Nghiên cứu một số đặc điểm hóa học và tác dụng sinh học của các hợp chất polyphenol trong lá cây chè (camellia sinensis) trồng ở tân cương (thái nguyên) và xuân mai (hà tây)

MỤC LUC CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC HỢP CHẤT PHENOLIC THỰC VẬT 1.2 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC HỢP CHẤT ELAVONOTT THỰC VẬT CHƢƠNG 2: Đối TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 37 2.1 ĐỐI TƢỢNG THỰC VẬT 37 22 CHIẾT XUẤT VÀ ĐỊNH LƢỢNG FLAVONOIT TOÀN PHẦN TỪ NGUYÊN LIỆU 37 THỰC VẬT 2.2.1 Quy trình chiết flavonoit (B.C Talli) 37 2.2.2 Định lƣợng flavonoit toàn phần chè 38 23 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN FLAVONOU 39 2.3 Ì Định tính flavonoit phản ứng hoa học đặc trƣng 39 2.3.2 Phân tích sắc ký lớp mỏng quang phố tử ngoại 40 2.3.3 Phân tách sắc ký lỏng trung áp MPLC 41 2.3.4 Phân tích sắc ký lỏng cao áp HPLC 41 2.3.5 Phân lập chất tinh khiết phƣơng pháp SKLM điều chế 41 2.3.6 Nghiên cứu cấu trúc chất tinh khiết thu đƣợc 42 2.4 NGHIÊN CÚƢ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CHẾ PHẨM FLAVONOIT 42 2.4.1 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa chế phẩm thơng qua ảnh hƣởng lên hoạt độ peroxydaza máu ngƣời theo phƣơng pháp E c Xavron 2.4.2 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa thơng qua ảnh hƣởng lên q trình peroxy hoa lipid màng tế bào gan chuột 43 2.4.3 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ tế bào gan chế phẩm chuột bị nhiễm độc CC14 44 2.4.4 Nghiên cứu hoạt tính kháng vi sinh vật 45 2.4.5 Xác định hoạt động cathepsin (proteaza) huyết tƣơng máu ngƣời 2.4.6 Nghiên cứu tác dụng chống viêm động vật thực nghiệm 48 2.4.7 Nghiên cứu tác dụng kìm hãm phát triển ung thƣ in vitro 49 2.4.8 Nghiên cứu hoạt tính chống ung thƣ chống di ung thƣ động vật thực nghiệm 2.4.9 Xác định độc tính cấp 52 2.4.10 Phƣơng pháp xử lý số liệu 52 CHƢƠNG 3: KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53 3.1 MẪU THỰC VẬT 53 3.2 ĐIỂU CHẾ FLAVONOIT TONG số 54 3.2 Ì Quy trình chiết 54 3.2.2 Định tính flavonoit phản ứng hoa học đặc trƣng 55 3.3 KHẢO SÁT Sơ Bộ THÀNH PHẦN HOA HỌC VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG 57 OXY HOA CÁC MẨU FT THU ĐƯỢC 3.3.1 Khảo sát thành phần flavonoit FT phƣơng pháp SKLM kết hợp với quang phổ tử ngoại 57 3.3.2 Khảo sát hoạt tính chống oxy hoa (antioxydant) chế phẩm FT thông qua ảnh hƣởng lên hoạt động peroxydaza máu ngƣời phản ứng oxy hoa indigocarmin 59 PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN FLAVONOIT CHÊ PHẨM FTC 62 3.4.1 Phân tích thành phần flavonoit FTC4 FTC7 sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 