Tổng hợp và đánh giá tác dụng sinh học các dẫn xuất của indirubin TT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ …… ….***………… NGUYỄN TRỌNG DÂN TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC CÁC DẪN XUẤT CỦA INDIRUBIN Chuyên ngành: Hoá học hợp chất thiên nhiên Mã số: 44 01 17 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HỐ HỌC Hà Nội - 2021 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: TS Lưu Văn Chính Người hướng dẫn khoa học 2: TS Tơ Đạo Cường Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi , ngày tháng năm 2021 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Các hợp chất thiên nhiên tạo thành từ trình sinh tổng hợp thực động vật, vi sinh vật thường có hoạt tính sinh học đặc biệt, chọn lọc, dễ dung nạp vào thể tác dụng phụ Vì thế, nhiều chất số chúng sử dụng rộng rãi thực tế để làm thuốc điều trị bệnh như: ung thư, nhiễm khuẩn… mà tác dụng điều trị bệnh định cấu trúc hóa học chúng Cấu trúc hóa học hợp chất thiên nhiên thường phức tạp mà đường tổng hợp tồn phần khơng kinh tế phải qua nhiều bước phản ứng, hiệu suất thấp, chi phí xử lý mơi trường cao, thời gian phản ứng dài Do đó, tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có từ thiên nhiên để tổng hợp, phân lập chất dẫn đường, sau chuyển hóa chúng thành dẫn xuất có hoạt tính sinh học tốt chất dẫn đường thu hút ý nhiều nhà khoa học Gần đây, nhà khoa học khám phá nhiều hoạt tính sinh học hợp chất indirubin dẫn xuất, bisindole alkaloid thu nhận với lượng lớn từ nguyên liệu chàm mèo Strobilanthes cusia có nhiều Việt Nam phản ứng isatin indoxyl acetate Hoạt chất dẫn xuất thể nhiều hoạt tính sinh học q gây độc với nhiều dịng tế bào ung thư, có tác dụng chống kết tập tiểu cầu, tác dụng kháng viêm, kháng virus, chống oxy hóa, kháng nấm, chống vảy nến với chế rõ ràng, đến thời điểm công bố hoạt tính tiếp tục Tuy nhiên, để ứng dụng hợp chất vào thực tế cịn khó khăn độ tan nước, số cơng trình nghiên cứu sử dụng hướng thứ để cải thiện độ tan indirubin, theo hướng thứ hai số dẫn xuất tổng hợp nhiên công bố chưa nhiều Theo hướng này, đề tài luận án đề cập tới tổng hợp số dẫn xuất indirubin tổ hợp lai indirubin với hợp chất dị vòng chứa S, N, O; hợp chất hydroxychalcone hợp chất amine, sau đánh giá hoạt tính chống ung thư in vitro, giải thích hoạt tính để bổ sung liệu hóa học hoạt tính sinh học dẫn xuất làm sở cho nghiên cứu sâu việc tìm kiếm thuốc để chăm sóc bảo vệ sức khỏe cộng đồng từ nguồn ngun liệu thực vật sẵn có nước Vì thế, lựa chọn đề tài: “Tổng hợp đánh giá tác dụng sinh học dẫn xuất indirubin” Mục tiêu nghiên cứu luận án - Tổng hợp 40 dẫn xuất indirubin xuất phát từ nguyên liệu đầu indirubin thu nhận từ chàm mèo Strobilanthes cusia - Đánh giá hoạt tính chống ung thư in vitro dẫn xuất tạo Các nội dung nghiên cứu luận án Từ mục tiêu thực nội dung nghiên cứu luận án sau: + Tổng hợp dẫn xuất indirubin tổ hợp lai indirubin với hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6mercaptopurin, hợp chất hydroxychalcone hợp chất amine; + Xác định cấu trúc dẫn xuất tổng hợp phương pháp phổ đại; + Đánh giá hoạt tính chống ung thư in vitro ( ung thư đại tràng SW480, ung thư phổi LU-1, ung thư gan HepG2, ung thư máu HL-60 ) dẫn xuất tổng hợp được; + Nghiên cứu mối tương quan cấu trúc hoạt tính chống ung thư số dẫn xuất tổng hợp sử dụng phần mềm AutoDock 4.2 CHƯƠNG I TỔNG QUAN Phần tổng quan tài liệu tập hợp nghiên cứu nước quốc tế vấn đề: 1.1 Giới thiệu indirubin đồng phân 1.2 Thu nhận, tổng hợp indirubin 1.3 Tổng hợp dẫn xuất indirubin 1.4 Hoạt tính sinh học indirubin dẫn xuất 1.5 Khái quát hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin 1.6 Giới thiệu chalcone 1.7 Giới thiệu mô tương tác phân tử (molecular docking) 1.8 Enzyme glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β) CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phần nói nguồn gốc hợp chất indirubin dùng cho nghiên cứu, phản ứng sử dụng luận án, kỹ thuật đại sử dụng để phân tích cấu trúc, hóa chất, trang thiết bị, dòng tế bào sử dụng cho nghiên cứu, phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học, việc chuẩn bị phối tử protein mục tiêu, mô tương tác sử dụng phần mềm AutoDock 4.2.6 2.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu luận án hợp chất indirubin thu nhận từ Chàm mèo Strobilanthes cusia Indirubin: Được cung cấp PGS TS Nguyễn Mạnh Cường, Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên, Viện HLKH-CN Việt Nam, có độ 95% 2.2 Phương pháp nghiên cứu Phương pháp sử dụng luận án bao gồm ba phần chính: Phương pháp tổng hợp dẫn xuất indirubin sử dụng kỹ thuật đại NMR-1D, NMR-2D, HR-MS(ESI) để xác định cấu trúc chất nhận được, phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học in vitro (gây độc chống tăng sinh tế bào) phương pháp mô tương tác chất đích enzyme GSK-3β sử dụng phần mềm AutoDock 4.2.6 2.3 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu Các hóa chất, mỏng sử dụng cho nghiên cứu mua từ hãng hóa chất Sigma-Aldrich, Scharlau, Prolabo Các thiết bị Bruker ADVANCE 500 MHz dùng để ghi phổ NMR; Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS dùng để ghi phổ HR-MS(ESI); Bruker D8 QUEST 273 K với xạ MoKα (λ = 0.71073 Å) sử dụng máy đơn sắc TRIUMPH dùng để ghi phổ nhiễu xạ tia X; Buchi 530 dùng để đo điểm chảy 2.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học Phương pháp xác định hoạt tính gây độc tế bào áp dụng dòng tế bào Hep-G2 (ATCC-HB-8065), LU-1 (ACTT-HTB-57), SW480 (ATCC-CCL-228), HEK-293 (ATCC-CRL-1573) Phương pháp xác định hoạt tính chống tăng sinh áp dụng dòng tế bào HL-60 (ATCC-CCL-240) 2.5 Chuẩn bị phối tử protein Cấu trúc hai chiều hợp chất nghiên cứu xây dựng phần mềm Chemdraw19.1 (ChemOffice 2019) sau chuyển sang dạng ba chiều phần mềm Chem3D 19.1 Các hợp chất tối ưu hóa cấu hình khơng gian sử dụng phần mềm Gabedit 2.5.0 Việc xác định mạch hợp chất thực tự động phần mềm AutoDockTools (MGLTools) Cấu trúc 3D protein GSK-3β lấy từ ngân hàng sở liệu protein (Protein Data Bank - PDB) chuẩn hóa sử dụng phần mềm AutoDockTools 2.6 Mô tương tác sử dụng phần mềm AutoDock 4.2.6 Sử dụng phần mềm AutoDock Tools (MGLTools) để chuẩn bị liệu đầu vào cho trình mơ tương tác Vị trí kích thước hộp lưới dùng cho mô xác định để đảm bảo không gian mô bao gồm amino axit tham gia tương tác tạo liên kết với phối tử mẫu indirubin-3′-oxime, CHIR-98014 BIOacetoxime Các thơng số quan tâm sau q trình mơ tính toán giá trị lượng liên kết (ái lực) chất với enzyme, số liên kết hydro chất với amino axít tâm hoạt động CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM Phần mô tả thực nghiệm tổng hợp dẫn xuất indirubin theo sơ đồ phản ứng thử nghiệm hoạt tính sinh học dẫn xuất tạo 3.1.Tổng hợp tổ hợp lai indirubin với hợp chất 1,3,4oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin qua liên kết trimethylen (chuyển hóa nhóm hydroxyl C-3ʹ-oxime) Sơ đồ phản ứng: Sơ đồ 3.1 Tổng hợp tổ hợp lai indirubin với hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin qua liên kết trimethylen (chuyển hóa nhóm hydroxyl C-3ʹ-oxime) Bảng 3.1 Cấu trúc thiol 41a-41i STT Hợp chất RSH STT Hợp chất 41a 41f 41b 41g 41c 41h 41d 41i 41e RSH 3.2.Tổng hợp tổ hợp lai indirubin với hợp chất 1,3,4oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin qua liên kết 