xây dựng quy trình chế biến hà thủ ô đỏ (fallopia multilflora thunb ) và đề xuất tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI BÙI THỊ THƢƠNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẾ BIẾN HÀ THỦ Ơ ĐỎ (FALLOPIA MULTILFLORA THUNB.) VÀ ĐỀ XUẤT TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CHO SẢN PHẨM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI BÙI THỊ THƢƠNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẾ BIẾN HÀ THỦ Ơ ĐỎ (FALLOPIA MULTILFLORA THUNB.) VÀ ĐỀ XUẤT TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CHO SẢN PHẨM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẦM VÀ BÀO CHẾ THUỐC MÃ SỐ: 8720202 Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Thanh Bình GS TS Phạm Xuân Sinh HÀ NỘI 2020 LỜI CẢM ƠN Luận văn hoàn thành cố gắng nỗ lực với giúp đỡ nhiều cá nhân tập thể Nhân dịp luận văn hồn thành tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới: TS Nguyễn Thị Thanh Bình - Chủ nhiệm Bộ mơn Hóa dược Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội tận tình hướng dẫn bảo, đóng góp nhiều ý kiến quý báu tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu thực luận văn GS TS Phạm Xuân Sinh - Nguyên Chủ nhiệm Bộ môn Dược học cổ truyển, Đại học Dược Hà Nội tận tình hướng dẫn chi tiết, góp nhiều ý kiến quan trọng tạo điều kiện thuận lợi cho suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Chủ nhiệm Khoa Y Dƣợc, Đại học Quốc gia Hà Nội tồn thể thầy giáo khoa giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho học tập, nghiên cứu để hồn thành luận văn Tơi xin cảm ơn Khoa Y Dƣợc, Đại học Quốc gia Hà Nội tài trợ kinh phí cho đề tài (đề tài mã số CS.18.04) Cuối cùng, xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè ln bên động viên khích lệ, tạo điều kiện thuận lợi cho học tập ln giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Học viên Bùi Thị Thƣơng MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm thực vật, phân bố phận dùng hà thủ ô đỏ 1.2 Thành phần hóa học hà thủ ô đỏ 1.3 Phương pháp chế biến biến đổi mặt hóa học q trình chế biến hà thủ ô đỏ 1.3.1 Trên giới 1.3.2 Tại Việt Nam 1.4 Công dụng, tác dụng sinh học hà thủ ô đỏ 1.5 Độc tính hà thủ ô đỏ 13 1.6 Tiêu chuẩn chất lượng hà thủ ô đỏ 16 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.2 Hóa chất 20 2.3 Thiết bị, dụng cụ 20 2.4 Phương pháp nghiên cứu 21 2.4.1 Phương pháp xây dựng quy trình định lượng đồng thời THSG EM 21 2.4.2 Phương pháp xây dựng quy trình chế biến hà thủ ô đỏ 26 2.4.3 Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn sở cho hà thủ đỏ sau chế biến 32 2.4.4 Phương pháp xử lý số liệu 34 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35 3.1 Xây dựng quy trình định lượng đồng thời THSG EM 35 3.1.1 Xác định bước sóng phát 35 3.1.2 Xác định chương trình rửa giải 37 3.1.3 Thẩm định tính đặc hiệu 40 3.1.4 Thẩm định tính tuyến tính miền giá trị 44 3.1.5 Xác định giới hạn phát giới hạn định lượng 46 3.1.6 Thẩm định độ 48 3.1.7 Thẩm định độ xác 50 3.2 Xây dựng quy trình chế biến hà thủ đỏ 52 3.2.1 Định lượng THSG EM hà thủ ô đỏ trước chế biến 52 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng số yếu tố giai đoạn ngâm 52 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng số yếu tố giai đoạn nấu 54 