thể + Giải trình tự ADN ty thể từ máu ngoại vi người Các kết đạt được: - Đã xác định phương pháp tách chiết AND ty thể từ máu ngoại vi bệnh nhân nghi mắc bệnh ty thể việc sử dụng kit Qiagen - Xây dựng phương pháp tính tốn lý thuyết cho việc sử dụng enzim giới hạn {Spe I H a e \\\ ) thiết kế mồi để nhân đoạn AND nghi có chứa đột biến gen (đã phân tích đột biến TIOOIOC A3243G) - Sử dụng cặp mồi cải tiến nhân thành công đoạn gen ngắn (357 bp 198 bp) hệ gen ty thể người, phối hợp kỹ thật PCR với việc cắt sản phẩm PCR enzyme giới hạn Spe\ cho đoạn 357bp Hae\\\ cho đoạn 198bp, điện di sản phẩm phân cắt gel polyacrylamide (kỳ thuật PCRRFLP), phát xác đột biến A3243G hội chứng MELAS - Giải trình tự đoạn AND nhân - Cách cải tiến sở để phát triển kỹ thuật real-time PCR cho phép xác định tưọTig heteroplasmy vốn đăc trựng hệ gen ty thể -Tình hình kinh phí đề tài: Tổng kinh phí cấp: Mua hố chất, dụng cụ: Th khốn chun mơn: Thơng tin liên lạc, văn phịng phẩm: Qn lý hành chi phí khác: 20 000000 đ 600000 đ 000000 đ 800000 đ 1600000 đ Báo cáo đề tài QT 08-31 Subject of scientific research 2008 Tile: Investigation of mitochondirial diseases by molecular methods Coder QT 08-31 Leader of reasearch: Chu Van Man Reasearch o f cooperation: Dr Phan Tuan Nghia, Trinh Le Phuong Objective and contents of research; - Building methods o f extracting mitochondrial DNA( mt DNA) from patient blood - Building methods o f detecting mutations in mt DNA - Sequencing some parts of mt DNA Results of research: - Extracting mt DNA from patient blood by using Qiagen kit - Designing two sets of primers to amplify DNA fragments consisting mutations: T 100IOC and A3243G Caculating the amount of restriction enzyme (such as Sepl, Hae III ) to be used by theoretical way - Amplifying two short fragments (357 bp and 198 bp) of mt DNA by PCR with these primers.Using restriction enzyme Sep\ for the 357 bp fragment, Hae III for 198 bp one Separating the digested fragments by Agarose and Polyacrylamide Gel Electrophoresis to dectect A3243G mutation - Sequencing two fragments - This improment is a foundation to develop RT- PCR to examine heteroplasmy, a characteristic feature of mt DNA mutations Xác nhận BCN Khoa Sinh học PH ^ CHÚ NHIÊM KHOA ỊViS.Tu Chu Văn Mần %iMUh Jì/ịfÁìa Xác nhận Trường • r4Ĩ Báo cáo để tài QT 08'31 MỤC LỤC trang LỜI M ĐÀU Chương TÓNG QUAN 1.1- Đại cương ty thể người 1.1.1 Cấu trúc ty thể người 1.1.2 Vai trò, chức ty thê người 1.2 Đặc điểm hệ gen ty thể người 1.2.1 Cấu tạo hệ gen ty thể người 1.2.2 Đặc điêm di truyên hệ gen ty thê người ] 2.3 Các rối loạn chức hệ gen ty thể người 1.2.4 Y nghĩa việc nghiên cứu hệ gen ty thê người 1.2.5 Nghiên cứu hệ gen ty thê người Việt Nam 1.3 Đặc điểm gen ND5 ty thể 1.3.1 Cấu trúc, chức phức hệ I chuỗi hơ hấp ty thể 1.3.2 Vị trí, chức gen ND5 ty thê 1.4 Các đột biên AND ty thê quan tâm đê tài 1.5 Các phương pháp thường dùng sinh học phân tử 1.5.1 Phương pháp phân tích ADN 1.5.2 Phương^pháp RPLP Chương II N G Ư \T N LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c u 2.1 Nguyên liệu, hoá chât thiêt bị 2.2 Phương pháp nghiên cứu Chương III KET QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1- Phân tích AND ty thê bệnh nhân Hoàng Lê Bảo Tr 3.1.1 Tách chiết đoạn ADN 3.1.2 Nhân đoạn gen ty thể pp PCR 3.1.3 Nhân dòng đoạn gen AND sau PCR vector pC R 2.1 3.1.4 Giải trình tự đoạn AND ty thê 3.2- Phân tích AND ty thể bệnh nhân Nguyễn Hữu M, 3.2.1 Tách chiết đoạn ADN 3.2.2 Nhân đoạn gen ty thể pp PCR 3.2.3 Cắt sản phẩm PCR