2-ol1,3-propylen (chuyển hóa nhóm hydroxyl C-3ʹ-oxime) Sơ đồ phản ứng: Sơ đồ 3.2 Tổng hợp tổ hợp indirubin với hợp chất 1,3,4oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin qua liên kết 2-ol-1,3-propylen (chuyển hóa nhóm hydroxyl C-3ʹ-oxime) 3.3.Tổng hợp tổ hợp lai indirubin với hợp chất 1,3,4oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin qua liên kết 2-ol1,3-propylen (chuyển hóa N-1) Sơ đồ phản ứng: Sơ đồ 3.3 Tổng hợp tổ hợp lai indirubin với hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin qua liên kết propan-2-ol (chuyển hóa N-1) 3.4 Tổng hợp tổ hợp lai indirubin với hợp chất hydroxychalcone qua liên kết methylen 1,2,3-triazole (chuyển hóa nhóm hydroxyl C-3ʹ-oxime) Sơ đồ phản ứng: Sơ đồ 3.4 Tổng hợp tổ hợp lai indirubin với hợp chất hydroxychalcone qua liên kết methylen 1,2,3-triazole (chuyển hóa nhóm hydroxyl C-3ʹ-oxime) 3.5 Tổng hợp tổ hợp lai indirubin với hợp chất hydroxychalcone qua liên kết methylen 1,2,3-triazole (chuyển hóa vị trí C-3ʹ N-1) Sơ đồ phản ứng: Sơ đồ 3.5 Tổng hợp tổ hợp lai indirubin với hợp chất hydroxychalcone qua liên kết methylen 1,2,3-triazole (chuyển hóa vị trí C-3ʹ N-1) 3.6 Tổng hợp tổ hợp lai indirubin với hợp chất amine qua liên kết methylen 1,2,3-triazole (chuyển hóa vị trí C-3ʹ N-1) Sơ đồ phản ứng: Sơ đồ 3.6 Tổng hợp tổ hợp lai indirubin với hợp chất amine qua liên kết methylen 1,2,3-triazole (chuyển hóa vị trí C-3ʹ N-1) 3.7 Thử nghiệm hoạt tính sinh học dẫn xuất indirubin hydroxychalcone qua liên kết methylen 1,2,3-triazole (chuyển hóa nhóm hydroxyl C-3ʹ-oxime) Các hợp chất 53a-53i tổng hợp theo sơ đồ 3.4, phản ứng Click sử dụng để ghép 4-(2-azidoethoxy)-2hydroxychalcone 51a-51l với indirubin-3ʹ-[O-(prop-2-ynyl)oxime] 52 có mặt CuI Trước hết, 4-(2-azidoethoxy)-2-hydroxychalcone 51a-51l tổng hợp từ chất đầu 2,4-dihydroxyacetophenone 47 qui trình bước với hiệu suất tốt sau: Ketone 47 O-alkyl hóa chọn lọc nhóm -OH vị trí với 1,2-dichloroethane dung môi DMF nhiệt độ 55oC, xúc tác K2CO3, thời gian 10 Kết thúc phản ứng, sản phẩm thô tinh chế sắc ký cột/silica gel, hệ dung môi rửa giải n-hexan/acetone (3/1) nhận hợp chất trung gian 4-(2-chloroethoxy)-2-hydroxyacetophenone 48 với hiệu suất 61%, nhóm -OH vị trí khơng tham gia phản ứng O-alkyl hóa tạo thành liên kết hydro nội phân tử nguyên tử H nhóm với nguyên tử O nhóm C=O nhóm 1-acetyl Tiếp theo, dẫn xuất alkylchloride cho phản ứng với NaN3 dung môi DMSO nhiệt độ 60oC, 24 cho chất trung gian 4-(2azidoethoxy)-2-hydroxyacetophenone 49 với hiệu suất 81% Cuối cùng, hợp phần ketone ngưng tụ Claisen-Schmidt với aldehyde gồm benzaldehyde 50a, 3,4,5-trimethoxybenzaldehyde 50b, 2-methoxybenzaldehyde 50c, 3-methoxybenzaldehyde 50d, 4methoxybenzaldehyde 50e, 2-ethoxybenzaldehyde 50f, 3ethoxybenzaldehyde 50g, 4-ethoxybenzaldehyde 50h, 2propoxybenzaldehyde 50i, 3-propoxybenzaldehyde 50k 4propoxybenzaldehyde 50l MeOH xúc tác KOH để tạo thành 4-(2-azidoethoxy)-2-hydroxychalcone 51a-51l với hiệu suất 78÷87% Trong có chalcone gồm 51a, 51f, 51g, 51h, 51i, 51k, 51l chalcone cũ 51b, 51c, 51d, 51f mơ tả tài liệu trước Các 4-(2-azidoethoxy)-2-hydroxychalcone nhận 11 chất rắn, màu vàng đặc trưng chalcone Cấu trúc chất trung gian 48, 49 (2-azidoethoxy)-2-hydroxychalcone xác định phương pháp phổ NMR HR-MS(ESI) Tiếp theo, chất trung gian chìa khóa indirubin-3ʹ-[O-(prop-2ynyl)oxime] 52 điều chế từ indirubin qua hai bước Trước hết indirubin-3ʹ-oxime 25 tạo thành phản ứng ngưng tụ indirubin với hydroxylamine chlohydric dung môi pyridine, hồi lưu Tiếp theo, hợp chất O-alkyl hóa với propargyl bromide dung mơi DMF nhiệt độ phịng, xúc tác triethylamine, 48 Kết thúc phản