Tìm hiểu các Enzym bảo vệ ôxi hoá của nấm linh chi Ganoderma Lucidum : Đề tài NCKH. QT.03.16

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN ■ • • • Tên đề tài: TÌM HIỂU CÁC ENZYM BẢO VỆ ƠXI HỐ CỦA NẤM LINH CHI GANODERMA LUCIDUM Chủ trì đề tài: Th.s Tạ Bích Thuận Cán tham gia: Th.s Đậng Quang Hưng CN Phạm Kiên Cường pT / Hà Nội - 2005 õ ĩ ~0 Báo cáo tóm tắt: a Tên đề tài: Tìm hiểu enzym bảo vệ oxi hố Nấm Linh chi Ganoderma lucidum M ã số: QT - - b Chủ trì đề tài: Ths Tạ Bích Thuận c Các cán tham gia: Ths Đặng Quang Hung CN Phạm Kiên Cường d Mục tiêu nội dung nghiên cứu: Mục tiêu: Đóng góp thêm số dẫn liệu có mặt số enzym bảo vệ oxi hoá nấm Ganoderma lucidum catalase, superoxid dismutase, NADH oxidase điều kiện ni cấy phịng thí nghiệm sâu nghiên cứu enzym NADH oxidase nấm Ganoderma lucidum Nội dung: - Đánh giá sơ hoạt độ enzym bảo vệ oxi hoá cataỉase, superoxid dismutase, NADH oxidase nấm Ganoderma lucidum - Bước đầu tinh enzym NADH oxidase nấm Ganoderma lucỉdum - Nghiên cứu số tính chất enzym NADH oxidase nấm Ganoderma lucidum e Các kết đạt được: - Đánh giá tốc độ mọc nấm Linh dạng thể dạng sinh khối - Đánh giá hoạt độ enzym catalase, superoxid dismutase, NADH oxidase nấm Ganoderma lucidum mẫu thể sinh khối - Tinh phẩn enzym NADH oxidase nấm Ganoderma lucidum - Nghiên cứu độ bền nhiệt, ảnh hưởng ion kim lo i, khả sinh H20 enzym NADH oxidase từ nấm Ganoderma lucidum f Tình hình kinh p h í: Tổng kinh phí đề tài là: 15.000.000 VNĐ Thanh tốn dịch vụ cơng cộng: 600.000 VNĐ Vật tư văn phịng: 250.000 VNĐ Hội nghị: Chi phí th mưón: 900.000 VNĐ 7.000.000 VNĐ Chi phí nghiệp vụ chun môn: 5.000.000 VNĐ Summary a) The title of subject: lucidum Numerical code: b) The grant holder: c) The Participants: Investigation on some anti-oxidation enzymes of Ganoderm QT - 03 - 16 M.Sc Ta Bich Thuan M.Sc Đang Quang Hung B.Sc Pham Kien Cuong d) Objectives and contents * Objectives: Contribute die additional data to the presence of several anti-oxidation enzymes in Ganoderma lucidum, such as catalase, superoxiđe dismutase, NADH oxidase in culturing conditions and further investigate NADH oxidase from Ganoderma lucidum * Contents : > Partial evaluation of the activity of anti-oxidation enzymes catalase, superoxide dismutase, NADH oxidase from Ganoderma lucidum > Partial purification of NADH oxidase from Ganoderma lucidum > Investigate several characteristics of NADH oxidase from Ganoderma lucidum e) The obtained results: > Evaluation of the growth rate of Ganoderma lucidum fruit body and biomass > Evaluate the enzyme activity of catalase, superoxide dismutase, NADH oxidase from Ganoderma lucidum fruit body and biomass > Partially purified NADH oxidase from Ganoderma lucidum > Investigation of thermastability, the effect of metal ion, the capable of producing HzO of NADH oxidase from Ganoderma lucidum CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI XÁC NHẬN CỦA BAN CHỦ NHIỆM KHOA (ký ghi rõ họ tên) (ký ghi rõ họ tên) XÁC NHẬN CỦA TRƯỜNG tì G s cJỈ* sỷJu > MỤC LỤC MỞ ĐẦU TỔNG QUAN TÀI LIỆU Giói thiộu nấm Linh Chi Ganoderma lucidum .2 1.1 Vị trí nấm Linh Chi hộ thống phân lo i 1.2 Đặc điểm sinh học Ganoderma lucidum Giới thiệu chung oxi hoá khử sinh học 2.1 Oxi hoá khử sinh h ọ c 2.2 Oxi hình thành hợp chất gây tổn thương oxi hố có chứa o x i Các enzym bảo vệ tổn thương oxi hoá 3.1 Superoxide dismutase (EC 1.15.1.1) .7 3.2 Catalase (EC 1.11.1.6) 10 3.3 Các NAD(P)H oxidase (NOX) 11 NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 16 KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u 18 Đánh giá tốc độ phát triển nấm Ganoderma ỉucidum điều kiện nuôi cấy dịch thể 18 Đánh giá tốc độ phát triển nấm Ganoderma lucidum điều kiện nuôi cấy cho th ể 18 Xác định hoạt độ enzym