enzim giới hạn Haelll KÉT LUẬN VÀ ĐỂ NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 7 7 8 ]0 ]1 12 ]2 12 13 14 ]5 15 16 18 18 ]9 24 24 25 25 26 26 28 29 29 30 32 33 36 Báo cáo đề tài QT 08-31 MỞ ĐẦU Cùng với phát triển khoa học kỹ thuật công nghệ thông tin vào năm cuôi thê kỷ XX - đậu thê kỷ XXI, Sinh học phân tử Cơng nghệ gen có bước phát triên nhảy vọt, đặc biệt việc giải mã bô gen người Bộ gen người gôm phân : Bộ gen nhân (23 cặp nhiêm săc thê = 3,2 tỷ bp) gen tê bào chât (genome ty thê = 16569 bp) Việc giải mã gen ty thê góp phân rât lớn khoa học hình pháp y đặc biệt việc chẩn đoán, điều trị bệnh liên quan đên di truyền ty thể Trình tự hồn chỉnh hệ gen ty thê n^ười đâu tiên có kích thước 16569 bp cơng bơ vào năm 1981 Cho đên nay, có hàng ngàn trình tự đoạn gen ty thể dân tộc khác giới giải mã đâng ký ngân hàng trình tự gen qc tê : EMBL/EBI (Anh), Genbank (Mỳ) Hệ gen ty thê kiêu đơn di trun hồn tồn theo mẫu hệ, cơng cụ rât hữu hiệu đê phân tích di trun quân thê người Hiện nay, người ta biêt đên hàng trăm bệnh di truyên tỵ thê đột biên ADN Phân tích đột biến ẠDN ty thê dùng đê chẩn đốn nhanh xác hướng điêu trị sô bệrứi Ty thể quan tử sản xuất lượng cần thiết cho hoạt động sông tê bào Hệ gen ty thê có kích thước 16,5 kb, mã hóa cho 13 protein 22 RNA vận chuyển ty thể RJMA ribosome (Reeve et al., 2008) Cho đên nay, người ta phát khoảng 180 đột biên hệ gen ty thê người có khả gây nên bệnh khác (Brandon et al, 2006) Các bệnh chủ yếu ve thần kinh, cơ, mắt khó có chẩn đốn xác qua sơ xét nghiệm ì âm sàng cận lâm sàng Phương pháp phát xác phân tích DNA (PCR-RFLP, real-time PCR, xác định trình tự gen v.v ) Việt Nam, băt đâu có vài công trinh nghiên cứu đên bệnh ty thể mức độ gen protein (Lê et al., 2004; Nguyễn et al., 2006; Trân et al., 2007) Tuy vậy, nghiên cứu mang tính chât khởi đầu Vì chúng tơi chọn đề tài “ Tìm hiểu bệnh ty thể người phương pháp sinh học phán tử" nhăm cải tiên phương pháp PCR-RFLP đê thử nghiệm khả phát đột biến gen bệnh nhân MELAS (mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes) bệnh nhân bại não nghi có đột biên gen ty thê Đông thời, tùng bước thiết lập phương pháp xác định nhanh, chírứi xác đột biên gen ty thê người, nhằm phục vụ việc chẩn đoán điều trị bệnh đột bien gen ty thể gây Báo cáo để tài QT 08-31 Chương I TỐNG QUAN 1.1 Đại cương ty thể người 1.1.1, Câu trúc ty thê người Ty bào quan nằm tế bào chất tế bào sinh vật nhân chn Chúnệ có nhiều hình dạng khác tùy thuộc vào lọại tế bào phổ biến nhat !à hình oval hình hạt đậu Ty thể có kích thước khoảng 0,5-1 ^im bao bọc hai lớp màng: màng màng Màng giống màng sinh chật tế bào, chứa phần lớn protein vận chuyển chất ra, vào ty thể Màng lại tạo thành nêp gâp hình ống gọi mào, có tác dụng làm tăng diện tích bê mặt Màng nơi tạo ATP - lượng thiêt yêu cho hoạt động tê bào Các protein vận chuyên, chuôi vận chuyên điện tử enzym tông họfp ATP năm mào ty thê Khoảng không gian bên màng chât nên ty thê, chứa enzym, protein, ribosom, tARN hệ gen ty thê [21 Hâu hêt protein ty thê mã hoá bới gen nhân vận chuyên vào ty thể qua kênh protein màng Bộ máỵ tạo lượng năm màng ty thể mã hố hệ gen ty thể Sơ lượng ty thê có tê bào khoảng từ hàng trăm đên hàng triệu ty thê, phụ thuộc vào chức tê bào Chúng thường xuât nhiêu mơ địi hỏi nhiêu lượng mơ cơ, tim mô khác [21 ] L Ỉ.2 Vai trò, chức ty thể người * Vai trò chuỗi vận chuyến điện tử Ty thê đóng vai trị quan trọng đường trao đơi chât Chức chủ yêu chúng tạo lượng cho hoạt động tê bào thông qua q trình hơ hâp hiêu khí Chúng