ứng, sản phẩm thô tinh chế sắc ký cột/silica gel, hệ dung môi rửa giải n-hexan/acetone (3/1) nhận hợp chất trung gian chìa khóa indirubin-3ʹ-[O-(prop-2-ynyl)oxime 52 với hiệu suất 79% tính theo indirubin-3ʹ-oxime Cấu trúc hợp chất 52 xác định phương pháp phổ NMR HR-MS(ESI) Bước cuối tổng hợp tổ hợp lai indirubin với hợp chất hydroxychalcone qua liên kết methylen 1,2,3-triazole cho 4-(2-azidoethoxy)-2-hydroxychalcone phản ứng với hợp chất indirubin-3ʹ-[O-(prop-2-ynyl)oxime 52 dung môi DMF nhiệt độ phịng, xúc tác CuI, 24 Tiến trình phản ứng kiểm soát TLC, kết thúc phản ứng, hỗn hợp pha loãng với ethyl acetate, sau rửa nước, làm khơ Na2SO4 khan, sản phẩm thô tinh chế sắc ký cột/silicagel, hệ dung môi rửa giải n-hexan/acetone (3/2) nhận mười dẫn xuất indirubin 53a-53l với hiệu suất 54÷67% Cấu trúc chất xác định phương pháp phổ đại như: NMR -1D, 2D HRMS(ESI) 4.1.5 Tổng hợp tổ hợp lai indirubin với hợp chất hydroxychalcone qua liên kết methylen 1,2,3-triazole (chuyển hóa vị trí C-3ʹ N-1) Theo sơ đồ 3.5, tổ hợp lai 56a-56l indirubin-3ʹ-oxime với hợp chất hydroxychalcone qua liên kết methylen 1,2,3-triazole 12 nhận qua ba bước phản ứng Trước hết, thực phản ứng Nalkyl hóa indirubin với propargyl bromide dung môi DMF khan nhiệt độ phòng, sử dụng hệ xúc tác K2CO3, KI, 1(butyl)triethylammonium bromide, 48 Kết thúc phản ứng, sản phẩm thô tinh chế sắc ký cột/silica gel, hệ dung môi rửa giải n-hexan/acetone (4/1) nhận hợp chất 54 với hiệu suất 59% Cấu trúc hợp chất xác định phổ NMR, HRMS(ESI) Tương tự phản ứng N-alkyl hóa indirubin epichlorohydrin, phản ứng N-propargyl hóa indirubin xảy vị trí N-1 Tiếp theo, chất trung gian chìa khóa 55 tạo thành với hiệu suất 79% phản ứng ngưng tụ 54 với hydroxylamine hydrochloride dung môi pyridine Đơn tinh thể hợp chất 55 dễ dàng tạo thành hệ dung môi n-hexan/acetone (2/1) dùng để đo phổ nhiễu xạ tia X đơn tinh thể Cấu trúc 55 xác định phổ NMR, HR-MS(ESI) kết hợp với phổ nhiễu xạ tia X đơn tinh thể Dữ liệu tinh thể học hợp chất gửi đến trung tâm liệu tinh thể học Anh cấp mã số CCDC 1917485, khẳng định cấu trúc hợp chất 55 tổng hợp xác có cấu hình tuyệt đối (2ʹZindirubin, 3ʹEoxime) (Hình 4.27) Từ cấu trúc đơn tinh thể hợp chất 55 khẳng định chất đầu indirubin có cấu hình tuyệt đối 2ʹZ oxime 25 tạo thành có cấu hình 3ʹE Cuối cùng, thực phản ứng đóng vịng 1,2,3-triazole hợp chất 55 với 4-(2-azidoethoxy)-2-hydroxychalcone 51a-51l dung mơi DMSO nhiệt độ phịng, xúc tác CuI, 24 Sản phẩm thô tinh chế sắc ký cột/silica gel, hệ dung môi rửa giải n-hexan/acetone (3/2) nhận mười chất đích 56a-56l với hiệu suất 57÷70% Cấu trúc chất đích xác định phương pháp phổ đại như: NMR -1D, 2D HR-MS(ESI) 13 Hình 4.27 Cấu trúc đơn tinh thể hợp chất 55 4.1.6 Tổng hợp tổ hợp lai indirubin với hợp chất amine qua liên kết methylen 1,2,3-triazole (chuyển hóa vị trí C-3ʹ N-1) Indirubin dẫn xuất có độ tan nước dẫn đến sinh khả dụng thấp Để cải thiện tính tan dẫn xuất indirubin, hợp chất ghép với amine qua cầu liên kết methyl 1,2,3-triazole nhờ phản ứng click chemistry (sơ đồ 3.6) Hợp phần amine lựa chọn dẫn xuất halogen: 2chloroethyldimethylamine, 1-(2-chloroethyl)piperidine, 1-(2chloroethyl)imidazole N-(2-chloroethyl)morpholine Các dẫn xuất chloro amine chuyển thành azido amine tương ứng NaN3/K2CO3 DMSO 60 oC Sau ly tâm loại bỏ chất rắn, dung dịch azido amine thu cho phản ứng click chemistry với (2ʹZ, 3ʹE)-1-(prop-2-ynyl)indirubin-3ʹ-oxime 55 có mặt xúc tác CuI nhiệt độ phòng để nhận sản phẩm click 56m-56p Sản phẩm thô tinh chế sắc kí cột/silica gel rửa giải hệ n-hexane/aceton (1/1) thu sản phẩm đích 56m-56p với hiệu suất từ 56÷68% Cấu trúc sản