NADH, CAT, SOD cùa nấm Ganoderma lucidum 19 3.1 Kết xác định hoạt độ enzym NADH oxidase (NOX) nấm Ganoderma lucidum 19 3.2 Kết xác đinh hoạt độ enzym catalase (CAT) nấm Ganoderma lucidum 20 3.3 Kết xác đinh hoạt độ enzym superoxit dismutase (SOD) nấm Ganoderma lucidum 21 Bước đầu tinh nghiên cứu số tính chất NOX từ sinh khối nấm Ganoderma ỉucidum 21 Nghiên cứu m ột số tính chất enzym NOX nấm Ganoderma lucidum 23 5,1 Độ bền n h iệ t 23 5.2 Ảnh hưởng số ion kim lo ại 23 5.3 Xác định NOX nấm Ganoderma lucidum thuộc loại sinh H20 hay sinh H20 24 THẢO LUẬN 25 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO 29 MỞ ĐẦU Nấm Linh Chi từ lâu coi loại thuốc dân gian có tác dụng tăng cường sức khỏe chữa trị nhiều loại bệnh bệnh gan, thận, bệnh tiểu đường, bệnh dị úng, bổ phổi, cắt ho suyễn, điều hoà huyết áp, làm giảm lượng đường máu, tăng cường thị lực, giảm colesteron, chống ỉão hoá cố khả chống oxy hố cao Nấm Linh Chi có lồi có khả tăng cường thải độc gan, kích thích hệ thống miễn dịch hoạt động có hiệu cao Các nghiẻn cứu y dược học cho thấy loài Linh Chỉ khác sản sinh loại hợp chất sinh học khác có khả biệt dược q Ngồi nấm Linh Chi cịn kìm hãm sinh tổng hợp ADN mói tế bào ung thư, kìm hãm phát triển khối u, tàm giảm đau củã bệnh nhân di Trải qua thời gian dài lịch sử tiến hoá với biến động thời tiết, khí hậu mơi trường, Linh Chi trường tồn giữ nguyên giá trị siêu dược liệu mình, nhân sâm Ở nước Châu Á Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc việc nghiên cứu, phát trién sử dụng Linh Chi triển khai với quy mô rộng lớn, phân loại học, thu hái tự nhiên, nuôi trồng chủ động, nghiên cứu thành phần hoá học, hợp chất tự nhiên, tác dụng dược liệu phương pháp điều trị lâm sàng Việt Nam với vị trí địa lý tự nhiên đặc biệt, có khí hậu nhiệt đới gió mùa, có hệ động vật thực vật đa dạng Trong năm gần đây, việc nghiên cứu Linh Chi nhiều nhà khoa học quan tâm dến, sâu tìm hiểu khả chống oxy hố q trình bảo vệ tổn thương oxy hoá nấm Linh Chi chưa nghiên cứu đến Với mục đích nhằm nghiên cứu, tìm hiểu đánh giá khả dược liệu sẵn có nấm Linh C h i, chúng tơi giao thực đề tài "Tim hiểu enzym bảo vệ oxi hoá nấm Linh Chi" Đề tài nghiên cứu nhằm mục đích sau: Xác định hoạt tính số enzym chống oxi hố catalase, superoxid dismutase, NADH oxidase dịch chiết nấm Linh Chi Nghiên cứu số tính chất enzym bảo vệ oxi hố có hoạt tính cao nấm Linh Chi Thông qua mục tiêu nghiên cứu nhằm cho phép tìm hiểu thêm enzym chống oxi hố nấm Linh Chi TỔNG QUAN TÀI LIỆU Giới thiệu nấm Lỉnh Chỉ Ganoderma lucidum ỉ ỉ Vị trí nấm Linh Chi hệ thống phân loại Các nấm Linh Chi trước xếp vào nhóm nấm nhiều lỗ (polypore) Lịch sử nghiên cứu hệ thống tự nhiên họ Linh Chi nói lịch sử nghiên cứu cấu trúc bào tử đảm chúng Từ 120 năm trước, Karten, nhà nấm học Phần Lan, lần tách từ nấm polypore nhóm nấm đặc biệt, xây dựng nấm độc lập Gânoderma Karst theo kiểu bào tử đảm đặc trưng Đó kiểu bào tử đảm có lớp vỏ kép, hình trứng cụt, bề mặt sần sùi mụn cóc, gị nhỏ, nhờ việc phân loại nấm Linh Chi tiến bước quan trọng Người ta dễ dàng lọc từ nhóm Polypore, Formes, Boletus lồi mà vị trí tự nhiên chúng thuộc Ganoderma, Chính Patouillard (1889) góp phần to lớn việc khái quát kiểu bào tử đặc trưng Ganoderma Karst Tuy thân tên chi - derma nghĩa lớp vỏ, gamo láng bóng thể nét chủ đạo hình thái thể bên ngồi đa số chúng có lớp vỏ láng bóng chói màu vemi, màu từ vàng - vàng cam - đỏ hung, nâu tím - nâu đen [4] Tuy nhiên, tính đồngnhất cao cấu trúc bào tử loài chi đặc trưng Q trình phân hố Ganoderma Karst Amauroderma Murr mối quan hệ chặt chẽ chúng chủ yếu dựa vào cấu trúc đảm bào tử Donk - nhà nấm học Haỉan xây dựng nên họ Linh Chi Ganodermataceace Donk, lần tách khỏi họ polyporaceace thừa nhận rộng rãi [1] Trong q trình phân hố dạng sống nhóm