ĐỊNH LƯỢNG VÀ PHÂN LẬP HAI ALKALOID CHÍNH TỪ VỊ THUỐC CỔ TRUYỀN VIỆT NAM EVODIAE FRUCTUS (NGÔ THÙ DU)Evodiae fructus (Wuzhuyu, ngô thù du) là quả khô, chưa chín của cây Ngô thù du, họ Cà phê (Evodia rutaecarpa, Rutaceae).YHCT: trị các rối loạn dạ dày ruột và chứng xuất huyết, mất kinh sau sinh.3 thành phần chính: limonin, evodiamin, và rutaecarpin được chứng minh có nhiều tác dụng như kháng viêm, kháng tiểu đường, cao huyết áp, trợ tim, kích thích trung ương, giãn mạch, chống đông máu và co thắt phế quản.Dược điển Trung Quốc kiểm định 2 alkaloid chính là evodiamin và rutaecarpin bằng nhiều kỹ thuật phân tích, trong đó có sắc ký lỏng ghép khối phổ kép (LCMSMS).Việc áp dụng kỹ thuật này bị hạn chế do yêu cầu thiết bị tốn kém.Hóa chấtAcetonitril và methanol HPLC (Merck)Limonin (98.47%), evodiamin (99%), và rutaecarpin (99%), (SigmaAldrich, USA).Nguyên liệu40 mẫu quả Ngô thù du được thu mua từ nhiều vùng ở Việt Nam.Được định danh tại BM. Thực vật dược, Khoa Dược, trường ĐH YD Cần ThơĐược bảo quản tại PTN Quản lý Dược và Độc chất trong gói kín và tránh tiếp xúc với hơi ẩm, ánh sángTinh chếPhân đoạn tinh khiết 1 được tinh chế bằng cách rửa với nhexan lạnhPhân đoạn tinh khiết 2 được tinh chế bằng kết tinh trong chloroformKiểm định tinh khiếtKiểm định sơ bộ sự tinh khiết của hợp chất qua SKLM mới nhiều hệ pha động khác nhau.Kiểm định tinh khiết với HPLC
ĐỊNH LƯỢNG VÀ PHÂN LẬP HAI ALKALOID CHÍNH TỪ VỊ THUỐC CỔ TRUYỀN VIỆT NAM EVODIAE FRUCTUS (NGÔ THÙ DU) Bài viết: Quantitative determination and preparative isolation of two major alkaloids from the vietnamese medicinal herb evodiae fructus Tác giả: N Van T Nguyen, X Dao T Nguyen, K Ngan H Nguyen, T Kien Nguyen, M Phuong Nguyen Ấn bản: International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Vol 11, Issue 11, 2019 1 Đặt vấn đề Đặt vấn đề Tầm quan trọng Ngơ thù du • Evodiae fructus (Wuzhuyu, ngô thù du) khô, chưa chín Ngơ thù du, họ Cà phê (Evodia rutaecarpa, Rutaceae) • YHCT: trị rối loạn dày ruột chứng xuất huyết, kinh sau sinh • thành phần chính: limonin, evodiamin, rutaecarpin chứng minh có nhiều tác dụng kháng viêm, kháng tiểu đường, cao huyết áp, trợ tim, kích thích trung ương, giãn mạch, chống đông máu co thắt phế quản Đặt vấn đề Vấn đề nghiên cứu • Dược điển Trung Quốc kiểm định alkaloid evodiamin rutaecarpin nhiều kỹ thuật phân tích, có sắc ký lỏng ghép khối phổ kép (LC/MS/MS) • Việc áp dụng kỹ thuật bị hạn chế yêu cầu thiết bị tốn Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nhằm phát triển phương pháp phân tích đơn giản, nhanh nhạy để định lượng thành phần sinh học quan trọng Ngô thù du (Evodiae fructus), gồm limonin, evodiamin, rutaecarpin, để đánh giá chất lượng Ngô thù du bán thị trường Phương pháp nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu 2.1 Hóa chất nguyên liệu Hóa chất Acetonitril methanol HPLC (Merck) Limonin (98.47%), evodiamin (99%), rutaecarpin (99%), (Sigma-Aldrich, USA) Nguyên liệu 40 mẫu Ngô thù du thu mua từ nhiều vùng Việt Nam Được định danh BM Thực vật dược, Khoa Dược, trường ĐH YD Cần Thơ Được bảo quản PTN Quản lý Dược Độc chất gói kín tránh tiếp xúc với ẩm, ánh sáng Phương pháp nghiên cứu 2.2 Chuẩn bị mẫu thử 0,1 g bột dược liệu mịn (0,3 mm) + 40 ml ethanol 80% (v/v) * lần Chiết siêu âm 20 phút Dịch chiết ethanol 80% Cô thu hồi dm áp suất giảm Cắn ethanol 80% Phân tán 20 ml dichloromethan Rửa lần với 10 ml nước (chiết phân bố) Dịch chiết dicloromethan Cô thu hồi dm áp suất giảm Cắn dichromethan Hòa tan vào 10 ml pha động Dung dịch mẫu thử Phương pháp nghiên cứu 2.3 Thiết bị điều kiện sắc ký Hệ Hitachi HPLC L-2000 (Hitachi, NB) Bơm L-2130, Bơm tiêm mẫu L-2200, Hệ thống kiểm sốt nhiệt độ L-2300 Đầu dị dãy diod L-2455 Phương pháp nghiên cứu 2.3 Thiết bị điều kiện sắc ký Điều kiện sắc ký: Cột sắc ký Germini C18 (150 mm × 4.6 mm I.D., µm), Bước sóng phát hiện: 210 nm Pha động gồm acetonitril (A), methanol (B), nước (C) Chương trình rửa giải gradient: (1) 0-18 min, gradient tuyến tính 40% A 5% B lưu lượng ml/min; (2) 18-30 min, gradient tuyến tính 100% A lưu lượng 1.2 ml/min Thể tích tiêm mẫu: 10 µl 10 Phương pháp nghiên cứu 2.4 Thẩm định quy trình kiểm nghiệm Đối tượng thẩm định: Quy trình định lượng đồng thời limonin, evodiamin, rutaecarpin HPLC\DAD Quy trình: theo hướng dẫn Hội nghị Quốc tế cân đối yêu cầu kỹ thuật việc đăng kí dược phẩm dùng cho người International Conference on Harmonization of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH, 2005) Các tiêu chí cần thẩm định: khả tương thích hệ thống, tính chọn lọc, tính tuyến tính, giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ xác độ 11 Phương pháp nghiên cứu 2.5 Phân lập alkaloid Chuẩn bị mẫu thơ Chọn mẫu Ngơ thù du cho hàm lượng alkaloid toàn phần lớn để chiết xuất phân lập Phân đoạn DCM (CH2Cl2) từ cao tổng ethanol 80% tách phân đoạn sắc ký cột hở với hệ dung môi rửa giải gồm n-hexan ethyl acetat Các phân đoạn phân biệt dựa vào hình ảnh sắc ký lớp mỏng 12 Phương pháp nghiên cứu 2.5 Phân lập alkaloid Tinh chế Phân đoạn tinh khiết tinh chế cách rửa với n-hexan lạnh Phân đoạn tinh khiết tinh chế kết tinh chloroform Kiểm định tinh khiết Kiểm định sơ tinh khiết hợp chất qua SKLM nhiều hệ pha động khác Kiểm định tinh khiết với HPLC 13 Phương pháp nghiên cứu 2.5 Phân lập alkaloid Định danh, xác định cấu trúc Các hợp chất, tinh khiết ≥ 98,5%, xác định cấu trúc qua liệu 1H NMR, 13C NMR (phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H 13C) ESI-MS (khối phổ ion hóa phun điện tử) Dữ liệu đối sánh với phổ đối chiếu từ tài liệu tham khảo để định danh chất 14 Kết bàn luận Xem viết 15 ... phương pháp phân tích đơn giản, nhanh nhạy để định lượng thành phần sinh học quan trọng Ngô thù du (Evodiae fructus) , gồm limonin, evodiamin, rutaecarpin, để đánh giá chất lượng Ngô thù du bán... alkaloid Chuẩn bị mẫu thô Chọn mẫu Ngô thù du cho hàm lượng alkaloid toàn phần lớn để chiết xuất phân lập Phân đoạn DCM (CH2Cl2) từ cao tổng ethanol 80% tách phân đoạn sắc ký cột hở với hệ dung... ethyl acetat Các phân đoạn phân biệt dựa vào hình ảnh sắc ký lớp mỏng 12 Phương pháp nghiên cứu 2.5 Phân lập alkaloid Tinh chế Phân đoạn tinh khiết tinh chế cách rửa với n-hexan lạnh Phân đoạn tinh