phẩm đích xác định phương pháp phổ đại như: NMR1D, 2D HR-MS(ESI) 4.2 Đánh giá hoạt tính chống ung thư in vitro dẫn xuất indirubin 4.2.1 Đánh giá hoạt tính chống ung thư dẫn xuất indirubin 42a-42i 14 Bảng 4.13 Hoạt tính gây độc chống tăng sinh tế bào in vitro dẫn xuất indirubin 42a-42i chất đối chứng dương IC50 (μM) TT Hợp chất 10 11 12 13 42a 42b 42c 42d 42e 42f 42g 42h 42i 6-mercaptopurin Indirubin Indirubin-3ʹ-oxime Ellipticine SW480 LU-1 HepG2 HL-60 >20 >20 >20 >20 2,56 >20 >20 >20 4,82 19,10 >20 14,26 2,19 >20 >20 >20 >20 2,92 >20 >20 >20 5,19 18,75 >20 13,11 1,91 >20 >20 >20 >20 3,69 >20 >20 >20 4,70 19,72 >20 15,87 1,79 >20 >20 >20 >20 2,54 >20 >20 >20 5,94 16,04 >20 14,90 2,40 Kết thử nghiệm hoạt tính gây độc chống tăng sinh tế bào ung thư bảng cho thấy hai dẫn xuất 42e 42i có hoạt tính bốn dòng tế bào thử nghiệm, giá trị IC50 dao ng t 2,54ữ5,94 àM By dn xut cũn li khơng thể hoạt tính nồng độ nghiên cứu 4.2.2 Đánh giá hoạt tính chống ung thư dẫn xuất indirubin 43a-43i Bảng 4.14 Hoạt tính gây độc chống tăng sinh tế bào in vitro dẫn xuất indirubin 43a-43i chất đối chứng dương IC50 (μM) TT Hợp chất 43a 43b 43c 43d 43e 43f SW480 LU-1 HepG2 HL-60 19,24 >20 >20 >20 >20 16,38 19,00 >20 >20 >20 >20 16,90 >20 >20 >20 >20 >20 17,67 >20 >20 >20 >20 >20 9,52 15 10 11 12 13 43g 43h 43i 6-mercaptopurin Indirubin Indirubin-3ʹ-oxime Ellipticine 15,96 >20 >20 19,10 >20 14,26 2,19 19,11 19,20 >20 18,75 >20 13,11 1,91 15,34 >20 >20 19,72 >20 15,87 1,79 12,03 16,40 >20 16,04 >20 14,90 2,40 Kết thử nghiệm hoạt tính gây độc chống tăng sinh tế bào ung thư bảng cho thấy hai dẫn xuất 43f 43g có hoạt tính bốn dòng tế bào thử nghiệm, giá trị IC50 dao ng t 9,52ữ19,11 àM Hai hp cht 43a v 43h thể hoạt tính gây độc yếu hai dòng tế bào ung thư Năm dẫn xuất lại khơng thể hoạt tính nồng độ nghiên cứu 4.2.3 Đánh giá hoạt tính chống ung thư dẫn xuất indirubin 45a-45h Bảng 4.15 Hoạt tính gây độc chống tăng sinh tế bào in vitro dẫn xuất indirubin 45a-45h chất đối chứng dương IC50 (μM) TT 10 11 12 Hợp chất 45a 45b 45c 45d 45e 45f 45g 45h 6-mercaptopurin Indirubin Indirubin-3ʹoxime Ellipticine SW480 LU-1 HepG2 HL-60 >20 >20 >20 >20 >20 1,65 >20 4,19 19,10 >20 14,26 >20 >20 >20 >20 >20 2,21 >20 4,53 18,75 >20 13,11 >20 >20 >20 >20 >20 1,90 >20 4,47 19,72 >20 15,87 >20 >20 >20 >20 >20 1,35 >20 4,28 16,04 >20 2,19 1,91 1,79 2,40 16 14,90 Kết thử nghiệm hoạt tính gây độc chống tăng sinh tế bào ung thư bảng cho thấy hai dẫn xuất 45f 45h có hoạt tính bốn dịng tế bào thử nghim, giỏ tr IC50 dao ng t 1,35ữ4,53 àM Sỏu dẫn xuất cịn lại khơng thể hoạt tính nồng độ nghiên cứu 4.2.4 Đánh giá hoạt tính chống ung thư dẫn xuất indirubin 53a-53l Bảng 4.16 Hoạt tính gây độc chống tăng sinh tế bào in vitro dẫn xuất indirubin 53a-53l chất đối chứng dương IC50 (μM) TT Hợp chất 10 11 12 53a 53b 53c 53d 53e 53f 53g 53h 53i 53k 53l Indirubin Indirubin-3ʹoxime Ellipticine 13 14 SW480 LU-1 HepG2 HL-60 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 14,26 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 13,11 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 15,87 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 2,19 1,91 1,79 14,90 2,40 Kết thử nghiệm bảng cho thấy tất dẫn xuất 53a53l khơng thể hoạt tính gây độc chống tăng sinh bốn dòng tế bào ung thư nồng độ nghiên cứu 4.2.5 Đánh giá hoạt tính chống ung thư dẫn xuất indirubin 56a-56p 17 Bảng 4.17 Hoạt tính gây độc chống tăng sinh tế bào in vitro dẫn xuất indirubin 54, 55, 56a-56p chất đối chứng dương IC50 (μM) TT Hợp chất 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 SW480 LU-1 HepG2 HL-60 HEK-293 54 55 >20 18,58 >20 19,55 >20 >20 >20 15,27 >20 16,22 56a 56b 56c 56d 56e 56f 56g 56h 56i 56k 56l 56m 56n 56o 56p Indirubin Indirubin3ʹ-oxime Ellipticine 3,36 >20 3,80 4,46 4,66 2,54 4,10 14,13 3,43 2,91 3,03 14,36 12,54 11,16 11,71 >20 15,65 2,26 >20 2,99 2,85 3,28 1,30 3,96 8,74 2,07 2,50 2,07 8,74 10,08 8,80 8,61 >20 16,36 3,56 >20 3,38 3,76 4,62 2,01 5,68 14,23 2,28 2,95 3,28 15,31 11,70 11,68 10,61 >20 16,00 2,39 >20 1,43 3,40 3,27 0,98 4,82 6,50 1,28 1,29 1,28 15,96 10,44 9,39 11,25 >20 3,21 >20 1,19 2,01 6,98 1,03 1,80 9,74 0,85 1,92 7,12 11,93 9,52 5,89 7,72 >20 14,16 1,76 2,50 1,93 2,19 16,50 0,32 Dựa vào kết Bảng 4.17 nhận thấy hợp chất trung gian 55 thể hoạt tính mức yếu với dịng SW-480, LU-1 HL-60 Các tổ hợp lai indirubin với hydroxychalcone qua liên kết methylen 1,2,3-triazole 56a-56l thể hoạt tính mạnh rõ rệt so với tiền chất, ngoại trừ hợp chất 56b với có mặt đồng thời nhóm methoxy (CH3O-) vị trí R2, R3, R4 khơng thể hoạt 18 tính tất dòng tế bào ung thư nồng độ nghiên cứu Hợp chất 56f thể hoạt tính gây độc chống tăng sinh mạnh dòng tế bào ung thư SW480, LU-1, HepG2 HL-60 với giá trị IC50 tương ứng 2,54; 1,30; 2,01 0,98 μM, cao rõ rệt so với indirubin-3'-oxime Phân tích tương quan cấu trúc hợp chất 55, indirubin-3'-oxime, dãy dẫn xuất 56a-56p kết hợp với hoạt tính thử nghiệm dẫn tới giả thuyết diện nhóm oxime (=N-OH) cấu trúc đóng vai trị quan trọng hoạt tính gây độc chống tăng sinh tế bào ung thư Giả thuyết phù hợp với kết thử hoạt tính dãy 53a-53l (Bảng 4.16), dẫn xuất indirubin bị nhóm oxime (cùng có hợp phần hydoxychalcone tương tự) khơng thể hoạt tính Đáng lưu ý ba tổ hợp lai 56e, 56h, 56l indirubin-3'-oxime với hydroxychalcone qua liên kết methylen 1,2,3-triazole có nhóm methoxy (CH3O-), ethoxy (C2H5O-), propoxy (n-C3H7O-) vị trí R3 (nhóm vị trí para hợp phần aldehyde hydroxychalcone) quan sát tác động tới khả gây độc chọn lọc tế bào ung thư tế bào thường Bằng chứng giá trị IC50 chất 56e, 56h, 56l dòng tế bào thường thận HEK-293 tương ứng 6,98; 9,74; 7,12 μM cao so với dòng tế bào ung thư đồng nghĩa với độc tính thấp hơn, sử dụng cho nghiên cứu sâu khả chống ung thư Các dẫn xuất 56m-56p thể hoạt tính gây độc chống tăng sinh dòng tế bào ung thư mạnh hợp chất indirubin3'-oxime, nói chung yếu dẫn xuất 56a-56l Tuy nhiên chất tạo dạng muối tan với axít làm tăng sinh khả dụng chất 4.3 Mối tương quan cấu trúc hoạt tính chống ung thư chất Để giải thích chất tổng hợp trên, có chất khơng thể hoạt tính chống ung thư nồng độ nghiên cứu, có chất thể 19 hoạt tính mức độ mạnh yếu khác Mơ tương tác chất đích enzyme GSK-3β sử dụng phần mềm AutoDock 4.2.6 dùng để góp phần giải thích kết hoạt tính Kết mô Bảng 4.18 Bảng 4.19 cho thấy có mối tương quan tốt lượng liên kết (năng lượng dock hay lực) chất với enzyme GSK-3β số liên kết hydro hình thành chất với amino axit tâm hoạt động enzyme (các amino axit bôi đậm) hoạt tính chống ung thư thực nghiệm Bảng 4.18 Năng lượng dock giá trị số ức chế dự đoán chất Hợp chất 54 55 56a 56b 56c 56d 56e 56f 56g 56h 56i E dock (Kcal/mol) -8,49 Ki, pred (M) 600,31.10-9 -9 -9,30 -13,64 -9,34 -13,17 -11,82 -13,18 -14,09 -13,72 151,8.10 99,73.10-12 1,39.10-6 222,3.10-12 2,18.10-9 219,2.10-12 46,6.10-12 87,29.10-12 -11,53 3,53.10-9 -12,85 380,4.10-12 Hợp chất 56k E dock (Kcal/mol) -12,73 Ki, pred (M) 467,7.10-12 -13,78 -9,88 -11,55 -11,19 -11,25 -9,08 -9,51 -11,82 79,11.10-12 57,51.10-9 3,43.10-9 6,27.10-9 5,71.10-9 222,71.10-9 107,82.10-9 2,18.10-9 -10,69 14,06.10-9 56l 56m 56n 56o 56p 25 CHIR98014 Bioacetoxime Bảng 4.19 Liên kết hydro chất với amino axit enzyme GSK-3β Hợp chất Số liên kết H Amino axit Hợp chất Số liên kết