cung câp lượng cho tê bào thơng qua q trình phosphoryl oxy hoá, tạo ATP từ glucose Thức ăn vào thể phải chuyển hoá thành dạng đơn giản mà tế bào có thê sử dụng glucose Glucose sau vận chuyên vào tế bào chất vận chuyển nằm màng tế bào, Bên tế bào, glucose lại tiếp tục chuyển hoá thành ATP theo hai đường sau; Con đưOTg thứ đường phân, xảy màng sinh chất, bên ngồi ty thể Q trình khơng cần có oxy nên gọi trao đổi chất kị khí Nhờ q trình đường phân, phân tử glucose chuyên hoá thành hai phân tử pyruvat tạo thành phân tử ATP Sau đó, pyruvat vận chuyển vào bên ty thê Con đường thư hai xảy bên ty thể cần có mặt oxy Đây q trình chủ yêu đê tạo ATP cho hoạt động tê bào Tại đây, pỵruvat chuyển hoá thành Acetyl CoA, tiếp tục vào chu trình Krebs đe tạo thành điện tử giàu iượng (các ion hydro) Điện tử khỏi chu trình Krebs NAD^ FAD^ nhận lấy chuyển đến chuỗi vận chuyển điện tử nằm màng ty thê Điện tử vận chuyển qua loạt chất vận chuyển trung gian đến oxy, chất nhận điện tử cuối cùng, tạo Báo cáo đề tài QT 08-31 nước 10 nguyên tử hydro Các nguyên tử hydro vận chuyển qua màng vào khoảng không gian hai màng ty thê, tạo gradient điện thê Q trình làm kích hoạt borm proton tạo ATP Như vậy, chu trình Krebs tạo 24-28 phân tử ATP từ phân tử pyruvat ATP chât có vai trị trun^ tâm trao đơi lượng tê bào thê sống ATP vận chuyển tế bào chất sử dụng cho tất chức tê bào vận chuyên tích cực chât qua màng, tông hợp phân tử lớn từ chât đơn giản, trình vận động, trình phân chia Hơ hấp hiếu khí q trình diễn liên tục, nhờ ty thể tạo hàng trăm nghìn phân tử ATP mơi phút tẻ bào Như vậy, coi ty thể nhà máy lượng tế bào * Vai trò tão hoả Người ta cho rang rối ỉoạn chức ty biển đôi protein nguyên nhân gây nên lão hố sơ sinh vật, dạnjg oxy gây phản ứng (Reactive Oxygen Species - ROS) yêu tơ chủ u qut định tuổi đời (tuy nhiên chế lão hố) ROS sản phâm phụ khơng mong mn q trình hơ hâp tê bào (một sơ điện tử không chuyên qua ubiquinone mà tới khử trực tiêp oxy, tạo anion superoxit) ROS chât oxy hoá mạnh, có thê phá huỷ phân tử khác cấu trúc tế bào mà chúng có mặt [2 ] * Các chức tế bào khác Ngoài chức chuồi hơ hâp lão hố, tỵ thê cịn giữ vai trị q trình “chết theo chưorng trình” (apoptosis) tế bào Đây trình quan trọng phát triên điêu hành mô sinh vật đa bào Sự sai khác chức bât mức độ đêu làm giải phóng u tơ gâỵ “chết theo chương trình” vào khoảng không gian hai màng ty thể (gian màng), làm cho tê bào bị phá huỷ Tuy nhiên vai trị ty thê “chết theo chương trình” phức tạp chưa biết đến đầy đủ Có thê q trình tạo lượng ty thê có liên quan tới “chêt theo chương trình” Ngun nhân chuồi hơ hấp ty thê tạo sản phấm phụ dạng ROS hoạt tính sửa chữa hệ gen ty thê nên làm tăng trình [21 ] Ngồi ra, ty thể cịn có khả tích luỹ giữ lượng ion canxi Điều quan trọng việc điêu hồ trao đơi chât, tạo ATP trinh khác, tiết thể dịch thần kinh [2 ] 1.2 Đặc điểm hệ gen ty thệ ngưòi L2.1 Cẩu tạo hệ gen ty thể người Hệ gen ty thể chiếm khoảng đến 5%ADN tế bào ADN ty thể người phân tử mạch kép, vịng, có từ đến 10 saotrong tv thể Kích thước chúng 16569 bp, nhiên có thê sai khác đơi chút có đoạn chèn vào, mât đoạn, có trình tự lặp lại nơi tiêp Khác với ADN nhân, ADN ty thê không liên kêt với protein histon, điều làm cho ADN ty thể giốnẸ với ADN vi khuẩn Người ta đưa nhiềia giả thuyết nguồn goc tiền hoá hệ gen ty thể Giả thuyết chấp nhận Báo cáo đề tài QT 08-31 rộng rãi hệ gen ty thể dấu vết lại hệ gen vi khuẩn cổ, sống cộng sinh bên tê bào sinh vật nhân chuân Toàn trật tự gen cấu trúc chức cua hệ gen t) thê người