3.4.2 Phân lập số chất tinh khiết 65 3.4.3 Xác định cấu trúc chất tinh khiết thu đƣợc 66 3.4.3.1 Xác định cấu trúc FTC4.1 3.4.3.2 68 Xác định cấu trúc FTC7.J 3.5 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CHẾ PHẨM FLAVONOIT 71 3.5.1 Khảo sát tác dụng chống oxy hóa thơng qua ảnh hƣởng lên trình peroxy hoa lipit tế bào gan chuột 71 3.5.2 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ tế bào gan chế phẩm chuột bị nhiễm độc CC14 73 3.5.3 Nghiên cứu tác dụng chống viêm nhiễm 78 79 3.5.3.1 Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn 3.5.3.2 Khảo sát ảnh hưởng lên hoạt độ cathepsin (proteaia) huyết tương máu người 3.5.3.3 Nghiên cứu tác dụng chống viêm thực nghiệm 3.5.4 84 Nghiên cứu tác dụng kìm hãm phát triển ung thƣ86 35.4.1 Nghiên cứu tác dụng kìm hãm sựphát triển ung thư in viĩỉ'0 87 3.5.4.2 Nghiên cứu tác dụng chống ung thư chông di cân 9Í ung thư thực nghiệm (in vivo) 3.5.5 Xác định độc tính cấp chế phẩm FTC hổn hợp FTC 4/7- 5/5 KẾT LUẬN 105 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 107 TÀI LIỆU THAM KHẢO 108 PHỤ LỤC 127 DANH M Ụ C KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT ALT Alanin amino transferase AST Aspartate amino transferase DAM Dialdehyt malo nic DOHĐ Dạng oxy hoạt động EC Epicatechin ECG Epicatechin galiat EGC Epigallocatechin EGCG Epigallocatechin gallat FT Flavonoit tổng số GD Growth delay HEp-2 Human Epidermo id Larynx Carcino ma HPLC Sắc ký lỏng cao áp HTCO Hoạt tính chống o xy ho a HTCƯ Hoạt tính gây độc tế bào ung thư IR Phổ hồng ngoại MIC Minimum inhibiting concentration MPLC MS NMR Pđ Sắc ký lỏng trung áp Phổ khối lượng Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Phân đoạn POL Peroxy hóa lipit s- 180 Sarcoma 180 SKĐ Sắc ký đồ SKLM Sắc ký lớp mỏng Sp -2/0 Nonsecreting mo use myeloma cell TCA TEAF ƯV-VIS Axit triclo acetic Toluen/etylacetat/aceton/axit fo rmic Phổ tử ngo ại DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, Đ T H Ị Hình trang 1.1 Sơ đồ sinh tổng hợp hợp chất pheno lic 1.2 Các hợp chất flavo no it quan hệ phát sinh 2.1 Lá Chè - Camellia sinensis Lindl o Kuntze 37 2.2 Quy trình chiết xuất flavonoit tồn phần (theo B.C.Talli) 38 2.3 Đường chuẩn tyrosin 48 3.1 Sắc ký đồ chế phẩm flavonoit từ chè vụ xuân 58 3-2 Ảnh hưởng chế phẩm flavonoit chè Tân Cương lên hoạt độ peroxydaza bốn nhóm máu người 3.3 60 Ảnh hưởng chế phẩm flavonoit chè Xuân Mai lên hoạt độ peroxydaza bốn nhóm máu người 61 3.4 Sơ đồ phân tách FTC sắc ký lỏng trung áp M P L C 62 3.5 Sắc ký đồ HPLC ch ế phẩm flavonoit FTC4 63 3.6 Sắc ký đồ HPLC ch ế phẩm flavonoit FTC7 64 3.7 