3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng thời gian nấu 56 3.3 Xây dựng tiêu chuẩn sở cho hà thủ ô đỏ sau chế biến 61 3.3.1 Mô tả 61 3.3.2 Định tính 62 3.3.3 Độ ẩm 66 3.3.4 Chất chiết dược liệu chế 67 3.3.5 Định lượng 68 Chƣơng BÀN LUẬN 71 4.1 Về xây dựng quy trình định lượng đồng thời THSG EM 71 4.2 Về xây dựng quy trình chế biến hà thủ ô đỏ 72 4.3 Về xây dựng tiêu chuẩn sở cho hà thủ ô đỏ sau chế biến 76 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC PHỤ LỤC PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril CTPT Công thức phân tử DAD Đầu dò dãy diode quang (Diode Array Detector) DDPM 2,3-dihydro-3,5 dihydroxy-6-methyl-4(H)-pyran-4-on DĐHK Dược điển Hồng Kông DĐTQ Dược điển Trung Quốc DĐVN Dược điển Việt Nam EG Emodin-8-O-β-D-glucosid EM Emodin HDL Lipoprotein tỷ trọng cao HL Hàm lượng HMF Hydroxymethyl furfural HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) HTGL Triglycerid lipase gan (Hepatic triglyceride lipase) HTOĐ Hà thủ ô đỏ ICH Hội nghị quốc tế hài hồ hố thủ tục đăng ký dược phẩm sử dụng cho người (International conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human use) KLPT Khối lượng phân tử LOD Giới hạn phát (Limit of detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of quantitation) MS Khối phổ (Mass spectrometry) PS Physcion PG Physcion-8-O-β-D-glucosid RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation) TC Cholesterol toàn phần TCCS Tiêu chuẩn sở TCNSX Tiêu chuẩn nhà sản xuất TG Triglycerid THSG 2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid TT Thuốc thử UV Tử ngoại (Ultraviolet) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Thông tin mẫu hà thủ ô đỏ sử dụng nghiên cứu…………… 19 Bảng 2 Thông tin phụ liệu sử dụng nghiên cứu………………………20 Bảng Thành phần công thức thử nghiệm khảo sát giai đoạn ngâm……27 Bảng Thành phần công thức thử nghiệm khảo sát giai đoạn nấu…… 30 Bảng Chương trình gradient pha động ACN: H2O…………………… 35 Bảng Thông số pic THSG dung dịch chuẩn nồng độ 100 µg/ml bước sóng phát 320 nm……………………………………………………………… 36 Bảng 3 Thông số pic EM dung dịch chuẩn nồng độ 100 µg/ml bước sóng phát 254 nm……………………………………………………………… 37 Bảng Chương trình gradient pha động ACN : H2O…………………… 38 Bảng Thông số pic THSG dung dịch chuẩn nồng độ 100 µg/ml bước sóng phát 322 nm……………………………………………………………… 38 Bảng Thông số pic pic EM dung dịch chuẩn nồng độ 100 µg/ml bước sóng phát nm……………………………………………………………… 290 39 Bảng Thông số pic dung dịch chuẩn hỗn hợp THSG 50 µg/ml EM 50 µg/ml điều kiện sắc ký tối ưu……………………………………………………… 41 Bảng Thông số pic mẫu thử điều kiện sắc ký tối ưu………………… 42 Bảng Thông số pic mẫu thử thêm chuẩn điều kiện sắc ký tối ưu…….44 Bảng 10 Kết phân tích hồi quy mối tương quan nồng độ dung dịch diện tích pic THSG…………………………………………………………………… 44 Bảng 11 Kết phân tích hồi quy mối tương quan nồng độ dung dịch diện tích pic emodin………………………………………………………………… 45 Bảng 12 Kết xác định tỷ lệ phục hồi THSG……………………………… 49 Bảng 15 Kết xác định độ lặp lại phương pháp với EM………………… 50 Bảng 16 Kết xác định độ xác trung gian phương pháp với THSG… 51 Bảng 17 Kết xác định độ xác trung gian phương pháp với EM…….51 Bảng 18 Kết phân tích HTOĐ trước chế biến…………………………… 52 Bảng 19 Kết phân tích mẫu HTOĐ sau ngâm……………………… 53 Bảng 20 So sánh hàm lượng THSG EM trước sau