săp xêp theo sơ hình Phân tử ADN ty thể người gồm có hai chi: chi nặng giàu guanin chuỗi nhẹ giàu cytósin, ma hố cho 37 gen gồm rARN (12S 16S), 22 tARN 13 protein Chúng thành phân phức hệ hơ hâp ty thẻ, có tiêu phân phức hệ I (NDl -> ND ND4L), tiêu phận phức hệ III (Cytb), tiêu phần phức hệ (CO I -> III) tiểu phần phức hệ V (ATPase ; ) [14], Hâu hêt gen phiên mã từ chuôi nặng, trừ tiểu phân ND phức hệ I vả phản tư lARN phiên mã từ chuôi nhẹ [2 ] ■|ATP&:k 8K lCamplex [^ C yto clu om e ¡f^trmplgT4 OtHHAs ■ iRNAs Hình Hệ gen ty thể ngưịí ADN ty khơng có intron (ngoại trừ sơ nucleotid khơng mã hố vài gen) ^ có gen năm gơi lên (o\ erlapping genes), [14 Vung khơng mà hố ADN ty thể người la \ ung điều hòa (được gọi đoạn D-loop), chiếm khoảng 7% chiều dài ty thẻ, eom 1121 bp, chứa promoter cho sựj)hiên mã chuồi nặng chuỗi nhẹ chứa điểm khởi đầu chép chuoi nặng, 1.2.2 Đặc điểm di truyền hệ gen ty thể người sir di truyền cua ADN ty thê di truyền lế bào chất Đối với gen nằm nhân cua tê bào sinh vật nhân chụân, chúng tuân theo quy luật vận động nhiễm sắc thể chế phân bào Nhưng hệ gen tý Báo cáo đề tài QT 08-31 thể lại khơng tn theo quy luật mà tính trạng chúng xác định có kiêu di truyên riêng đặc trưng cho chúng - Di truyền theo dịng mẹ: động vật có vú, 99,99% ADN ty thể di truyên theo dòng mẹ [15] Sơ lượng ADN ty thê nỗn bào khoảng 100.000 phân tử tinh trùng có từ 100 đên 1500 phân tử Trong trình tạọ thành hợp tử, tế bào tinh trùng đóng góp hệ gen nhân chúng cho tê bào trứng không đóng góp hệ gen ty thê Ty thê tinh trùng bị loại bỏ vào trứng trình phân hủy protein phụ thuộc ubiquitin [20], Do vậy, hệ gen ty thê hợp tử nhận từ mẹ Đôi chê loại bỏ ADN ty thê tinh trùng có thê bị hỏng, dân đên tượng lê bào chât họp tử chứa ADN ty thê bô mẹ Hiện tượng gọi tượng ”dị tê bào chât” (heteroplasmy) - Đon bội, khơng có tái tơ hợp chủng di trun theo dịng - Tốc độ đột biển lón gấp 5-10 lan nhân ADN ty thể tự tái theo kiếu bán bảo toàn nhờ hệ enzym ADN polymerase có chất nên ty thể xảy gian kỳ chu kỳ phân chia tế bào Quá trình chép điểm khởi đầu chép chuỗi sử dụng đoạn ARN phiên mã từ chuỗi nhẹ làm mồi Quá trình tong hợp chuồi nặng kéo dài cho đên điêm khởi đâu chép chuỗi nhẹ ỉộ Lúc đó, tơng hợp chi nhẹ băt đâu Sau đó, mơi loại bỏ chuồi nối với Quá trình phiên mã dịch mã ADN tỵ điều khiến gen nhân [13] Tuy nhiên, phiên mã tiêu phân chuỗi hô hâp nhân không kêt họp với phiên mã tiêu phân mã hố ADN ty thể [12] Cả hai chi nặng nhẹ đêu phiên mã hâu hêt toàn chiêu dài hai chuôi dùng đê tông hợp nên khn ARN polycistronic Sau đó, nhờ enzym nuclease tạo tARN, rARN mARN riêng ty thê Điêu đặc biệt gen ty thê người, động vật có vú khác, có sô mã di truyên khác hăn gen nhân Bàng 1: Mòt số mả di truyền ADN ty khác vừi ADN nhản M ã dì truyền Hệ gen nhân Hệ gen ty thé TGA AGA, AGG ATA, ATT Mã kêt thúc Arg Ile Trp Mã kêt thúc Mã mở đâu ĩ 2.3 Các h n chức hệ gen ty thể ngườỉ Trong vòng 12 năm qua, người ta phát 50 điêm đột biên gần 100 rơi loạn ty thê có liên quan đên bệnh người [14] Vì hệ ậen ty thể mã hố cho lượng rât protein tham gia vào q trình hơ hâp tế bào nên chức ty thê thực nhờ chủ yêu vào protein nhân định Chính vậy, rối loạn ty thể hay bệnh ty thể đột biên gen nhân gen ty thê gây nên [2 ] Cho đến biết đến 150 bệnh di truyền khác theo mẫu hệ ty thể định Các bệnh biểu đa dạng, liên ngày DIỄN BIẾN BỆNH GIỜ Y LỆNH UcU Ù /í^-VuiL .L đ ù U M l ^ / áổul._ h _ J a ^ ,y ? ỉ C l^ ''i , l '1 ' / ¡ -< V, '^ X C '^ ¿ÍÉU ¿p-r-ikỵ or \ jt J ì ĩ 'C a - - ( 'ỵ -í-J ! y Ỉ1 < ^ h /k, ỈA l — / .