Cấu trúc (-) - epicatechin 78 3.8 Cấu trúc quercitrin 70 3.9 Án h hưởng chế phẩm flavonoit FTC, FTC4 F TC7 lên peroxy h oa lipit tế bào gan chuột 3.10 73 Sự thay đổi hàm lượng AST A L T h uyết chuột ngộ độc CC1 s au 24h điều trị chế phẩm thử nghiệm 3.11 75 Sự thay đổi hàm lượng M D A h uyết chuột ngộ độc CC1 s au 24h điều trị chế phẩm thử nghiệm 3.12 3.13 76 Sự thay đổi hàm lượng AST A L T h uyết th anh chuột ngộ độc CC1 s au 72h điều trị chế phẩm th nghiêm 77 Sự thay đổi hàm lượng M D A h uyết chuột ngộ độc CCI4 sau 72h 77 điều trị chế phẩm thử nghiệm 3.14 Hoạt độ cathepsin lứa tuổi ì l i 315 Ảnh hưởng chế phẩm flavonoit FTC, FTC4 FTC7 nồng độ khác lên hoạt động cathepsin h uyết tương máu người 16 82 83 o S sánh ảnh hưởng ch ế phẩm FTC, FTC4 FTC7 (ở nồng độ 0,15mg%) lên hoạt động cathepsin h uyết tương người ^ 3.17 So sánh khả ức chế viêm chế phẩm FTC FTC 4/7 - 5/5 3.18 n Ả h hưởng chế phẩm FTC, FTC4, FTC7 lên sinh trưởng tế bào ungthưHEp-2 319 91 n Ả h hưởng chế phẩm FTC, FTC4, FTC7 lên sinh trưởng tế bào ung thư Sp-2/0 3.20 85 92 n Ả h hưởng chế phẩm FTC, FTC4, FTC7 lên sinh trưởng tế bào ung thư S-180 93 3.21 So sánh ản h hưởng FTC FTC4/7 - 5/5 lên thể tích u đùi chuột 97 3.22 So sánh ản h hưởng FTC FTC4/7 - 5/5 lên trọng lượng u đùi chuột 97 3.23 Hì n h 3.23 ản h chuột bị gây u đùi dòng tế bào s-180 điều 98 trị chế phẩm FTC FTC4/7 - 5/5 3.24 Đùi chuột mang u gây dòng tế bào S-180 3.25 So sánh ảnh hưởng FTC FTC4/7 - 5/5 lên di cân ung thư từ đùi đến gan phổi (tín h theo số nốt di căn) 3.26 99 loe So sánh ản h hưởng FTC FTC4/7 - 5/5 lên di ung thư từ đùi đến gan phổi (tính theo số chuột có di căn) l loi PL Ì Phổ C N M R FTC4.1 128 PL2 Phổ c N M R , DEPT 90, DEPT 135 FTC4.1 128 PL3 Phổ ' H N M R FTC4.1 129 PL4 Phổ H M B C FTC4.1 129 PL5 Phổ H M Q C FTC4 Ì 13C PL6 Phổ COSY FTC4 Ì 13C PL7 PhỔIRcủaFTC7.1 131 PL8 Phổ c N M R FTC7.1 131 PL9 Phổ ũ N M R , DEPT90, DEPT 135 củaFTC7.1 132 PL10 Phổ 1HNMR củaFTC7.1 132 PL11 Các tế bào vân xương bình thường đùi chuột 133 PL12 T ế bào ung thư phát triển mô liên kết đệm, làm 133 13 13 i3 thối hóa, hoại tử tế bào đùi chuột PL 13 P L Ảnh di cân tế bào ung thư S-180 vào gan 134 n Ả h di tế bào ung thư S-180 vào phổi ^ DANH M Ụ C CÁC BẢNG số LIỆU Bảng trang 1.1 Vị trí nhóm số flavonoit Ì Số liệu xây dựng đổ thị chuẩn tyrosin 48 3.1 h Dan mục k ý hiệu mẫu thực vật dùng cho ngh iên cứu 53 3.2 Hàm lượng flavonoit toàn phần chè 54 3.3 Kết thử phản ứng định tính flavonoit chế phẩm chè 56 3.4 Đặc điểm sắc ký lớp mỏng phổ tử ngoại chế phẩm TCT2 57 3.5 Kết thử định tính nhóm phân đoạn phản ứngđặc trưng flavonoit 62 3.6 Một