H Amino axit 54 Val135 56i Asn64, Tyr134, Gln185 20 55 Val135 56n Ile62, Val135, Cys199 56a Ile62, Val135, Gln185 Asp133, Val135 56b Ile62 25 56c Ile62, Val135, Asn186, Cys199 56f Val135, Thr138 CHIR98014 Bioacetoxime Ile62, Asp133, Val135 Ile62, Thr138, Val135, Gln185 Asp133, Val135 KẾT LUẬN Trong luận án tổng hợp 52 chất dẫn xuất indirubin bao gồm: - chất 42a-42i tổ hợp indirubin-3'-oxime với hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin qua liên kết trimethylen vị trí 3'-oxime; - chất 43a-43i tổ hợp indirubin-3'-oxime với hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin qua liên kết 2-ol-1,3-propylen vị trí 3'-oxime; - chất 45a-45i tổ hợp indirubin với hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin qua liên kết 2-ol1,3-propylen vị trí N-1; - 11 chất 53a-53l tổ hợp indirubin-3'-oxime với hợp chất hydroxychalcone qua liên kết methylen 1,2,3-triazole vị trí 3'-oxime; - 11 chất 56a-56l tổ hợp indirubin-3ʹ-oxime với hợp chất hydroxychalcone qua liên kết methylen 1,2,3-triazole vị trí N-1; - chất 56m-56p tổ hợp indirubin-3ʹ-oxime với hợp chất amine qua liên kết methylen 1,2,3-triazole vị trí N-1 Các sản phẩm đích sản phẩm trung gian trình tổng 21 hợp xác định cấu trúc phương pháp phổ đại 1D, 2D-NMR, HR-MS(ESI) Ngồi ra, chất trung gian chìa khóa 55 đo phổ nhiễu xạ tia X đơn tinh thể để xác định cấu hình tuyệt đối Đánh giá hoạt tính chống ung thư in vitro dẫn xuất indirubin: - Đánh giá hoạt tính gây độc chống tăng sinh tế bào in vitro 52 chất bốn dòng tế bào ung thư SW480, LU-1, Hep-G2, HL-60 cho kết quả: 22 chất bao gồm 42e, 42i, 43a, 43f, 43g, 43h, 45f, 45h, 56a 56c-56p thể hoạt tính gây độc chống tăng sinh dòng tế bào ung thư vi giỏ tr IC50 dao ng t 1,3ữ19,24 àM Trong có 20 chất bao gồm 42e, 42i, 43f, 43g, 45f, 45h, 56a 56c-56p thể hoạt tính gây độc chống tăng sinh bốn dòng tế bào thử nghiệm Đặc biệt, có 18 chất 42e, 42i, 45f, 45h, 56a 56c-56p thể hoạt tính gây độc chống tăng sinh bốn dòng tế bào ung thư với giá trị IC50 dao ng t 1,3ữ15,96 àM, hot tớnh ny mnh hn so với hợp chất indirubin-3ʹ-oxime, hợp chất nghiên cứu nhiều ung thư - Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào 15 hợp chất 56a-56p dòng tế bào thường thận HEK-293 cho kết quả: Ba hợp chất 56e, 56h, 56l thể hoạt tính gây độc dòng tế bào thường thận với giá trị IC50 tương ứng 6,98; 9,74; 7,12 μM, cao so với giá trị IC50 dòng tế bào ung thư Từ đưa gợi ý ba hợp chất đáng quan tâm cho nghiên cứu sâu để tìm kiếm thuốc điều trị bệnh ung thư Mối tương quan cấu trúc hoạt tính chống ung thư in vitro: - So sánh kết thực nghiệm đánh giá hoạt tính chống ung thư in vitro dẫn xuất indirubin 3'-oxime N-1 nhận được, đặc biệt kết thử nghiệm hoạt tính dãy 53a-53l 56a-56l, chúng tơi cho nhóm 3'-oxime (=N-OH) cấu trúc dẫn 22 xuất indirubin đóng vai trị quan trọng để hình thành hoạt tính chống ung thư dòng tế bào SW480, LU-1, Hep-G2, HL60 chất Sự xuất hợp phần hydroxychalcone vị trí N-1 làm tăng hoạt tính chống ung thư dẫn xuất tạo Kết phù hợp với kết khảo sát tương tác dẫn xuất với enzym GSK-3β - Khảo sát mô tương tác chất đích enzyme GSK-3β phần mềm AutoDock4.2.6 góp phần làm sáng tỏ hoạt tính chống ung thư dòng tế bào SW480, LU-1, Hep-G2, HL60 chất KIẾN NGHỊ Tiếp tục mở rộng thử nghiệm hoạt tính tim mạch đặc biệt tác dụng chống tập kết tiểu cầu dẫn xuất indirubin thu NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Đã tổng hợp 52 chất dẫn xuất indirubin gồm: - chất 42a-42i tổ hợp indirubin-3'-oxime với hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin qua liên kết trimethylen vị trí 3'-oxime; - chất 43a-43i tổ hợp indirubin-3'-oxime với hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin qua liên kết 2-ol-1,3-propylen vị trí 3'-oxime; - chất 45a-45i tổ hợp indirubin với hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin qua liên kết 2-ol1,3-propylen vị trí N-1; - 11 chất 53a-53l tổ hợp indirubin-3'-oxime với hợp chất hydroxychalcone qua liên kết methylen 1,2,3-triazole vị trí 3'-oxime; - 11 chất 56a-56l tổ hợp indirubin-3ʹ-oxime với hợp chất hydroxychalcone qua liên kết methylen 1,2,3-triazole vị trí N-1; 23 - chất 56m-56p tổ hợp indirubin-3ʹ-oxime với hợp chất amine qua liên kết methylen 1,2,3-triazole vị trí N-1 Các sản phẩm đích sản phẩm trung gian trình tổng hợp xác định cấu trúc phương pháp phổ đại 1D, 2D-NMR, HR-MS(ESI) Ngồi ra, chất trung gian chìa khóa (2ʹZ, 3ʹE)-1-(prop-2-ynyl)indirubin-3ʹ-oxime đo phổ nhiễu xạ tia X đơn tinh thể để xác định cấu hình tuyệt đối Đã đánh giá hoạt tính gây độc chống tăng sinh tế bào 52 dẫn xuất tổng hợp bốn dòng tế bào ung thư SW480, LU-1, Hep-G2, HL-60 Ngồi ra, đánh giá hoạt tính gây độc tế bào 15 hợp chất 56a-56p dòng tế bào thượng thận HEK-293 Kết ba hợp chất 56e, 56h, 56l thể hoạt tính gây độc dịng tế bào thường thận với giá trị IC50 cao so với giá trị IC50 dòng tế bào ung thư Từ đưa gợi ý ba hợp chất đáng quan tâm cho nghiên cứu sâu để tìm kiếm thuốc điều trị bệnh ung thư Đã đánh giá mối tương quan cấu trúc hoạt tính chống ung thư in vitro hợp chất tổng hợp Mô tương tác chất đích enzyme GSK-3β phần mềm AutoDock 4.2.6 góp phần làm sáng tỏ hoạt tính chống ung thư dịng tế bào SW480, LU-1, Hep-G2, HL-60 chất 24 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN Nguyen Trong Dan, Hoang Duc Quang, Vuong Van Truong, Do Huu Nghi, Nguyen Manh Cuong, To Dao Cuong, Tran Quoc Toan, Long Giang Bach, Nguyen Huu Thuan Anh, Nguyen Thi Mai, Ngo Thi Lan, Luu Van Chinh, Pham Minh Quan, Design, synthesis, structure, in vitro cytotoxic activity evaluation and docking studies on target enzyme GSK-3β of new indirubin-3ʹ-oxime derivatives, Scientific Report, 2020, 10:11429 ( ISI uy tín, Q1) Dan Trong Nguyen, Giang Nguyen Truong, Truong Van Vuong, Tai Nguyen Van, Cuong Nguyen Manh, Cuong To Dao, Thuy Dinh Thi Thuy, Chinh Luu Van, Vu Tran Khac, Synthesis of new indirubin derivatives and their in vitro anticancer activity, Chemical Papers, 2019, 73, 1083-1092 (Quốc tế uy tín, Q2) Nguyễn Trọng Dân, Nguyễn Trường Giang, Phạm Minh Quân, Tô Đạo Cường, Nguyễn Mạnh Cường, Lưu Văn Chính, Tổng hợp đánh giá hoạt tính chống ung thư in vitro dẫn xuất indirubin, Tạp chí Hóa học, 2019, 57(4e3,4), 50-54 (Quốc gia uy tín) Nguyễn Trọng Dân, Nguyễn Trường Giang, Nguyễn Thị Kim Thoa, Tô Đạo Cường, Nguyễn Mạnh Cường, Lưu Văn Chính, Tổng hợp dẫn xuất indirubin với chalcone, Tạp chí Hóa học, 2019, 57(4e3,4), 55-60 (Quốc gia uy tín) Nguyễn Trọng Dân, Nguyễn Trường Giang, Lưu Văn Chính, Nguyễn Mạnh Cường, Tổng hợp số chalcone có chứa nhóm azide, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nhiệt đới, 2018, 16, 95-101 (Quốc gia) ... đánh giá tác dụng sinh học dẫn xuất indirubin? ?? Mục tiêu nghiên cứu luận án - Tổng hợp 40 dẫn xuất indirubin xuất phát từ nguyên liệu đầu indirubin thu nhận từ chàm mèo Strobilanthes cusia - Đánh. .. tế vấn đề: 1.1 Giới thiệu indirubin đồng phân 1.2 Thu nhận, tổng hợp indirubin 1.3 Tổng hợp dẫn xuất indirubin 1.4 Hoạt tính sinh học indirubin dẫn xuất 1.5 Khái quát hợp chất 1,3,4-oxadiazole,... THỰC NGHIỆM Phần mô tả thực nghiệm tổng hợp dẫn xuất indirubin theo sơ đồ phản ứng thử nghiệm hoạt tính sinh học dẫn xuất tạo 3.1 .Tổng hợp tổ hợp lai indirubin với hợp chất 1,3,4oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole,