nghiên cứu đặc điểm thực vật, đa dạng di truyền và thành phần hóa học của cây ba kích (morinda officinalis f c how) ở huyện tây giang, tỉnh quảng nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ LINH GIANG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA CÂY BA KÍCH (Morinda officinalis F.C.How) Ở HUYỆN TÂY GIANG, TỈNH QUẢNG NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ LINH GIANG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY BA KÍCH (Morinda officinalis F.C.How) Ở HUYỆN TÂY GIANG, TỈNH QUẢNG NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LIỆU – DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 8720206 Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Trần Văn Ơn TS Hoàng Quỳnh Hoa HÀ NỘI 2019 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội cho em môi trường học tập, nghiên cứu thuận lợi Đặc biệt với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS TS Trần Văn Ơn TS Hoàng Quỳnh Hoa, hai người thầy, người đồng nghiệp đáng mến với đức tính tốt đẹp, người dẫn dắt, đồng hành em đường giảng dạy nghiên cứu khoa học Em xin chân thành cảm ơn đồng nghiệp Bộ môn Thực vật đặc biệt ThS Nghiêm Đức Trọng ThS Lê Thiên Kim hỗ trợ em nhiều trình nghiên cứu Cảm ơn bạn sinh viên khóa 69 nghiên cứu mơn ln giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thực nghiệm Em xin cảm ơn Ủy ban nhân dân huyện Tây Giang, tỉnh Quảng Nam, anh Nguyễn Bá Hiển, giám đốc HTX Thiên Bình tạo điều kiện cho em thu mẫu hoàn tất thủ tục cần thiết, hỗ trợ em nhiều trình điều tra thu mẫu thực địa Cảm ơn anh chị Phịng Đơng dược – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương anh chị Viện di truyền Nông nghiệp Việt Nam hỗ trợ giúp đỡ em nội dung nghiên cứu đề tài Con xin cảm ơn gia đình ln ủng hộ, khích lệ, tạo điều kiện tốt cho thời gian thực luận văn Sau cùng, em xin kính chúc thầy cô môn Thực vật thật dồi sức khỏe, công tác tốt Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 29 tháng 11 năm 2019 Học viên Phạm Thị Linh Giang MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan lồi Ba kích Morinda officinalis F.C.How 1.1.1 Đặc điểm thực vật 1.1.2 Phân bố, sinh thái 1.1.3 Thành phần hóa học rễ Ba kích 1.1.4 Tác dụng sinh học Ba kích 1.1.5 Công dụng theo y học cổ truyền rễ Ba kích 1.2 Tổng quan thị phân tử dựa kỹ thuật PCR ứng dụng số nghiên cứu đa dạng di truyền loài Morinda officinalis F.C.How 1.2.1 Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic ADN) 1.2.2 Chỉ thị đoạn trình tự vùng phiên mã nội ADN Ribosom (ITS – rADN) 1.2.3 Ứng dụng thị phân tử dựa kỹ thuật PCR nghiên cứu đa dạng di truyền loài Morinda officinalis F.C.How 1.3 Sự dạng hình thái loài Morinda officinalis F.C.How Việt Nam 13 1.4 Một số nghiên cứu hóa học lồi Morinda officinalis F.C.How Việt Nam 14 1.5 Tổng quan hai thành phần nystose monotropein 15 1.5.1 Tổng quan nystose rễ Ba kích 15 1.5.2 Tổng quan monotropein rễ Ba kích 17 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 20 VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Đối tượng nghiên cứu 20 2.2 Nguyên vật liệu thiết bị 21 2.2.1 Dung mơi, hóa chất 21 2.2.2 Thiết bị dùng nghiên cứu 22 2.3 Phương pháp nghiên cứu 23 2.3.1 Mơ tả đặc điểm hình thái 23 2.3.2 Đánh giá đa dạng di truyền dựa thị ITS 24 2.3.3 Nghiên cứu thành phần hóa học mẫu nghiên cứu 28 CHƯƠNG KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 32 3.1 Đặc điểm hình thái giám định tên khoa học mẫu nghiên cứu 32 3.1.1 Phân tích đặc điểm hình thái mẫu nghiên cứu 32 3.1.2 Giám định tên khoa học mẫu nghiên cứu 41 3.2 Kết nghiên cứu đa dạng di truyền 42 3.2.1 Kết thu thập mẫu tách chiết ADN tổng số 42 3.2.2 Kết chạy PCR tinh sản phẩm khuếch đại 42 3.2.3 Trình tự vùng ITS-rDNA mẫu Ba Kích nghiên cứu 43 3.3.4 Cây quan hệ phát sinh mẫu nghiên cứu dựa trình tự nucleotid vùng ITS1-rRNA-ITS2 47 3.3 Nghiên cứu thành phần hóa học mẫu rễ Ba kích 48 3.3.1 Xây dựng vân tay sắc ký số mẫu Ba kích TLC 48 3.3.2 Đánh giá hàm lượng monotropein số mẫu rễ Ba kích HPLC 50 3.3.3 Đánh giá hàm lượng nystose số mẫu rễ Ba kích HPLCELSD 60 CHƯƠNG BÀN LUẬN 65 4.1 Về đặc điểm hình thái phân loại 65 4.1.1 Sự đa dạng hình thái lồi Ba kích Morinda officinalis F.C.How 65 4.1.2 Các lồi dùng Ba kích Tây Giang, Quảng Nam 66 4.2 Về đa dạng di truyền đoạn trình tự ITS mẫu Ba kích M officinalis F.C.How 69 4.3 Về thành phần hóa học 