số flavonoit có mặt FTC4 64 3.7 Một số flavonoit có mặt FTC7 65 3.8 Một số đặc điểm FTC4 Ì 66 3.9 Dữ liệu ph ổ 'H - N M R c - NMR FTC4.1 67 3.10 Một số đạc điểm FTC7 Ì 68 3.11 Dữ liệu phổ ' H - N M R C - N M R FTC7.1 69 3.12 Ánh hưởng chế phẩmflavonoitFTC lên peroxy hoa lipit tế bào gan chuột 71 3-13 Ảnh hưởng chế phẩm flavonoit FTC4 lên peroxy hoa lipit tế bào gan chuột 72 3-14 Ảnh hưởng chế phẩm flavonoit FTC7 lên peroxy hoa lipit tế bào gan chuột 72 3.15 Kết định tính kháng vi sinh vật chế phẩm 79 3.16 Địn h lượng kháng khuẩn FTC 81 3.17 Theo dõi thay đổi thể tích chân chuột gây viêm khơng điều trị 84 3-18 Ảnh hưởng chế phẩm FTC lên sinh trưởng tế bào ung thư Hep- 13 l 2; Sp-2/0 s 3-19 88 180 Ản h hưởng chế phẩm FTC4 lên sinh trưởng tế bào ung thư Hep-2; Sp-2/0 s i 3.20 Ản h hưởng chế phẩm FTC7 lên sinh trưởng tế bào ung thư Hep-2; Sp-2/0 S 3*21 9 I80 Ánh hưởng FTC, FTC4 FTC7 lên sinh trưởng tế bào lympho máu ngo ại vi người 95 PL Ì Ảnh hưởng chế phẩm flavonoit chè Tân Cương lên hoạt độ Ì35 peroxydaza bốn nhóm máu người PL2 Ảnh hưởng chế phẩm flavon oit chè Xuân Mai lên hoạt độ 135 peroxydaza bốn nhóm máu người PL3 Tác dụng bảo vệ tế bào gan chế phẩm thử nghiệm sau 24 điều trị 136 PL4 Tác dụng bảo vệ tế bào gan chế phẩm thử nghiệm sau 72 điều trị 136 PL5 n Ả h hưởng chế phẩm FTC, FTC4 FTC7 lên hoạt độ cathepsin huyết tương máu người Ì37 PL6 Khả ức chế viêm chế phẩm flavon oit FTC 137 PL7 Khả ức chế viêm chế phẩm FTC 4/7 - 5/5 138 PL8 n Ả h hưởng chế phẩm FTC lên thể tích u đùi chuột Ì38 PL9 Ảnh hưởng chế phẩm FTC lên trọng lượng u đùi chuột Ì38 PL 10 Ảnh hưởng chế phẩm FTC 4/7 - 5/5 lên thể tích u đùi chuột Ì39 PL 11 Ảnh hưởng chế phẩm FTC 4/7 - 5/5 lên trọng lượng u đùi chuột 139 PL 12 Anh hưởng chế phẩm FTC lên di ung thư từ đùi đến gan phổi Ì40 PL 13 Ảnh hưởng chế phẩm FTC 4/7 - 5/5 lên di ung thư từ đùi đèn gan phổi 140 MỞ ĐẦU N g y nay, tác dụng chữa bệnh hợp chất thiên nhiên mối quan tâm đặc biệt cá c nhà hoa sinh y dược học Những thành tựu lĩnh vực góp phần to lớn việc bảo vệ sức khoe người Việc tìm loại thuốc có hiệu lực cao để thay cho hệ thuốc cũ tỏ hiệu lực việc tìm kiếm loại biệt dược chữa trị cá c bệnh nan y ung thư, AIDS, viêm gan B đòi hỏi ngày trở nên cấp bá ch Từ đó, việc nghiê n cứu khai thác hợp chất thiê n nhiê n ngày trở thành điểm nóng thu hút quan tâm nhiều quốc gia trê n giói Cây chè (Camellia sinensis L o Kuntze) từ lâu đồ uống quen thuộc người sử dụng rộng rãi nhiều quốc gia trê n toàn giới Là loại đổ uống giàu chất chống oxy hoa, chè có tá c dụng chống lão hoa, giúp phòng chống nhiều bệnh tật bao gồm bệnh tim mạch, hen