^U(ÀĨ- CJL:-Q^ ^ - .:.^ 1' :ì *7 ^ ^ ìl ^ o / ^ ^ , - C^^.r:lTíJ^n LfJ J J X ^ ['Q (jẨ'^ĩCcH'^^c’/\- p l? _- lữ t-ù q GẤ ^ Ịứííií ^ '‘Ì ‘ /{ ■ !< ) T /^ - k - Báo cáo đề tài QT 08-31 Phụ lục Bài báo gửi đăng Tạp chí Di truyền ứng dụng 38 _ PHIEU THU Đơn '11 : K o n i tn e o Q u y ê n s ô : SỎ : Ẽ M(ht so C I-H QĐ^Ơ:999-TdQĐ/CDfCr N^('iv2 tlúiììg I I CÍIC! Bơ Tài năm ¡996 t h i iili ( : Ớ í ứ n g t g ố c ; Đ ã nhân dủ số lién (viel băn g chữ) s ỉ h i ì ^ QẬiiăiìi 200^ r i i i i I n n r n ; ; i l n VI ;K\ lld h'11 -* I ) L’j;i I1U>'.II IC + Ni> I > Ki- t o i i n I r i m g Ngưíii lãp phiéu N^irtri nóp I hù qtiv ( K y , lui ló ii) ( K ý h o ILTI) ( K y , h ụ tOii) (KÑ, liọ lOii) t':iL, il.i i|UV) IL'II t ] l l l i l i i i ■ - Tm PHÂN TÍCH ĐỘT BIỂN GEN A3243G CỦA HỘI CHỨNG MELAS BẰNG PHƯOnVG PHÁP PCR-RFLP CẢI TIẾN Trịnh Lê Phưong, Chu Vãn M an, Phan Tuấn Nghĩa K hoa Sinh học, Trường Đại học K hoa học T ự nhiên, Đại học Q uốc gia H Nội MỞ ĐẦU T y thê quan tử sản xuât lượng cần thiết cho hoạt động sống tế bào Hệ gen ty thê có kích thước 16,5 kb, m ã hóa cho 13 protein 22 RNA vận chuyển cùa ty thề RNA ribosom e (R eeve _et al., 2008) Cho đến nay, người ta phát khoảng 180 đột biên hệ gen ty thê ngựời có khả gây nên bệnh khác (Brandon et al, 2006) Các bệnh chủ yêu vê thân kinh, cơ, mắt khó có chẩn đốn xác chi qua m ột sô xét nghiệm lâm sàng cận lâm sàng Phương pháp phát xác phân tích DNA (P C R-RPLP, real-tim e PCR, xác định trình tự gen v.v ) V iệt Nam, bãt đầu có vài cơng trình nghiên cứa đến bệnh ty thể mức độ gen protein (Lẻ et al., 2004; N guyễn et al., 2006; Trần et al., 2007) Tuy vậy, chì nghiên cứu m ang tính chất khời đầu Trong nghiên cứu cải tiến phương pháp PCR-RFLP để thử nghiệm khả phát đột biến gen bệnh nhân MELAS (m itochondrial encephalom yopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes), bước thiết lập phưcmg pháp xác định nhanh xác đột biến gen ty thể Việt Nam, nhằm phục vụ việc điều trị bệnh đột biến gen ty thể gây 2.NGƯ YÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 N g u y ê n liệ u h oá c h ấ t v th iế t bị M áu ngoại vi cùa người bố mẹ bỉnh thường bệnh lý người trai (bệnh nhàn tuồi) có đột biển A3243G (hội chứng M ELAS) Bệnh viện Nhi Trung ương cung câp Kit tách DNA m ua từ hãng Qiagen, Cặp mồi đặc hiệu đê nhân đoạn DNA ty thê từ vị trí 3134 đến vị trí 3331 có trình tự M tF M l (3134-3155): 5’-C A A G A G A A A TA A G G C TTA C TT C ; M tR M l (3309-3331): 5’-G G A G TA G G A G G T TA G C C A TG G G , , , Trong vị trí 149C thay bàng T vị trí 3 18C thay bàng A để loại bỏ điêm cãt cùa H a e \\\ sản phẩm PCR sau K it n h â n dòng trực tiếp đặt mua từ hãng Invitrogen Các enzym e giới hạn m ua từ hãng Fermentas Các hóa chât cịn lại đêu đạt độ tinh khiết dành cho nghiên cứu sinh học phân từ P h tig p h p n g h iê n u phút đê khởi động nóng ban đâu, tiẽp tíieo cnu Ky VỢI V,, pnui uc UUH V,, giây để gắn mồi 72°c, 30 giây để kéo dài chuỗi, cuối 35 chu kỳ sản phâm giữ tiẻp 72“C o n g ị phút Sản phẩm PCR phát bầng điện di gel agarose 2%, gel polyacrylam ide 10% San phẩm PCR tinh sạch, nhân dòng vào vector pCR2.1 sàn pham nhan dòng đọc trinh tự phương pháp Sanger trẽn hệ thông máy tự động C EQ ™ 8000 (B eckm an Coulter) 3, K Ể T Q U Ả V À T H Ả O L U Ậ N 3.1 Tách DNA từ m ẫu m áu DNA m ẫu m áu tách theo kit Qiagen, chế phẩm DNA định lượng báng cách đo độ hấp thụ bước sóng 260 nm (A 260 ) đo tỷ số A 260/A Kết quà cho thấy ty so_A 260 /A 280 m ẫu DN A tưcrng ứng 1,88 1,86 1,85 Chế phẩm ADN kiêm tra