ngâm……………… 53 Bảng 21 Kết phân tích mẫu giai đoạn nấu………………………… 55 Bảng 22 So sánh hàm lượng THSG EM trước sau nấu………………… 55 Bảng 23 Các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng THSG EM…………… 57 Bảng 24 Thành phần, công thức thử nghiệm khảo sát ảnh hưởng thời gian nấu…………………………………………………………………………………… 58 Bảng 25 Kết phân tích mẫu thực nghiệm khảo sát thời gian nấu… 59 Bảng 26 So sánh hàm lượng THSG EM trước sau nấu với đậu đen…… 59 Bảng 27 So sánh hàm lượng THSG EM trước sau nấu với nước cất…… 60 Bảng 28 Kết phân tích mẫu hà thủ thơ………………………………… 61 Bảng 29 Mô tả hà thủ ô đỏ chế…………………………………………………… 62 Bảng 30 Định tính hà thủ đỏ chế phản ứng hóa học……………………… 63 Bảng 31 Kết xác định đổ ẩm mẫu hà thủ ô đỏ chế…………………… 67 Bảng 32 Kết xác định hàm lượng chất chiết hà thủ ô đỏ chế…… 68 Bảng 33 Kết phân tích mẫu hà thủ ô đỏ trước sau chế biến……… 69 1,0% hà thủ ô đỏ thô không thấp 0,07% cho hà thủ ô đỏ chế Dược điển Hồng Kông (2008) lại quy định hàm lượng THSG không thấp 2,0% so mẫu hà thủ ô đỏ thô Như vậy, nhận thấy có khác biệt tiêu chuẩn định lượng hàm lượng giới hạn THSG Dược điển Nghiên cứu Nguyễn Thị Hà Ly cộng (2019) cho thấy hàm lượng THSG mẫu hà thủ ô trồng thời gian khác (1 năm, năm, năm) khác rõ rệt, đặc biệt vùng có vị trí địa lý khác hẳn nhau, nằm khoảng từ 1,0% đến 4,0% Cũng nghiên cứu cho thấy, hàm lượng EM lớn mẫu hà thủ ô đỏ thô xác định nghiên cứu 0,63% Các tác giả kiến nghị nên sử dụng hà thủ ô đỏ từ năm tuổi [34] Tang cộng (2017) nghiên cứu mười bảy hà thủ ô đỏ trồng mọc hoang dã thu thập từ 10 quận, tỉnh Trung Quốc cho thấy có khác biệt rõ rệ hàm lượng THSG EM vùng địa lý khác nhau, mẫu có thời gian trồng khác [54] Nghiên cứu Luo cộng (2019) sử dụng tỷ lệ tổng hàm lượng EG PG so với tổng hàm lượng emodin Physcion (giá trị F) để phân biệt hà thủ ô đỏ thô hà thủ ô đỏ chế Kết nghiên cứu 66 mẫu hà thủ ô đỏ thô 106 mẫu hà thủ ô đỏ chế cho thấy giá trị F mẫu dược liệu hà thủ ô đỏ phải lớn giá trị F không 0,6 mẫu hà thủ ô đỏ chế Từ kết thu được, tác giả đề xuất phương pháp phân biệt hà thủ ô đỏ thô hà thủ ô đỏ chế dựa vào tỷ lệ tương đối thành phần thay dựa hàm lượng tuyệt đối thành phần hóa học [51] Do đó, từ kết thực nghiệm qua tham khảo tài liệu, đề xuất tiêu định lượng hà thủ ô đỏ chế phải có hàm lượng THSG khơng thấp 0,2% hàm lượng EM không thấp 0,007%, tính theo dược liệu khơ kiệt; hàm lượng THSG giảm 50%, hàm lượng EM tăng 5%, tỷ lệ EM : THSG tăng 2,5 lần so với trước chế biến 78 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đề tài “Xây dựng quy trình chế biến Hà thủ đỏ (Fallopia multilflora Thunb.) đề xuất tiêu chuẩn sở cho sản phẩm” đạt mục tiêu đề Kết thu sau: Nghiên cứu xây dựng quy trình chế biến Hà thủ đỏ có hàm lượng THSG giảm 50% emodin tăng 5% Cụ thể, nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng số yếu tố trình chế biến đến hàm lượng THSG EM gồm: ảnh hưởng hai dung môi ngâm nước cất nước vo gạo thời gian ngâm 24 giờ; ảnh hưởng dung môi nấu nước cất nước đậu đen; ảnh hưởng thời gian nấu 30, 60, 90, 120 phút; ảnh hưởng việc tẩm dịch sau nấu Từ đó, nghiên cứu lựa chọn xây dựng quy trình chế biến hà thủ đỏ Thơng số quy trình: hà thủ ô đỏ sử dụng chế biến dạng phiến, dày 1-3 mm, đường kính 3-5 mm; dung mơi ngâm nước cất, tỷ lệ dung môi ngâm/hà thủ ô đỏ 3/1 (lít/kg), thời gian ngâm giờ; dung môi nấu nước, tỷ lệ dung môi nấu/hà thủ đỏ 8/1 (lít/kg), thời gian nấu 90 phút; khơng tẩm dịch cịn lại sau nấu; nhiệt độ sấy hà thủ ô đỏ chế 60oC, thời gian sấy 14 Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn sở cho hà thủ ô đỏ chế với số tiêu gồm:  Mô tả: hà thủ ô đỏ chế phiến mỏng co lại không đều, dày 1-2 mm, dài 2-5 mm, cứng sừng, bề ngồi có màu nâu nâu thẫm đặc trưng hà thủ ô đỏ Vị ngọt, đắng, se chát  Định tính: hà thủ ô đỏ chế phải dương tính với phản ứng định tính nhóm hợp chất anthranoid phải xuất pic THSG EM sắc ký đồ HPLC  Độ ẩm: không 12%  Chất chiết hà thủ đỏ chế: khơng 10% 79  Định lượng: hà thủ đỏ chế phải có hàm lượng THSG không thấp 0,2% hàm lượng EM khơng thấp 0,007%, tính theo dược liệu khơ kiệt; hàm lượng THSG giảm 50%, hàm lượng EM tăng 5%, tỷ lệ EM : THSG tăng 2,5 lần so với trước chế biến Kiến nghị  Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện nâng quy mơ quy trình chế biến hà thủ đỏ  Tiếp tục hồn thiện tiêu chuẩn sở cho hà thủ ô đỏ chế, tiến tới xây dựng chuyên luận hà thủ ô đỏ chế Dược điển Việt Nam  Đánh giá độ ổn định đề xuất hạn sử dụng cho hà thủ ô đỏ chế 80 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ Y Tế (2018), Dược điển Việt Nam V, Hà Nội, Hà Nội, tr 1180-1181 Bộ Y tế (2018), Thông tư 13/2018/TT-BYT quy định chất lượng dược liệu, thuốc cổ truyền., Hà Nội, tr 1-38 Bộ Y tế (2008), Phương pháp chung chế biến vị thuốc theo phương pháp cổ truyền, Hà Nội, tr 34-36 Đỗ Huy Bích (2007), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 884-888 Ngô Vân Thu (2011), Dược liệu học, NXB Y học, Hà Nội, tr 340-344 Nguyễn Thị Hà Ly (2013), Nghiên cứu xây dựng phương pháp định tính, định lượng hoạt chất dược liệu hà thủ ô đỏ Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson, Đại học Quốc gia Hà Nội Phạm Thanh Huyền Nguyễn Quỳnh Nga, cộng sự, (2016), "Nghiên cứu đặc điểm hình thái giải phẫu lồi Hà thủ ô đò Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson Việt Nam", Hội nghị khoa học toàn quốc Sinh thái Tài nguyên sinh vật lần thứ 6, tr 166-172 Phạm Xuân Sinh (2014), Dược học cổ truyền, NXB Y học, Hà Nội, tr 352-353 Phạm Xuân Sinh (2006), Phương pháp chế biến thuốc cổ truyền, Hà Nội, NXB Y học, tr 144-146 10 Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hố học vi sinh vật, NXB Khoa học Kỹ thuật, tr 10-59 Tiếng Anh 11 Bhadauria M (2010), "Dose-dependent hepatoprotective effect of emodin against acetaminophen-induced acute damage in rats", Experimental and Toxicologic Pathology, 62(6), pp 627-635 12 Chen Q., Zhang S., Ying H., Dai X., Li X., Yu C., Ye H (2012), "Chemical characterization and immunostimulatory effects of a polysaccharide from Polygoni Multiflori Radix Praeparata in cyclophosphamide-induced anemic mice", Carbohydrate polymers, 88(4), pp 1476-1482 13 China Chinese Medicine Division - Department of Health - Government of the Hong Kong Special Administrative Region - the People's Republic of (2008), Hong Kong Chinese Materia Medica Standards, pp 223-233 14 Commission Chinese Pharmacopoeia (2015), "Pharmacopoeia of the People’s Republic of China Part I", Chinese Medical Science Press: Beijing, China, pp 175-177 15 Ho Thanh Tam, Murthy H., Dalawai D., Bhat M., Paek K., Park S (2019), "Attributes of