Ganoderma từ xuống đất với q tìn h tiến hố cấu trúc bào tử đảm, Linh Chi phân lo i: Giới nấm Mycetalia Ngành nấm đảm Basiđiomycota Lóp nấm đảm Basidiomycetes Bộ nấm lỗ Aphyllophorales Họ Linh Chi Ganodermataceace Chi Ganoderma Loài Ganoderma lucidum 1.2 Đặc điểm sinh học Ganoderma lucidum 1.2.1 Đặc điểm hình thái Nấm có thể có cuống dài, ngắn hay khơng có cuống Mũ nấm dính lộch hay dính bên, màu nâu đị, bóng lống, mũ nấm dạng thận, đơi xịe hình quạt nhiều dị dạng [4] Trên mặt mũ có vân gợn tầm có tia rãnh phóng xạ, màu sắc từ vàng nâu - vàng cam - đị cam - đỏ nâu - nâu tím - nâu đen mũ nấm sẫm màu dần già Đường kính tán biến động từ 2-30 cm, dày 0,8 - 2,5 cm Thit nấm dày từ 0,4 - cm màu vàng kem - nâu nhạt - trắng Khi dạng tươi, thịt nấm mềm, dai, già khô chắc, cứng nhẹ Hệ sợi nấm kiểu trimitic, đầu tận lớp sợi phình hình trúng màng dày đan kít vào tạo thành lớp vỏ láng phủ mặt mũ cuống 1.2.2 Đặc điểm sinh sản Ganoderma lucidum Thể sinh sản dạng ống, dày từ 0,2 - l,7cm gắn ống nhỏ thẳng đứng, miệng tròn trắng - vàng ánh xanh, có đảm bào tử , hình trứng - trứng cụt Bào tử giá có vỏ với lớp cấu trúc hai lớp màng, màng nhẩn không màu, màng màu nâu gỉ sắt, phát triển thành gai nhọn vươn sát màng ngồi Đường kính - 6,5 X , - 1 , cm [4] 1.2.3 Chu trình sống Ganoderma lucidum Các bào tử đảm đơn bội, điéu kiện thuận lợi nảy mầm tạo hệ sợi sơ cấp (primary hyphase) Trong thực nghiệm tỷ lệ nảy mầm nhiệt độ 28 - 30°c thấp Hệ sợi sơ cấp đom bội mau chóng phát triển, phối hợp vói (plasmogamie) tạo hệ sợi thứ cấp (sợi song hạch dicargon hyphase) phát triển, phân nhánh mạnh, lan khắp giá thể Lúc này, thường có tượng hình thành bào tử vơ tính màng dày (gasterospores - Chlamydospores) Chúng dễ dàng rơi gặp điều kiện phù hợp nảy mầm cho hệ sợi song hạch tái sinh [2] Hệ scd thứ cấp phát triển mạnh đạt tới giai đoạn cộng bào, tức vách ngăn (septum) hồ tan Tiếp giai đoạn sợi bện kết (mating) để chuẩn bị cho hình thành mầm mống thể Đây giai đoạn phân hóa hệ sợi Từ hệ sợi nguyên thuỷ phát triển thành sợi cứng (skeletal hyphase) màng dày, phân nhánh thành cấu trúc bó gắn chặt sợi bện (binding) phân nhánh mạnh Từ phát triển thành mầm mống thé màu trắng mịn vươn dài đến trụ tròn mập Dần dần phần đỉnh trục bắt đầu xoè thành tán, lúc lớp vỏ láng đỏ da cam dần xuất Tán lớn phát triển dần thành bào tầng (hymenỉum) bất dầu phát tán bào tử đảm liên tục khỉ nấm già sẵm màu, khô tốp lại lụi dần vòng - tháng 1.2.4 Các yếu tố sinh thái Ganoderma lucidum Nấm Linh Chi mọc gốc, rễ sống chết, nhiều cầy gỗ mọc rừng ăn quả, đặc biệt Đậu lim xanh, lim vàng, phượng vĩ bị nấm xâm nhập Là loài phần bố rộng, điều kiện phát triển tốt nấm dạng sợi 28 - 30°c Quả thể gặp rộ vào mùa mưa từ tháng - 1 Nấm mọc tốt bóng rợp, có ánh sáng khuếch tán nhẹ Do có lớp vỏ bóng láng mà chụi nắng rọi chụi mưa liên tục Đối với hộ sợi nấm, nuôi cấy môi trường dịch thể với nhiệt độ thích hợp từ 27 - 32°c, phát triển tốt pH từ - 8,5 Sau 15 - 20 ngày phần sợi già bắt đầu ngả vàng mầm thể dễ xuất [1] 1.2.5 Thành phẩn hoá dược đặc tính dược lý Ganoderma lucidum Vói phuơng pháp thơng dụng, người ta phân tích hợp chất tự nhiên chủ yếu có Linh chi thường thấy Nước : 12 - 13 % Cellulose : 54 - 56 % Lignine : 13 - 14 % Hợp chất Nitơ : 1,6 - 2,1 % L ipit: 1,9 - 2% Hợp chất phenol 0,08 - 0,1% Hợp chất sterol toàn phần : 0,11 - 0,16% Saponin toàn phần : 0,3 -1,33 Akaloiđ glucosid tổng s ố : 1,82 - 3,06% Ngồi hợp chất nhóm lacton lên đến 2%, với số hợp chất khác [2] Giới thiệu chung oxi hoá khử sinh học 2.1 o x i hoá khử sinh học Oxi hố - khử q trình mà có cho nhận điện tử, chất nhận điện tử gọi chất oxi hố, cịn chất cho điện tử gọi chất khử Trong thể sống thường xuyên xảy phản ứng oxi hoá - khử chúng gắn liền với nhiều trình trao đổi chất, trao đổi