suyễn, gan, bệnh miệng đặc biệt có tá c dụng phòng trá nh, giảm nguy mắc cá c bệnh ung thư Mang tá c dụng chữa bệnh giá trị, từ lâu chè đố i tượng nghiê n cứu nhà khoa học thuộc lĩnh vực hoa sinh - y dược trê n toàn giới chè hợp chất polyphenol quan tâm đặc biệt, nhóm chất thực vật thứ sinh lớn, có vai trị đáng kể cá c trình chuyển hoa bản, điều hoa sinh trưởng, phát triển bảo vệ thực vật Trong số polyphenol thiê n nhiê n, lớp chất flavonoit có ý nghĩa thực tiễn lớn chúng phân bố rộng rãi thực vật, độc với thể sống có nhiều hoạt tính sinh học giá trị Nghiên cứu hoa học tác dụng sinh dược học cá c polyphenol flavonoit khai thá c từ chè Việt Nam với mục đích phục vụ y học hướng nghiên cứu mẻ Vì nước ta việc khai thá c ứng dụng chè xanh để chữa trị bệnh dừng lại kinh nghiệm dân gian diện hẹp, nghiê n cứu chè chủ yếu tập trung lĩnh vực dùng làm thực phẩm, chưa có hướng khai thá c cá ch có hiệu nguồn nguyên liệu phong phú cá c hợp chất thiên nhiên vào mục đích phịng chữa bệnh cho người Tác dụng chữa bệnh dược liệu bắt nguồn từ hoạt tính sinh dược học cá c hợp chất hoa học có chè Do đó, để thừa kế kinh nghiệm dân gian khai thá c nguồn thuốc từ thiên nhiên, cần thiết phải Ì có hiểu biết thành phần hoa học tác dụng sinh học chúng Với mong muốn đóng góp thêm hiểu biết nâng cao giá trị chè Việt Nam, thực đề tài: "NGHIÊN CỨU M Ộ T s ố Đ Ặ C Đ I Ể M HOA H Ọ C VÀ TÁC DỤNG SINH H Ọ C C Ủ A CÁC HỢP C H Ấ T P O L Y P H E N O L T R O N G LÁ CÂY CHÈ (CAMELLIA SINENSIS) T R Ổ N G Ở TÂN CƯƠNG (THÁI NGƯYÊN)VÀ XUÂN MAI (HÀ TẦY)" Theo hướng nghiên cứu này, luận vãn có nhiệm vụ sau: Chiết xuấ t, định tính định lượng flavonoit phận chè (lá non, bánh tẻ, già) thu hái hai vùng chè khác [(Tân Cương (Thái Nguyên) Xuân Mai (Hà Tây)] vào thời điểm khác năm (bốn mùa: x uân, hè, thu, đơng) Thơng qua hoạt tí nh chống oxy hoa để so sánh sàng lọc lựa chọn mẫu flavonoit ưu nhất, sử dụng cho nghiên cứu sâu thành phần hoa học hoạt tính sinh học Nghiên cứu thành phần flavonoit chè Đánh giá hoạt tính sinh học chế phẩm flavonoit thông qua nghiên cứu hoa sinh học sau: • Tác dụng chống ox y hoa thơng qua khả kìm hãm trình peoxy hoa lipit màng tế bào gan chuột ảnh hưởng chế phẩm flavonoit lên hoạt độ enzym peroxydaza máu người phản ứng oxy hoa indigocarm in Tác dụng chống oxy hóa bảo vệ tế bào gan thơng qua việc đánh giá tác dụng điều trị chế phẩm flavonoit lên chuột gây độc CC1 • Tác dụng chống viêm nhiễm thông qua nghiến cứu khả kháng vi sinh vật gây bệnh, nghiên cứu ảnh hưởng chế phẩm flavonoit lên hoạt độ cathepsin huyết tương người, hoạt tí nh chống viêm động vật thúc nghiệm • Tác dụng gây độc tế