Polygonum multiflorum to transfigure red biotechnology", Applied microbiology and biotechnology, 103(8), pp 3317-3326 16 Hu X, Li M., Yang H., Wang L., Li D., Li Y (2011), "Effects of different ratios of tannin and stilbene glucoside from Polygonum multiflorum on liver biochemical indexes in rats", Shanghai Zhongyiyao Zazhi, 45, pp 56-59 17 Hu X., Li Y., Lin F (2009), "Effect of polygonum multiflorum and polygonum multiflorum preparation on immunoglobulin in rats", Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 26, pp 139-141 18 Hu X., Li Y., Wang L (2010), "Effect of tannin in Polygonum multiflorum on liver biochemical indexes of rats", Yaowu Pingjia Yanjiu, 33, pp 63-65 19 Huang J., Zhang J., Jun Q., Mei J., Zhang J., Huang Z (2018), "Chemical profiles and metabolite study of raw and processed Polygoni Multiflori Radix in rats by UPLC-LTQ-Orbitrap MS n spectrometry", Chinese journal of natural medicines, 16(5), pp 375-400 20 Jin S., Xiao H., Hui W., Fang H (2009), "HPLC/IT-MS Analysis of Glycosides in Radix Polygoni multiflori", Natural Product Research and Development, 21(5), pp 21 Li C., Niu M., Bai Z., Zhang C., Zhao Y., Li R., Tu C., Li H., Jing J., Meng Y (2017), "Screening for main components associated with the idiosyncratic hepatotoxicity of a tonic herb, Polygonum multiflorum", Frontiers of medicine, 11(2), pp 253-265 22 Li D., Chen J., Ge Z., Sun Z (2017), "Hepatotoxicity in rats induced by aqueous extract of Polygoni Multiflori Radix, root of Polygonum multiflorum related to the activity inhibition of CYP1A2 or CYP2E1", Evidence Based Complementary and Alternative Medicine, 2017, pp 23 Li S., Chen L., Huang X., Zhao B., Wang Y., Ye W (2013), "Five new stilbene glycosides from the roots of Polygonum multiflorum", Journal of Asian natural products research, 15(11), pp 1145-1151 24 Li X., Liu J., Liao S., Xu L., Wei X (2009), "Chemical constituents from tubers of Polygonum multiflorum Thunb", 熱帶亞熱帶植物學報, 17(6), pp 617-620 25 Li Y., Gong X., Liu M., Peng Ch., Li P., Wang Y (2017), "A new strategy for quality evaluation and identification of representative chemical components in Polygonum multiflorum Thunb", Evidence Based Complementary and Alternative Medicine, 2017, pp 26 Liang L., Xu J., Zhou W., Brand E., Chen H., Zhao Z (2018), "Integrating targeted and untargeted metabolomics to investigate the processing chemistry of Polygoni Multiflori Radix", Frontiers in pharmacology, 9, pp 934 27 Liang Z., Chen H., Yu Z., Zhao Z (2010), "Comparison of raw and processed Radix Polygoni Multiflori (Heshouwu) by high performance chromatography and mass spectrometry", Chinese medicine, 5(1), pp 29 liquid 28 Lin L., Lin H., Zhang M., Ni B., Yin X., Qu C., Ni J (2015), "A novel method to analyze hepatotoxic components in Polygonum multiflorum using ultraperformance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry", Journal of hazardous materials, 299, pp 249-259 29 Lin L., Ni B., Lin H., Zhang M., Li X., Yin X., Qu C., Ni J (2015), "Traditional usages, botany, phytochemistry, pharmacology and toxicology of Polygonum multiflorum Thunb.: a review", Journal of Ethnopharmacology, 159, pp 158-183 30 Liu Y., Wang Q., Yang J., Guo X., Liu W., Ma S., Li S (2018), "Polygonum multiflorum Thunb.: a review on