lượng tế bào thể Điển hình phản ứng oxi hố khử thể hệ thống chuỗi vận chuyển điện tử nằm màng ty thể lục lạp trình oxi hố chuỗi axít béo Chính từ q trình oxi hoá khử mà dạng oxỉ hoạt động bao gồm gốc superoxide ( 2‘), peroxide hydro (H20 2) gốc hydroxyl (*OH) hình thành Sự tích luỹ sản phẩm oxi hoá nồng độ cao nguyên nhân dẫn đến tổn thương oxi hố thể sinh vật [7] Ngồi q trình phản ứng oxi hố diễn thể dẫn đến hình thành hợp chất oxi hố fác động yếu tố mơi trường bên lên thé trực tiếp gián tiếp làm gia tăng hình thành hợp chất oxi hố 2.2 Oxi hình thành hợp chất gây tổn thương oxi hố có chứa oxi 2.2.1 Vai trò oxi thể sống Quá trình quang hợp xuất cách khoảng 2,4 tỷ nãm đólà mốc quan trọng trongsự tiến hố sinh giới Sự tích luỹ ngày tănglượng oxi cho phép phát triển nhiều dạng hô hấp có sử dụng oxi cách có hiệu Những dạng hô hấp sử dụng oxi chất nhận điện tử cuối để tạo H20 đồng thời giải phóng lượng cho hoạt động tế bào Q trình hơ hấp có sử dụng oxi thời tạo áp lực chọn lọc mà kết hình thành enzym bảo vệ oxi hoá khác hệ thống sinh vật 2.2.2 Cơ chế hình thành dạng hợp chất có chứa oxi hoạt động Oxi chất oxi hố - khử cao ngược lại H20 chất oxi hố - khử thấp nhiều so với phân tử oxi Từ phần tử oxi cần điện tử proton để tạo phân tử HzO Các mức phản ứng xảy sau: O2 + C —> 2* (gốc Superoxide) 2*+ e + 2H+ H20 (peroxide hydro) H20 + e + H+ í ; H20 + *OH (gốc hydroxyl) OH* + e + H+ H20 Trong số hợp chất 2*, H20 2, *OH xếp vào hợp chất chứa oxi hoạt động Ngồi thuộc vào nhóm hợp chất có chứa oxi hoạt động cịn có gốc khác NO*, N 2\ alkyl tự (R‘) hay alkoxyl tự (R 0‘), peroxide hữu (ROOH), ion o a * peroxynitrite (ONOOH) 3.3 Kết xác định hoạt độ enzym superoxit dismutase (SOD) nấm Gal Kết phân tích hoạt độ enzym SOD mẫu Gal thể hình 8, nhìn vào đồ thị cho ta thấy hoạt độ riêng enzym SOD thể 1,517 đv/mgPr, dạng sinh khối hoạt độ riêng tương ứng với 10,279 đv/mgPr Hoạt tính SOD SOD sinh khối SOD thé Hình Xác định hoạt độ enzym SOD Với biểu đồ xác định hoạt độ enzym hình cho thấy hoạt độ enzym SOD dạng sinh khối cao hẳn so với hoạt độ enzym dạng thể Sau đánh giá sơ hoạt độ enzym CAT, SOD, NOX chọn enzym NADH oxidase để tiếp tục nghiên cứu Bước đầu tinh nghiên cứu số tính chất NOX từ sinh khối nấm Gal Trên sở xác định hoạt độ enzym CAT, SOD, NOX chọn enzym NOX để tách, tinh nghiên cứu số tính chất Để tinh NOX từ sinh khối nấm GaU tiến hành thu dịch chiết bổ sung thêm 0,1 thể tích đệm Tris -H Q lOOmM, pH 8,0, đé nồng độ cuối đệm lOOmM, pH đảm bảo đạt 8,0 cho sắc ký qua cột gel DE-52, cột Sigma có kích thước 3x14cm, cân với đệm Phần prôtein gắn cột rửa chiết gradient NaCl từ 50mM - lOOOmM pha đệm Tris- H a lOOmM, pH 8,0 21 Kết phân tích protein hoạt độ NOX cùa phân đoạn sắc ký qua cột thấy phẩn dịch khơng hấp thụ khơng có hoạt độ NOX Phần hấp thụ đẩy dạng đỉnh protein chính, ttong có đỉnh đẩy nồng độ muối khoảng 370mM có hoạt độ NOX Sử dụng diện di SDS-PAGE để đánh giá độ chế phẩm NOX sau qua cột DE-52 (hình 9) cho thấy chế phẩm có băng protein rõ nét với kích thước khoảng 40 kDa số băng protein khác rơ nét (Hình cột 2) Để tiếp tục tinh NOX từ n ân Gal, tiến hành tập trung phân đoạn có hoạt độ NOX qua cột DE-52, cô đặc mẫu centricon cho sắc ký qua cột lọc gel Sephadex G-100 Cột có kích thuớc lx70cm, cân với đệm Kết rủa chiết phân tích protein hoạt độ NOX phân đoạn qua cột Sephadex G-100 cho thấy có đỉnh protein chính, ữong đỉnh thứ có hoạt độ NOX Kết kiểm tra độ chế phẩm sau qua bước lọc gel cho thấy ngồi băng protein 40 kDa cịn số băng khác có mặt chê phẩm, cho thấy chế phẩm chưa tinh hoàn toàn cần tiếp tục tinh M kDa 97 66 45 30 20,1 14,4 Hình : Kết điện di phổ bãng protein cùa nấm Gal Cột M: Thang chuẩn protein Cột 1: Dịch mẫu thô nám Gal; cột : Mẫu nám Gal chạy qua cột DE-52 Côt 3: Mẫu