bào dịng tế bào ung thư ni cấy HEp-2, Sp-2/0 s -180 in • vitro Xác định hoạt tính kìm hãm phát triển khối u chống di ung thư động vật thực nghiệm • (in vivo) Xác định độc tính cấp chế phẩm thử nghiệm 205 Zha o, B.L., L i , X.J., He, R.G., Cheng, S.J and Xin, W.J (1989), Sca venging effect of extra cts of green tea a nd na tura l a ntioxyda nts on a ctive oxygen radicals Cell Biophy 14, pp 175-185 206 Zhu, Q.Y., Hua ng, Y., Tsa ng, D and Chen, Z.Y (1999), "Regenera tion of atocopherol in human lowdensity lipoprotein by green tea ca techin." / Agric Food Chem, 47(5), pp.2020-2025 Tiếng Nga 207 Jl.n AjieKceHKO npoTeojiHTHHecKHX (1996), ộepMGHTOB " M e A H ự H H a " , M o c K B a , c 115 208 rop õaneB n.B (1996), BBe^eHHH MeTo^bi aKTHBHOCTM B "CoBpeMeHHbie MeTo^bi B GHOXHMHH" 190 TopMO^KeHHe ộ e H Ob il HLIX onpeAejieHHH p ocTa onyxojiH H ÕHOCHHTe3a PHK npH coe/ỊHHeHHH >KH BOTH BÌM OnyXOJieHOCTeJIHM "ộeHOJibHfeie coe/ỊHHeHHA H HX 6HOJiorHHecKHe ộ y H K U H H " , "Hayica" B MocKBa, c - 0 209 Ty>KHJiHH C A (1973), PeryjiHpoBaHHe cbipoBOTKH, "JIa6opaTopHoe 210 3anpoMeHTOB Bbiciuaa 211 3-pMaKOB M H (1974), iHKOJia, M o c K B a , A H., ộepMeHTaTHBHOH aKTHBHOCTH aejio", M e / Ị H ự H H a , MocKBa, c 195 - 200 OcHOBHb ie ÕHOXHMHH ộeHOJibHbix coe#HHeHHH, c 17 ApaniMOBHJi B B (1972), MeTOflb i ÕHoxHMHHecKoro HCCJie^OBOHM pacTeHHH, H3A " H a y K a " - jieHHHrpaA, CTp 117 374 126 - 123, 336 - PHỤ LỤC 127 - T Ĩ -ó \ 3 ! ị rí : EXFIIO ?BĨCMO -! zo0i:: IHSTPUM PHOBKD ?UL?P.QG tí l o :s • vioo SWH r i ones loe : •5J0OOC0C MÚC! ve r o ; ?L: PL12 PLI1 sro; sa - J ;c 1« 3T 3ĨÕỊSỈ ỉ: no :: Hình PL1 13 Phổ c NMR FTC4.1 DE ? T CĨ3CPD Ì ! Í Hỉn/I PL2 P » Ố C NMR, DEPT 90, DEPT135 28 FTC4.1 ĨỊỊCCMit ĩ í PHO í HĨC MO hST-i.ru >KOSHD rULPMG lí JI ÍVÌOO Ì -n lui; / / lao.: 123« JU_LJuUt ÍỄầ lã H/A7/7 PL3 P / Ố HNMR FTC4.1 _ li r : I • & ỉ Ị f ị j_ f- — ỉ - í í li I Ì j J ỉ ỉ Ì i - ị ụUJ T Ị r T £ J Ị ~ị if ì ~ ỉ — ị Ị -ị ị - ì — Ị Ị —Ị li í_ J ị Ị Ị Ị ì _j ị ' ị Ị í •1 Ị- í ĩ H li jị ; "' : 1- J ỉ i_i ị _ ị ị r li í i ~T li ' _ _4 Ị Ị I_ ị ị ì ••' í" o i L ị ; ỉ " : H/n/) PL4 Phô HMBC 129 ] FTC4.1 I ị ã li i - f J nr Hình PL5 PhổHMQC FTC4.1 MeOD, li li COSYGP i li k BI ọ- ĩ t ỉ ỉn t • _ —! ,K — Hình PL6 Phổ COSY FTC4.1 130 Hình PL7 PhổlR \\v I V/ FTC7.1 ' í I -I - ì • Sít* Tim Ì HÍT HUI! ?H)DHD PULÍBOG TO x ^ V - 'K - ' ^riMLtd bOOOCũù 5!OCOC30 ỉiõũỉooo ne IM xe HUCI PC roi »HCLtf Min í H/AJI7 P L ổ P Í ố C NMR 131 FTC7.1 SO 40 :o iO ;o ỈŨ 20 DEPT135 CH a CH-ĩ 30 2: 30 iO 00 C13CPD 20 10 13 Hình PL9 Phổ c NMR, DEPT 90, DEPT 135 FTC7.1 :riSTHUH ; inuel retrace ì I oeĩíis N i ! ni J:S