chemical analysis, processing mechanism, quality evaluation, and hepatotoxicity", Frontiers in pharmacology, 9, pp 364 31 Liu Z., Chao Z., Liu Y., Song Z., Lu A (2009), "Maillard reaction involved in the steaming process of the root of Polygonum multiflorum", Planta medica, 75(01), pp 84-88 32 Liu Z.L., Song Z.Q., Zhang L., Li S.L (2005), "Influence of process methods on contents of chemical component Radix Polygoni Multiflori", China journal of Chinese materia medica, 30(5), pp 336-340 33 Ma J., Zheng L., He Y., Li H (2015), "Hepatotoxic assessment of Polygoni Multiflori Radix extract and toxicokinetic study of stilbene glucoside and anthraquinones in rats", Journal of ethnopharmacology, 162, pp 61-68 34 Nguyen Thi Ha Ly, Ta Thi Thao, Phuong Thien Thuong (2019), "Quality Evaluation of Fallopia multiflora in Vietnam Based on HPLC-FLD and Chemometrics", Journal of Medicinal Materials, Vol 24, No 3, pp 35 Nonaka G., Miwa N., Nishioka I (1982), "Stilbene glycoside gallates and proanthocyanidins from Polygonum multiflorum", Phytochemistry, 21(2), pp 429432 36 Qiong Y.U., Jiang L., Na L., Ya F., Jiang M.A., Ping L.I., Hui L.I (2017), "Enhanced absorption and inhibited metabolism of emodin by 2, 3, 5, 4′- tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucopyranoside: Possible mechanisms for Polygoni Multiflori Radix-induced liver injury", Chinese journal of natural medicines, 15(6), pp 451-457 37 Qiu X., Zhang J., Huang Z., Zhu D., Xu W (2013), "Profiling of phenolic constituents in Polygonum multiflorum Thunb by combination of ultra-highpressure liquid chromatography with linear ion trap-Orbitrap mass spectrometry", Journal of Chromatography A, 1292, pp 121-131 38 Sun G B., Guo B J., Li X E., Huang JN., Xue H B., Sun X B (2006), "The effect of anthraquinone glycoside from Polygonum multiflorum Thunb on cellular immunological function in mice", Pharmacol Clin Chin Mater Medica, 22, pp 302 39 Use The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human (2005), Validation of analytical procedures: text and methodology Q2 (R1), International conference on harmonization, Geneva, Switzerland,pp 6-13 40 Wang W., He Y., Lin P., Li Y., Sun R., Gu W., Yu J., Zhao R (2014), "In vitro effects of active components of Polygonum Multiflorum Radix on enzymes involved in the lipid metabolism", Journal of ethnopharmacology, 153(3), pp 763770 41 Wei Y., Liu M., Liu J., Li H (2019), "Influence Factors on the Hepatotoxicity of Polygoni Multiflori Radix", Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2019, pp 1-12 42 Wu X., Chen X., Huang Q., Fang D., Li G., Zhang G (2012), "Toxicity of raw and processed roots of Polygonum multiflorum", Fitoterapia, 83(3), pp 469-475 43 Xie F., Zhao R., Zhao S., Rao G (1994), "Comparison of active components in two processed products of Polygonum multiflorum", Chinese Traditional and Herbal Drugs, (07), pp 27-34 44 Yang Y.Z (1976), "The new ingredients of Polygonum multiflorum thunb: hydroxyl on stilbene glucoside Foreign Medical Reference", China journal of Chinese materia medica, 3, pp 247 45 Yin X., Gong X., Jiang R., Kuang G., Wang B., Zhang L., Xu G., Wan J (2014), "Emodin ameliorated lipopolysaccharide-induced fulminant hepatic failure by blockade of TLR4/MD2 complex expression in D-galactosamine-sensitized mice", International immunopharmacology, 23(1), pp 66-72 46 Zhang Y.Z., Miao M.S., Gu L.Y (2008), "Study on the immune function influence by polysaccharide from Polygonum multiflorum Peparata in mice", Traditional Chinese Medicinal Research, 21, pp 18-19 47 Bounda G., Feng Y.U (2015), "Review of clinical studies of Polygonum multiflorum Thunb and its isolated bioactive compounds", Pharmacognosy research, 7(3), pp 225 48 Ho T., Wu S., Chen J., Li C., Hsiang C (2007), "Emodin blocks the SARS coronavirus spike protein and angiotensin-converting enzyme interaction", Antiviral research, 74(2), pp 92-101 49 Li M., Du X.P., Ye H (2003), "Protective effect of Polygonum multiflorum thunb on the cerebral cholinergic neurofibers in rats", Bulletin of Hunan Medical University, 28(4), pp 361-364 50 Li R., Gao F., Yan S., Ou L., Li M., Chen L., Wei P., Gao Z (2020), "Effects of Different Processed Products of Polygonum multiflorum on the Liver", EvidenceBased Complementary and Alternative Medicine, 2020, pp 51 Luo D., Jia P., Zhao S., Zhao Y., Liu H., Wei F., Ma S (2019), "Identification and Differentiation of Polygonum multiflorum Radix and Polygoni multiflori Radix Preaparata through the Quantitative Analysis of Multicomponents by the SingleMarker Method", Journal of analytical methods in chemistry, 2019, pp 52 Lv Y., Wang J.B., Ji Y., Zhao Y.L., Ma Z.J., Li Q (2013), "Influence of extracting solvent on hepatocytes toxicity of Polygonum multiflorum", Chinese Journal of Natural Medicines, 19, pp 268-272 53 Ma J., Zheng L., Deng T., Li C., He Y., Li H., Li P (2013), "Stilbene glucoside inhibits the glucuronidation of emodin in rats through the down-regulation of UDP-glucuronosyltransferases 1A8: application to a drug–drug interaction study in Radix Polygoni Multiflori", Journal of ethnopharmacology, 147(2), pp 335-340 54 Tang J., Li W., Zhang F., Li Y., Cao Y., Zhao Y., Li X., Ma Z (2017), "Discrimination of Radix Polygoni Multiflori from different geographical areas by UPLC-QTOF/MS combined with chemometrics", Chinese medicine, 12(1), pp 34 55 Yu J., Xie J., Mao X., Wang M., Li N., Wang J., Zhaori Ge-tu, Zhao Rong-hua (2011), "Hepatoxicity of major constituents and extractions of radix polygoni multiflori and radix polygoni multiflori Ethnopharmacology, 137(3), pp 1291-1299 praeparata", Journal of PHỤ LỤC QUY TRÌNH CHẾ BIẾN HÀ THỦ Ơ ĐỎ SỐ Thành phần Cơng thức HTOĐ Tỷ lệ so với dƣợc liệu Lƣợng _ 200 g Dung môi ngâm 3:1 600 ml Dung môi nấu 8:1 1600 ml Vai trò Dược liệu chế biến Nước cất Chuẩn bị dƣợc liệu, phụ liệu, dung môi, dụng cụ thiết bị  Chuẩn bị HTOĐ: lấy mẫu HTOĐ theo phương pháp lấy mẫu dược liệu quy định Phụ lục 12.1, DĐVN V, trang 271  Phụ liệu: đạt tiêu chuẩn nhà sản xuất  Dụng cụ, thiết bị phải  Cân dược liệu, phụ liệu theo công thức  Rửa dược liệu: cho HTOĐ vào rá, sửa hai lần với nước cất Ngâm dƣợc liệu  Cho dược liệu để vào dụng cụ ngâm nhựa, ngâm dược liệu Tiến hành ngập 600 ml nước cất  Dược liệu sau ngâm vớt ra, rửa hai lần với nước cất Nấu dƣợc liệu Cho 1600 ml nước cất vào nồi chứa HTOĐ để Làm chín HTOĐ nhiệt độ sơi dịch nấu 90 phút Nấu đến gần cạn, cần đảo ln cho chín Sau nấu xong, dược liệu lấy rửa lại hai lần với nước cất, làm vụn nát Sấy  Tiến hành sấy HTOĐ sau nấu nhiệt độ 60oC 14 tủ sấy WiseVen Ovn - N105, đạt độ ẩm không 12% PHỤ LỤC SƠ ĐỒ QUY TRÌNH CHẾ BIẾN HÀ THỦ Ô ĐỎ SỐ Rễ hà thủ ô đỏ thái phiến (dày 1-3 mm, đường kính 3-5 mm) Rửa hai lần với nước cất Ngâm nước cất Vớt Rửa hai lần với nước cất Nấu với nước cất 90 phút Lấy Rửa hai lần với nước cất Sấy 60oC 14 Để nguội Hà thủ ô đỏ chế PHỤ LỤC DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CHO HÀ THỦ Ô ĐỎ CHẾ STT Chỉ tiêu Mô tả Phƣơng pháp thử Yêu cầu Tiến hành theo phương pháp mô tả Hà thủ ô đỏ chế dược liệu, phụ lục 12.2, DĐVNV phiến mỏng co lại không đều, dày 1-2 mm, dài 2-5 mm, cứng sừng, bề ngồi có màu nâu nâu thẫm đặc trưng hà thủ ô đỏ Vị ngọt, đắng, se chát Định tính a, Phản ứng hóa học (định tính nhóm a, Phản ứng hóa học anthranoid) (định tính nhóm Phản ứng A Lấy g bột dược liệu chế anthranoid) cho vào ống nghiệm, ngâm với 10 ml Phản ứng A Xuất nước 30 phút, gạn lấy ml, màu đỏ sẫm thêm giọt đến giọt dung dịch natri Phản hydroxyd (TT) Phản ứng B Lấy 0,1 g bột dược liệu chế, thêm 10 ml dung dịch natri hydroxyd 10 % (TT) đun cách thủy phút, để nguội, lọc Acid hóa dịch lọc dung dịch acid hydrocloric 10 % (TT) đến môi trường acid (thử giấy quỳ), sau lắc với 20 ml ether ethylic (TT), gạn lấy ứng B: Lớp amoniac có màu đỏ ml ether, thêm ml amoniac đậm đặc (TT) b, Phương pháp sắc ký lỏng hiệu Sắc kỳ đồ dịch chiết hà thủ ô đỏ chế cao Điều kiện sắc ký:  Hệ thống máy HPLC - DAD  Cột silica gel pha đảo Eclipse XDB - C18 (4,6 x 250mm, 5µm)  Pha động: hỗn hợp ACN : H2O theo chương trình gradient H2O : ACN (0-10 phút: 80 : 20; 10 - 15 phút: (80 : 20) - (30 : 70); 15 - 20 phút: 30 : 70; 20 - 25 phút: (30 : 70) - (0 : 100); 25 - 35 phút: : 100; 35 - 40 phút: (0 : 100) - (80 : có pic có thời gian lưu tương ứng với pic THSG pic EM mẫu chuẩn, hình dạng pic phải cân đối, độ phân giải (Rs) tốt (Rs ≥ 1), độ đối xứng (As) tốt (0,9 < As < 1,2), pic phải tinh khiết phổ UV VIS 20); 40 - 45 phút: 80 : 20; 45 phút: Stop  Thể tích tiêm mẫu: 10 µl  Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút  Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng (≈ 27oC)  Thời gian sắc ký: 45 phút Bước sóng phát hiện: 290 nm EM 322 nm THSG Độ ẩm Tiến hành theo DĐVN V, phụ lục 9.6; Không 12 % 1g, 105 oC, 5h Chất chiết Tiến hành theo phương pháp chiết Không thấp 10% lạnh (DĐVN V, Phụ lục 12.10), dùng dược liệu chế Định lượng ethanol 30% (TT) làm dung môi Định lượng THSG EM Yêu cầu: hà thủ ô đỏ phương pháp HPLC chế phải có hàm lượng Điều kiện sắc ký: phần định THSG tính thấp 0,2% hàm không lượng EM không thấp 0,007%, tính theo dược liệu khơ kiệt; hàm lượng THSG giảm 50%, hàm lượng EM tăng 5%, tỷ lệ EM : THSG tăng 2,5 lần so với trước chế biến ... hà thủ ô đỏ chế biến từ lơ khác theo quy trình chế biến xây dựng được, thử nghiệm lặp lại lần điều kiện, từ kết đưa tiêu cho tiêu chuẩn hà thủ ô đỏ chế Tiêu chuẩn sở hà thủ ô đỏ chế bao gồm tiêu. .. Về xây dựng quy trình định lượng đồng thời THSG EM 71 4.2 Về xây dựng quy trình chế biến hà thủ ô đỏ 72 4.3 Về xây dựng tiêu chuẩn sở cho hà thủ ô đỏ sau chế biến 76 KẾT LUẬN VÀ... Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn sở cho hà thủ đỏ sau chế biến Tiêu chuẩn sở cho hà thủ ô đỏ sau chế biến xây dựng dựa quy định DĐVN V [1]:  Lấy mẫu dược liệu (Phụ lục 12. 1)  Những quy định chung