70 4.3.1 Về xây dựng vân tay sắc ký lớp mỏng 70 4.3.2 Về định lượng nystose mẫu nghiên cứu 70 4.3.3 Về định lượng monotropein mẫu Ba kích 71 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 74 KẾT LUẬN 74 KIẾN NGHỊ 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ Diễn giải ADN Acid Deoxyribo Nucleic BK Ba kích Tên BDNF Brain-derived neurotrophic factor Yếu tố tế bào thần kinh có nguồn gốc từ não Cặp base bp Base pair CTAB Cetyl trimethylammonium bromide DAD Diode Array Detectors dATP 2’-deoxyadenosin triphosphat dCTP 2’-deoxycytidin-5’-triphospha dGTP 2’-deoxyguanosin triphosphat dNTP deoxynucleotide Triphosphate dTTP 2’-deoxythymin triphosphat EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid ELSD Evaporative Light Scattering Detector Detector tán xạ ánh sáng Detector mảng Diod bay EtBr Ethidium bromide ETS External Transcribed Spacer FOS Fructooligosacaride GSK3β Glycogen synthase kinase beta HNIP Hanoi Institute of Pharmacy Vùng phiên mã bên ngồi Phịng tiêu Trường Đại học Dược Hà Nội HPLC High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu chromatography cao Chữ viết tắt HPTLC IGS Tên đầy đủ Diễn giải High performance thin layer Sắc ký lớp mỏng hiệu chromatography cao Intergenic spacer Vùng biến động bên ISSR Inter Simple Sequence Repeat Chỉ thị phân tử đa hình ISSR ITS Internal Transcribed Spacer Vùng phiên mã bên LSU Large subunit Tiểu đơn vị lớn matK Megakaryocyte-Associated Tyrosine Kinase NCBI National Center for Biotechnology Trung tâm Thông tin Information Công nghệ sinh học Quốc gia nrITS Nuclear Ribosomal Internal Transcribed Spacer PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp RAPD rbcL Random Amplification of ADN đa hình khuếch đại Polymorphic DNA ngẫu nhiên Ribulose bisphosphate carboxylase large rDNA Ribosomal Deoxyribo Nucleic Acid Rf Retention factor rRNA Ribosomal Ribonucleic Acid SSU Small subunit TAE Tris base-acetate-EDTA Hệ số lưu giữ Tiểu đơn vị nhỏ Chữ viết tắt Tên đầy đủ Diễn giải TG Tây Giang Địa danh thu mẫu TLC Thin-layer chromatography Sắc ký lớp mỏng DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Tên bảng biểu Bảng 1.1 Cơng thức nhóm dẫn chất anthraquinon rễ Ba Trang kích Bảng 2.1 Ký hiệu, thơng tin mẫu Ba kích nghiên cứu 20 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 26 Bảng 2.3 Chu trình phản ứng PCR 26 Bảng 3.1 Thành phần bốn loại nucleotide 14 mẫu Ba Kích 44 Bảng 3.2 Hệ số tương đồng cặp mẫu 46 Bảng 3.3 Thứ tự, màu sắc, Rf vết sắc kỹ sắc ký đồ 50 mẫu nghiên cứu Bảng 3.4 Kết đánh giá độ thích hợp hệ thống phương pháp định 51 lượng hàm lượng monotropein rễ Ba kích Bảng 3.5 Kết khảo sát khoảng tuyến tính phương pháp định lương 53 Monotropein Bảng 3.6 Kết thẩm định độ phương pháp mẫu thử 55 5TG07 Bảng 3.7 Kết độ lặp lại phương pháp định lượng hàm lượng 56 monotropein rễ Ba kích Bảng 3.8 Kết tính thích hợp hệ thống độ xác trung gian 57 phương pháp định lượng hàm lượng monotropein rễ Ba kích Bảng 3.9 Kết khảo sát độ xác trung gian phương pháp định 57 lượng hàm lượng monotropein rễ Ba kích Bảng 3.10 Hàm lượng Monotropein mẫu rễ Ba kích 59 Bảng 3.11 Kết đánh giá độ thích hợp hệ thống phương pháp định 61 lượng hàm lượng nystose rễ Ba kích Bảng 3.12 Kết khảo sát khoảng tuyến tính phương pháp định 62 Scanned with CamScanner Scanned with CamScanner Scanned with CamScanner Scanned with CamScanner Scanned with CamScanner Scanned with CamScanner Scanned with CamScanner Scanned with CamScanner Scanned with CamScanner Scanned with CamScanner Scanned with CamScanner Scanned with CamScanner Scanned with CamScanner Scanned with CamScanner Scanned with CamScanner ... D? ?C VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI H? ?C DƯ? ?C HÀ NỘI PHẠM THỊ LINH GIANG NGHIÊN C? ??U Đ? ?C ĐIỂM TH? ?C VẬT, ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ THÀNH PHẦN HĨA H? ?C CỦA C? ?Y BA KÍCH (Morinda officinalis F. C. How) Ở HUYỆN... thành phần hóa h? ?c chính, so sánh với giống Ba kích miền B? ?c, nhằm cung c? ??p sở khoa h? ?c cho vi? ?c sử dụng Ba kích Quảng Nam, đề tài ? ?Nghiên c? ??u đ? ?c điểm th? ?c vật, đa dạng di truyền thành phần hóa h? ?c. .. khơng c? ? đ? ?c điểm hình thái lồi Morinda officinalis F. C. How Để nghiên c? ??u rõ đ? ?c điểm th? ?c vật, đa dạng di truyền Ba kích Tây Giang, Quảng Nam, tiến hành đánh giá chất lượng Ba kích thơng qua số thành