độ nguyên vẹn bàng điện di ừên gel agarose 1%, kết qua thu (hinh 1) cho thay ba mâu đêu có m ột băng DNA, chứng tỏ thu DNA chế phẩm có độ cao Hình 1: Đ iện di gel từ mẫu máu G iếng 1; DNA tách G iêng 2: DNA tách G iêng 3: DNA tách agarose 1% sản phẩm tách DNA rtr máu cùa bố bệnh nhân từ máu mẹ bệnh nhân từ máu bệnh nhân 3.2 Nhân đoạn gen ty thể PCR cất sàn phẩm PCR enzyme giới hạn Đoạn gen ty thê mà chúng tơi quan tâm nằm vùng 3134-333l(có kích thước 198 bp) nhàn băng PCR với cặp mồi M tFM l M tRM l điều kiện phản ứng nêu o n g phân “N guỵên liệu phưong pháp”, sử dụng DNA khuôn tách từ máu bô, mẹ bệnh nhân Kết điện di sản phẩm PCR thu (hình 2) cho thấy với ba loại DNA làm khuôn cho phản ímg chúng tơi thu băng DNA nhân với kích thước tính tốn lý thuyết Chứng tỏ với điều kiện thành phần phản ứng lựa chọn phù hợp cho việc nhân thành công đoạn gen quan tâm cùa ty thể -200 bp Hinh 2: Điện di aạarose sàn phẩm PCR nhân đoạn gen mang đột biến A3243G cùa ty thề Giếng I: Sản phẩm PCR với ADN khuôn cùa bô bệnh ahàn) Giếng 2: Sàn phẩm PCR với ADN khuôn mẹ bệnh nhân Giếng 3: Sàn phẩm PCR với ADN khuôn cùa bệnh nhân Giếng 4: Thang chuấn DNA 100 bp 3.3 C sản phẩm PCR enzym e giới hạn Sản pham PCR với loại AD N khn sau chúng tơi tách khói gel cho cắt bàng H ae III Hinh 3: Điện di gel polycrylam ide 10 % sản phẩm cắt bàng PCR H aelll Giếng 1: Thang chuản DNA, Giếng 2: Sản phẩm PCR từ mẫu ADN bố bệnh nhân Giếng 3: Sản phâm PCR từ mâu ADN raẹ bệnh nhân Giếng 4; Sàn phẩm PCR từ mẫu ADN bệnh nhàn Giếng 5: Sán phẩm PCR từ mẫu ADN cúa bố bệnh nhản cắt bằng//ạổ III Gieng 6: Sàn phẩm PCR từ mẫu ADN mẹ bệnh rứiản căt bẳng H ae\\\ Giếng 7: Sàn phẩm PCR rtr mẫu ADN cùa bệnh nhân cắt Hae III T heo tính tốn lý thuyết HaeWl cất đoạn DNA m ang đột biến A3243G thành đoạn có kích thước lan lưện 11 bp 87 bp Ker quà điện di sản phẩm cất băng DNA nhàn (hình 3) CỈIO thay băng sán phẩm PCR với DNA khn cùa bố bệnh nhân Idìơng bj cất H ae\l\ Còn san pham PCR với DNA khuôn mẹ bệnh nhân bàn thân bệnh nhân cắt bàng //a e lll cho băng: m ột băng có kích thước ban đầu (198 bp) DNA khơng cắt hêt,_hai băng cịn lại có kích thước tính tốn lý thuyết 11 Ibp va 87 bp Kết chứng tỏ đoạn gen ty thể bố bệnh nhân không mang đột biến A3243G Còn đoạn gen ty the mẹ bệnh nhân bệnh nhân đềụ chứa ừinh tự phân cất HaelW vị frí 3243 A đựợc thay băng G K êt phần cho thấy sản phẩm phân cất mẫu bệnh nhân rõ nét mẹ bệnh nhân Điêu lý giải tương heteroplasm y gen quan tâm, mẹ tỷ lệ ty thê không mang đột biến ty thể mang đột biến cao con, mẹ khơng có biêu vê bệnh lý mà thấy Hiện tượng nàv đề cập lý giải m ốt số công trinh trước (Shanske et a l, 2004; Ballana"et al.°2008) T heo nghiên cứu trước Lê et al (2004), đột biến A3243G hội chứng M ELAS cỏ thê phát băng PCR-RFLP sử dụng enzyme A pa\ với trình tự nhận biết GGGCC/C D ạng khộng đột biến vùng có trinh tự GGACCC, bị thay A bàng G xuất m ột điểm cật Apaì Tương tự, H aelll có trình tự nhận biết phần cắt GG/CC, nên bị đột biên làm xuất điểm nhận biết phân cắt H ae\l\ Do vậy, tùy cách chọn đoạn ẹen nhân PCR, sau dùng A pal hay HaelW đoạn gen nhản nêu m ang đột biên bị căt, với người bình thưịmg thi đoạn gen nhân không bị cắt bởỊ enzym e H a elll enzyme nhận biết nucletotide (GGCC) nên trinh tự có mặt phổ biến hệ gen Cách thay thẹ nucỊetitde (G bàng T A) trình tự mơi_M tFM l M tR M l) cùa làm mât điêm cắt cúa H ae\\\ vùng mồi sản phâm PC R có thê dẻ dàng sừ dụng H aelll kỹ thuật PCR-RFLP để phát đột biên A3243G Ngoài ra, néu sau phát triển kỹ thuật PCR định lượng (real-time PCR) đoạn ADN nhân không nên dài Cách cải tiến sỡ để phát triển kỹ thuật real-tim e PCR cho phép xác định tương heteroplasm y vốn đăc trựng cùa hệ gen ty thể Đoạn gen 198 bp nhân PCR chúng tơi nhân dịng vào vector p C R sau giải trinh tự Kết giải trình tự đoạn gen cùa bệnh nhân (khơng néu đây) cho thấy có đột biến thấy A G vị trí 3243 hệ gen ty thể Tuy vậy, việc giải trinh tự gen chi để khẳng định thêm lần kết quà cùa phương pháp PCRRFLP, thực té áp dụng khơng cân thiêt kỹ thụát tơn thời gian kinh phí Tóm lại, với việc sử dụng cặp mồi cải tiến nhân thành công đoạn gen 198 bp hệ gen ty thề người, sử dụng phối hợp_ kỹ thật PCR với việc cãt sản phâm PCR bang enzym e giải hạn H a elll, sau điện di sản phâm phân cảt gel polyacrylam ide (kỷ thuật PC R -R FLP), cho phép chúng tơi phát xác đột biến A3243G ừoag hội chứng MELAS Q uy trinh sử dụng đê phát đột biên A3243G cho bệnh nhân nghi m ang loại đột biến này, TÀI LIỆU THAM KHẢO Lê Thị Bích Thảo, Đỗ Quỳnh Hoa, Nguyễn Bích iNTii, Nơng Văn Hải, Phan Văn Chi, Phạm Thị Vân Anh N inh Thị ứ n g (2004) Xác định đột biến A3243G gen tR N A ''“ ty thể từ bệnh nhân mắc bệnh ty Báo cáo khoa học Hội nghị khoa học toàn quốc “N hững vấn đề noiiiên cứu bàn khoa học sống” Hà Nội 28/10/2004 tr 463-465 N guyễn N am L ong N guyễa Bích Nhi, Phạm Vân Anh, Phan Vãn Chi (2006) Phân tịch hệ protein huyet củạ bệnh nhân mang đột biến A3243G hệ gen í R N A ''“ t>' thể Tạp chí Y học V iệt Nam s ố 8: 24-28 Trần Thi M inh N guyệt, N guyễn Bích Nhi, Lê Đức Hinh, Phan Vãn Chi (2007) Báo cáo trirơng hợp; m ột bệnh' nhân M ELAS Việt Nam mang đột biến A3243G hệ gen tR N A ''“ ty thể Tạp chí Y học Việt Nam s ỏ 1: 4-9 A nderson s B ankier AT, Barrel BG, Stađen R, Young IG (1981), Sequence and o raanization o f the hum an m itochrondrial genome, N ature 290: 457- 465 Ballana E G ovea N de Cid R, Garcia c , ArribaC, Rosell J Estivill X (2008) Detection of u^nre^comzed low level m tDNA heteroplasmy may explain the vanable pheoptypic expressivity od apparent hom oplasm ic mcDNA mutations Hum M utat 29: 248-257 B randon M C Lon M T N guyen KC Spolim s, Navathe SB, Baldi p, W allace DC (2005), A h^uman m itochondrial genom e database-2004 update Nucleic Acids Res 3 :D 1-3 Reeve AK, K rishnan KJ and Turnbull D (2008) M itochondrial DNA mutations in disease, aging and neurodegeneration Ann NY Acad Sci 1147:21-29 Shanske s, Pancrudu J, Kaufm an p, Engelstad K, Jhung s, Lu J, Naini A, Dim auro s, De Vivo DC (2004) V arying loads of the m itochondrial DNA A3243G m utation in different tissues: im plications fo r diagnosis Amer J Med Genet 130A: 134-137 SUMMARY A nalysis o f the m itochondrial genome A3243G in a M ELAS syndrom e patient by a m odified PC R -R PLP method T rinh Le Phuong, Chu Van Man and Phan Tuan Nghia A modified PC R -R FLP m ethod for detection o f the m itochondrial A3243G in the MELAS syndrom w as reported DNA from a male patient with the M ELAS syndrome and his parents was isolated from their blood, a DNA fragment ranging from 3134 to 3331 was am plified by PCR using M tfM l and M tR M l primers with one unmached nucleotide in each prim er to avoid the HaeWl site in th eir PCR products An am plified band o f 198 bp was obtained from the DNA samples T he PC R products were then cut with H aelll and run on 10% polyacrylam ide gel elecfrophoresis The banding pattern o f the samples showed that there was a mutation (A was replaced with G) at the 3243 position the human mitochondrial genome The PCR-amplified