nấm Gal chạy qua cột l ọ c gel G -100 22 Nghiên cứu số tính chất enzym NOX nấm Gal Sau thu chế phẩm NOX tinh phần qua bước sác ký trao đổi ion sắc ký lọc gel, tiến hành tìm hiểu số tính chất enzyme 5.1 Độ bền nhiệt Kết phân tích độ bền enzym NOX cách ủ enzym nhiệt độ khác sau xác định hoạt độ cịn lại (hình 10) cho thấy enzym NOX nấm Gaỉ loại tương đối bền nhiệt, nhiột độ 30-60 °c sau 15 xử lý enzym giữ hoạt độ gần ban đầu Tuy vậy, xử lý 80°c, ưong 15 phút enzym cịn 10% hoạt độ 0.60.5 B n m ■ Hoạt độ (mU/mgPr) 0.4 m U /m gP r 0.30.20.1- 0-1 30 60 80 N hiệt độ Hình 10: Độ bền với nhiệt enzym NOX 5.2 Ảnh hưởng sơ ion kim loại Kết phân tích ảnh hưởng ion kim loại (Ca2+, Cu2+, Fe3+, Mg2+, Zn2+) anion F lên hoạt độ NOX (hình 11) cho thấy có Fe3+ nồng độ 3-4 mM có khả làm tăng phần hoạt độ NOX Các ion Ca2+, Mg2+ Zn2+và anion F khơng ảnh hưởng đến hoạt độ enzym Cịn ion Cu2+ nồng độ mM ức chế hoạt độ NOX 23 Nồng độ (nM ) Hình 11: Anh hưởng ion kim loại lên hoạt độ NOX 5.3 Xác định NOXcủa nấm Gal thuộc loại sinh H20 hay sinh H20 Theo nghiên cứu khác nhau, NADH oxidase sinh vật phân thành hai nhóm : nhóm thứ xúc tác cho phàn ứng oxi hố phân tử NADH đến oxi hình thành phân tử H20 2, gọi NOX sinh H20 Nhóm thứ hai oxi hố phân tử NADH tạo H2Or nên có tên NOX sinh H20 Kết xác định lượng H20 sau phản ứng giũa NADH enzym cho thấy H20 khơng hình thành sau phản ứng, chứng tỏ NADH oxidase nấm Gal thuộc nhóm sinh H20 24 THẢO LUẬN Bước đầu tìm hiểu enzym bảo vệ oxi hố Nấm Linh Chi, chúng tơi tập trung vào ba enzym chính, superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), NADH oxidase (NOX) Đây enzym bảo vệ tổn thương oxi hố có mặt hầu hết thể sinh vật sống tự nhiên Các enzym nghiên cứu kỹ đối vói Nấm Linh Chi Ganoderma lucidium cịn cơng bố kết nghiên cứu enzym Các kết nghiên cứu chúng tơi q trình sinh trưởng phát triển nấm Gal cho thấy điều kiện nuôi cấy sinh khối hệ sợi nấm Gal, phát triển thích hợp điều kiện 26 - 28°c Tốc độ mọc sợi từ 150 - 200 ml/ giai đoạn phát triển tối thích Trong điều kiện ni cấy cho thể cho thấy hệ sợi phát triển tốt biên độ nhiệt dao động từ 26 - 30°c Sau khoảng - tháng nấm phát triển thành thục cho suất tương đối thấp Kết nghiên cứu phù hợp với kết công bố tác giả Trịnh Tam Kiệt, Lê Xuân Thám Kết điều tra chúng tơi có mặt ba enzym nấm Gal cho thấy ba enzym bảo vệ oxi hoá SOD, CAT NOX nấm Gal, thấy ba enzym có mặt nấm Gal dạng sinh khối thể Tuy nhiên, có khác hoạt độ enzym hai loại mẫu này, cụ thể enzym superoxide dismustase (SOD), dạng sinh khối thể thấy có mặt enzym này, dạng thể hoạt độ enzym xuất mức hoạt độ thấp - 1,517 đv/mg Pr, dạng sinh khối 10,279 đv/ mg Pr Đối với enzym CAT, điều tra ừên hai mẫu thể sinh khối nấm Gaỉ Kết cho thấy enzym có mặt hai loại mẫu Bước đầu phân tích hoạt độ enzym cho thấy enzym CAT dạng thể cao chút so với mẫu dang sinh khối Mức so sánh thể hình Về enzym NOX, xác định hoạt độ enzym này, bước đầu chúng tồi nhận xét hoạt độ enzym NOX cuả nấm Gaỉ nhìn chung tương đối thấp, đạt khoảng 0.049 đv/g nguyên liệu tươi Nhìn vào biểu đồ xác định hoạt độ enzym NOX hình cho thấy hoạt độ enzym NOX nấm Gal dạng sinh khối cao so với dạng thể 25 Tiếp theo kết bước đầu thu sau xác định hoạt độ ba enzym bảo vệ oxi hoá nấm Gứ/, SOD, CAT NADH oxidase, chọn enzym NOX làm đối tượng nghiên cứu sâu thêm Sau chiết lượng protein dạng dịch thô từ sinh khối sợi nấm Gal, bước đầu tinh enzym phần phương pháp sắc ký qua cột gel trao đổi ion DE -52 Các trình cho mẫu chạy qua cột trao đổi ion, chế phẩm thu qua phân đoạn đẩy khỏi cột kết phân đoạn thu bao gồm có ba đỉnh protein chính, có đỉnh đẩy mẫu với nồng độ muối đệm đẩy 370 mM xuất hoạt độ enzym NOX Kết sử dụng cột gel trao đổi ion DE -52 cho thấy loại 90% protein không mong muốn từ dịch chiết thô ban đầu, bước hiệu để bước đầu tinh enzym NOX từ nấm Gal, phân đoạn có hoạt tính enzym NOX tập trung lại tiếp tục cho qua cột lọc gel Sephadex G100 Kết thu hình 9, kiểm tra hoạt độ riêng NOX sau qua cột gel tăng lên đáng kể Khi phân tích phổ băng enzym NOX kĩ thuật điện di sử dụng SDS - PAGE để đánh giá độ cùa chế phẩm cho thấy mẫu nấm Gal có băng protein rõ nét với kích thước khoảng 40 kDa Theo bàng 40 kDa NOX Tuy vậy, chế phẩm thu số băng protein khác cần tiếp tục tinh Để sâu tìm hiểu kỹ thêm enzym NOX nấm Linh Chi, nghiên cứu thêm sơ' tính chất enzym Với kết phân tích độ bền nhiệt enzym NOX xác định enzym có tính tương đối bền nhiệt, 80°c xử lý mẫu 15 phút enzym cịn lại 10% hoạt độ ban đầu Nghiên cứu tính chất ảnh hưởng số ion kim loại cho thấy biểu đồ hình 11 có Fe3+ nồng độ 3-4 mM có khả làm tăng hoạt độ enzym NOX ion khác anion F " không ảnh hưởng đến hoạt độ enzym Với ion Cu2+ mM cho thấy có khả ức chế hoạt độ enzym Các nghiên cứu enzym NOX xác định enzym NOX nhóm enzym xúc tác cho phản ứng oxi hố khử với tham gia oxi phân tử chất NADH Enzym phổ biến nhiều loài sinh vật Enzym NOX thường gắn mặt màng tế bào Các nghiên cứu trước cho thấy enzym phân chủ yếu thuộc hai nhóm Một nhóm enzym NOX xúc tác phản ứng oxi hố phân tư NADH để tạo thành H20 nhóm thứ hai xúc tác cho phản ứng oxi hố phân từ NADH để tạo hai phân tử H20 Do vậy, để xác định xem enzym NOX nấm Linh Chi thuộc nhóm nào, chúng tơi xác định lượng H20 sau phản ứng NADH enzym Kết cho thấy lượng H20 2không hình thành sau phản ứng, chứng tỏ NADH oxidase nấm Linh Chi thuộc nhóm sinh nước 27 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Điều tra hoạt độ ba enzym bảo vệ oxi hoá ỉà enzym SOD, CAT NOX dạng mẫu thổ sinh khối thấy có khác hoạt độ enzym hai loại mẫu Bước đầu thu chế phẩm tinh enzym NOX phương pháp sắc ký qua cột gel trao đổi ion DE-52 cột lọc gel Sephadex G-100 cho thấy chế phẩm có băng protein khoảng 40 kDa Ngồi cịn có số băng protein khác Xác định tính chất enzym NOX nấm Gal cho thấy enzym thuộc nhóm sinh nước, bền nhiệt hoạt hoá Fe3+ ức chế Cu2+ Kiến nghị Đối tượng nghiên cứu loại nám có tính dược liệu cao, gần nâng lên hàng biệt dược Yêu cầu điều tra sâu dạng thể, phần tinh enzym cần làm thêm loại cột khác để thu chế phẩm có độ tinh Cần có thêm kết so sánh giũa loại nấm Linh Chi nuôi trồng với loại cổ Linh Chi 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Chuyên san Nấm Linh Chi Ganodermataceae Denk - Bộ Y tế xuất 1995 Lê Xuân Thám - Nấm Linh Chi Dược Liệu quý Việt Nam, Nhà xuất mũi Cà Mau -1996 Nguyễn Quang Vinh, Bùi Phương Thuận, Phan Tuấn Nghĩa - Thực tập Hoá sinh học - Nhà xuất Đại Hoc Quốc Gia - 2004 Trịnh Tam Kiệt - Nấm lớn Việt Nam, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật - Hà N ộ i , 1981 Tài liệu tiếng Anh Abe, Y., Okazaki, T., (1987), “Purification and properties of the manganese superoxid dismutase from the liver of bullfrog Ranacatesbeiana”, Arch Biochemophys., 1, pp 241-248 Aebi, H E., (1987), "Catalase" In: Methods of enzymatic Analyis, 3, eds Bermeyer, J., Grabl, M., VCH Publishers NewYork., pp 273-285 Amstad, p., Cerutti, p., (1990), "Genetic Modulation of the cellular antioxidants defense capacity", Eviron Health Perspect., 88, pp 77-82 Barrière, G , Bruckner, R., Talon, R., (2001), “Characterization of the Single Superoxide dismutase of Staphylococcus xylosus”, Appl Environ Microbiol., 67, pp 4096-4104 Benov, L., Sage, H., Fridovich, I., (1997), “The copper-and zinc-containing superoxide dismutase from Escherichia coir, Molecular weight and stability, 340, pp 305-310 10 Canvin, J., Langford, p R., Wilks, K E., Kroll, J s, (1996), “Identification of sodC encoding periplasmic [Cu,Zn]- superoxide dismutase in Salmonella”, Fems Microbiol., 136, pp 93-98 11 Chueh, P I , (2000), “Cell membrane redox systems and transformation”, Antioxid Redox Signal., 2(2), pp 177-187 12 Cocco, D., Rinaldi, A., Savini, I., Cooper, J M., Bannister, J V., (1988), "M A n H nvirlac*> f m m thí» p vtrp in p tVif»rmnnlii T h o rm iie n n tm tirtiv Y T I "NADH oxidase from the extreme thermophile Thermus aquatic us YT-1 Purification and characterisation", Eur J Biochem., 174, pp 267-271 13 David Toomey and Stephen, G M., (1998), "Purification and characterisation of NADH oxidase from Thermus aquaticus YT-1 and evidence that is function in a peroxide reduction system", Eur J Biochem., 251, pp 935-945 14 Faư, s B-, Kogoma, T., (1991), “Oxidative stress responses in Escherichia coli and Salmonella typhimurium”, Microbiol Review (USA)., 55(4), pp 561-585 15 Forest, K T., Langforf, p R., Kroll, J s., Getzoff, E D., (2000), “Cu, Zn Superoxide dismutase structure from a microbial pathogen establishes a class with a conserved dimer interface”, J Mol Biol., 296, pp 145-153 16 Fridovich, I., (1989), " Supeoxide dismutase", J Biol Chem., 264, pp 77617764 17 Higuchi, M., Shimada, M., Matsumoto, J., Yamamoto, Y., Rhaman, A., Kamio, Y., (1994), "Molecular cloning and sequence analysis of the gen encoding the H20 2-forming NADH oxidase from Streptococcus mutans", J Gen Microbiol., 139, pp 2343-2352 18 Kono, Y., Fridovich, I., (1983), “Isolation and of characterization the pseudocatalase of Lactobacillus plantarwrì\ J Biol Chem., 258, pp 60156019 19 Leammli, V K., (1970), “Cleavage of structure protein during the assembly of the head of bacterophage T4”, Nature., 227, pp 680-685 20 Lowry o H., Rosebrough, N J., Farr, A L., Randall R J., (1951), “Protein measurement with the folin phenol reagent , J Biochem., 193, pp 265-270 21 Martin, M E., Byers, B B., Olson, M o J., Salin, M L., Arceneaux, J E L., (1986) “A Streptococcus mutans Superoxide dismutase that is active with either manganese or iron a cofactor”, J Biol Chem., 261, pp 9361-9367 22 Me Cord J M., Fridovich, I., (1969), “Superoxid dismutase an enzymic funtion for erythocuprein”, J Bio Chem., 244, pp 6049-6055 23 Morre, D J., Bridge, A., Wu, L Y., Morre, D M., (2000), Preferential inhibition by (-)-epiGa/locatechin-3-Gfl/late of the cell surface NADH oxidase 30 and growth of transformed cells in culture”, Biochem Pharmacol., 60(7), pp 937-946 24 Moưe, D J., Morre, D M., Temes, p., (2003), “Auxin-activated NADH oxidase activity of soybean plasma membranes is distinct from the constitutive plasma membrane NADH oxidase and exhibits prion-like properties”, In Vitro Cell Dev Biol Plant., 39(4), pp 368-376 25 Moire, D J., Penel, c., Greppin, H., Morre, D M., (2002), “The plasma membrane-associated NADH oxidase of spinach leaves responds to blue light”, Int J Plant Sci„ 163(4), pp 543-547 26 Mottola, H A., Simpson, B E., Gorin, G., (1970), “Absorptiometric Determination of Hydrogen Peroxide in Submicrogram Amount with leuco crystal Violet and Peroxidase as Catalyst”, Analytical Chemistry., 42, pp 410 -411 27 Ozturk, R., Bozkaya, L A., Atav, E., Tarhan, L., (1999), “Purification and characterization of superoxide dismutase from Phanerochaete chrysoporium”, Enzyme and Microbial Technology., 25, pp 392-399 28 Poole, LB and Claiborne, A 1986 Interactions of pyrimidine nucleotide with redox forms of the flavin - containing NADH peroxidase form from Streptococus faecalis J Biol Chem 216: 14525 - 14533 29 Susanne, H., Erich, F Elstner., (1999), "Transition metal ion-catalyzed oxygen activation during pathogenic processes", FEBS Letters., 443, pp 1-7 30 Thibodeau, E A., Keefe, T E., (1990), “pH-dependent fluoride inhibition of peroxidase activity”, Oral Microbiol Immunol., 5, pp 328-331 31 Tomomi, Ookawara et al., (1997), “Purification and Subunit Structure of Extracellular Superoxide Dismutase from Mouse Lung Tissue”, Arch Biochem Biophys., 340(2), pp 299-304 (USA) 32 Wood, D.V., Slack, R c B., Deutherer, J F., Humphreys, H., (1999), Medical Microbiology, 15th edition, ELST with Churchill Livingstone., pp 168-173 31 PHIẾU ĐÃNG KÝ KẾT QUẲ NGHIÊN c ứ u KH-CN Tên đề tài: Tìm hiểu enzym bảo vệ oxi hoá Nấm Linh chi Ganoderma lucidum Mã số: QT-03-16 Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Địa chỉ: 334 Nguyễn Trãi Thanh Xuân Hà Nội Tel: 8584287 Cơ quan quản lý đề tài: Khoa Sinh học Địa chỉ: 334 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội Tel: 8584734 Tổng kinh phí thực chi: Trong đó: - Từ ngân sách nhà nước: khơng - Kinh phí trường: 15.000.000 VNĐ - Vay tín dụng: khơng - Vốn tự có: khơng - Thu hồi: không Thời gian nghiên cứu: Năm Thời gian bắt đầu: 7/2003 Thời gian kết thúc: 12/2004 Tên cán phối hợp nghiên cứu: Ths Đặng Quang Hưng CN Phạm Kiên Cường Số đăng ký đề tài: Số chứng nhận đăng ký Bảo mật: Ngày: kết nghiên cứu: a Phổ biến rộng rãi; b Phổ biến hạn chế: c Bảo mật: Tóm tắt kết nghiên cứu: - Qua nghiên cứu, điều tra hoạt độ ba enzym bảo vệ oxi hoá CAT, SOD NOX nấm Gal dạng thể dạng sinh khối Có khác hoạt độ enzym giũa hai loại mẫu - Bước đầu thu chế phẩm NOX dạng tinh phần phương pháp sắc ký qua cột trao đổi ion DE-52 cột lọc gel Sephadex G-100 - Các kết xác định tính chất chứng tỏ NOX nấm Gal thuộc nhóm sinh H20 , bền nhiệt, hoạt hoá Fe3+ ức chế Cu2+ - Đã đãng báo:”Tìm hiểu enzym bảo vệ oxi hoá nấm Linh Chi Ganoderma lucidurrí' tạp chí Di truyền học & ứng dụng 1-2005 Kiến nghị quy mô đối ỉượng áp dụng nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu loại nấm có tính dược liệu cao, gần nâng lên hàng biệt dược Yêu cầu điều tra sâu dạng thể, phần tinh enzym cần làm thêm loại cột khác để thu chế phẩm có độ tinh Cần có thêm kết so sánh giũa loại nấm Linh Chi nuôi trồng với loại cổ Linh Chi Chủ nhiệm đề Thủ trưỏng tài quan chủ trì đề tài Chủ tịch Hội Thủ trưởng đồng đánh gĩá"^- quan quản lý thức TL.G 4tềtàir'n ILLLEUML B M Y.Hi.k nr>L _r,ú ii.; i Gr, Họ tên Học hàm học vị Ký tên Đóng đấu MỤC LỤC Trans Nguyễn Hoài GianiZ [ Hoạt tinh sinh học cùa equus caballus angiogenin Nguyễn Hoài Giang N guyễn Xuân Hùng, Trịnh Tam Kiệt, Lẻ Đinh Lương Nghiên cứu khả phân loại chi ganoderma bảng kỹ thuật phân tử rapđ-pcr vá mci đặc hiệu laccase N guyễn M inh Cơng, H ồng Trọng Phán, Chu Thị Minh Phương 10 Nghiên cứu so sánh sô chi tiêu vê sinh trưcmg phầm chất gạo cúa giống lúa tám ĩhơm đột biên dòng lúa đột biển triền vọng từ giống lúa thuộc loại hình Japonica với lai F1 chúng 15 N ỵuyen N ghĩa Thin Phát họ thực vật đơn lồi sót lại bổ sung cho hệ thực vật Việt Nam Há Thị Phúc, Đặng Quang Hưng, Phạm Báo Yen Nguyen QuangHuy, Nguyen Vũ Minh Hạnh, Phan Tuấn N ghĩa 17 N ghiên cứu đa hình di truyền số loài thực vật thu ihập lự Mà Đá vã Cát Tiên (tinh Đồng N ai) Phan K.Ố Lộc L v A veryanov, Nguyễn Tiến Hiệp, Nguyền SinhKhang 22 Tinh đa dạny hệ thực vật Việt nam 19 lysimachia viltiformis f F.H Chon & C.M Hu trâ n c h â u d i ( h ọ a n h t h o p r i n i u l j c e a c ) , lo ài b ỏ SUI1J5 c h o lie :liụ c v ật Tạ Bicli T huận, Phạm Kicn c ườn lí Đặng Ọ iu im H ưng 25 T i m h i ò u c c e n z y m b o v ệ õ x i húá cũa nâm lin h c hi ga n o d er m a ỉucid iim N guyễn N hư Tốn, Hồng Quang Minh 30 Tác dộng tia y (nguồn C o60) lên cdu trúc nhiễm săc thê trinh nguyên phân ré lúa Hoàng Q uang Minh N guyen Như Toán 34 H i ệ u ứ n íỉ c h i ế u x l i a ( n g u n C o 00) lên hạt lú a v n h ữ n g b i ể n d ố i di t r u y è n t r o n ” the hệ \ l | vá VI; 10 Trương N g ọ c Kiểm Bước đầu đánh giá tinh đa dạng hệ ihực vật khu vực Đại A - Đại Cáo - c ỏ ỈChu thuộc vườn quốc gia Phong N - KẺ Bàng 38