was also cloned into p C R vector and sequenced to further confirm o f the mutation presence The m odified m ethod could be used to accurately detect the A3243G m utation in MELAS syndrome patients Người thẩm định nội dung khoa học: ẦìLto V7l Cc nì/-i Ỉ*V A ị 'Tuị' ì ■ ^ ’ ' ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN KHOA SINH HỌC TRỊNH LÊ PHƯƠNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIÉN A3243G HỘI CHỨNG MELAS KHÓA LUẬN TỚT NGHIỆP HỆ ĐẠI HỌC CHÍNH QUY Ngành: Sinh học Hà Nội - 2009 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN KHOA SINH HỌC TRỊNH LỀ PHƯƠNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIÉN A3243G HỘI CHỨNG MELAS KHÓA LUẬN TỔT NGHIỆP HỆ ĐẠI HỌC CHÍNH QUY Ngành: Sinh học Cán hng dẫn; PGS.TS Phan Tuân Nghĩa TH.S Chu Văn Mẩn Hà Nội - 2009 Báo cáo đề tài QT 08-31 PHIÉU ĐĂNG KÝ KÉT QUẢ NGHIÊN c ứ u KH-CN Tên đề tài (hoặc dự án): Tìm hiếu bệnh ty người bẳng phương pháp sinh học phân tử Mã số: Q T 08 -31 Cơ quan chủ trì đê tài (hoặc dự án): Đại học Khoa học Tự nhiển, Hà nọi Địa chỉ: 334 Nguyễn Trãi, Thanh xuân, Hà nội Tel: 38588856 Cơ quan quản lý đê tài (hoặc dự án): Đại học Quôc gia Hà nội, Việt nam Địa chỉ: 144 đưÒTig Xuân Thuỷ, cầu giấy, Hà nội Tel: 38340564 Tống kinh phí thực chi: 20.000.000 đ (Hai mươi triệu đồng) - Từ ngân sách Nhà nước: 20,000.000 đ Kinh phí trường: 00 Vay tín dụng: 00 Vốn tự có: 00 Thu hồi: 00 Thời gian nghiên cứu: 12 tháng Thời gian bắt đầu; - 2008 Thời gian kết thúc: - 2009 Tên cán phôi hợp nghiên cứu; PGS.TS Phan Tuấn Nghĩa, Trịnh Lê Phương Sô đãng ký đê tài Sô chứng nhận đăng ký Bảo mật: kết nghiên cứu: Phổ biến rộng rãi; X Phổ biến hạn chế: Ngày: Bảo mật; Tóm tăt kết nghiên cứu: - Đã xác định phương pháp tách chiêt AND ty thê từ máu ngoại vi bệnh nhân nghi mắc bệnh ty thê băng việc sử dụng kit Qiagen , - Hoàn thiện phương pháp tính tốn lý thut cho việc sử dụng enzim Hae\\\ thiết kế mồi để nhân đoạn AND nghi có chứa đột biên gen (đột biến A 3243G ): _ ^ - Sử dụng cặp mồi cải tiến nhân thành công đoạn gen 198 bp hệ gen ty thể người, phối hợp kỹ thật PCR với việc cắt sản phẩm PCR enzyme giới hạn Hae\\\, điện dỉ sản phẩm phân cat gel polyacrylamide (kỹ thuật PCR-RFLP), cho phép phát xác đột biến A3243G hội chứng MELAS - Cách thay nucletitde (G T A) trình tự mồi MtFMl M tR M l) làm điểm cắt Hae\\\ vùng mồi sản phẩm PCR vi dễ dàng sứ dụng H ae\l\ tron^ kỹ thuật PCR39 Báo cáo để tài QT 08-31 RFLP đê phát đột biên A3243G - Giải trình tự đoạn AND nhân - Cách cải tiến sở để phát triển kỹ thuật real-time PCR cho phép xác định tượng heteroplasmy vốn đăc trựng hệ gen ty thể - Bài báo: 01 báo - Đáo tạo: 01 cử nhân Kiên nghị vê quy mô đôi tượng áp dụng nghiên cứu: - z ^ Chủ nhiệm đề tài Thủ trưỏng quan chủ trì đề tài Chủ tịch Hội đồng đánh giá thức Thủ trưởng quan quản lý dề tài p(^S JC fL.G »Â W Đ Ó C Họ tên Chu Văn Mần Học hàm Học vị Thc s ia.lRô4ớđ*AHItH0AHC-CễN TPUNG BAN Kớ tờn úng du 40 nghỊ ... nội - Trịnh Lê Phương, Khoa Sinh ĐHKHTN, ĐHQG Hà nội Báo cáo đề tài QT 08-31 Tên đề tài: Tìm hiểu bệnh ty thể người phương pháp sinh học phân tử Mà S? ?: Q T 08-31 Chủ trì đề tài: Chu văn Man Các...Báo cáo đề tài QT 08-31 Tên đề tài: Tìm hiểu bệnh ty thể người phưomg pháp sinh học phân tử M à S Ố : Q T 08-31 Chủ trì đề tài: Chu văn Mẩn Các cán tham gia: - PGS.TS Phan Tuấn Nghĩa,... : : : : : : : : : : : : Thán kinh: Ể i M r j ’^ S u Z b ă x ia fìệ r n a i''^ ì \ Cơ - Xươne - Khớp: , '' : \ : : : ì ỉ :m Tai - Mui - Hong, Răng '' Hàm - Mặt, Mắt, Dinh dương bệnh lý khác: