Cố định enzyme - anylase bằng gel alginate

Cố định enzyme - anylase bằng gel alginate

1 Phần 1. LỜI NÓI ĐẦU Enzyme là một chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghóa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của mọi sinh vật mà nó còn đóng vai trò rất quan trọng trong công nghệ chế biến thức phẩm, trong y học, trong kỹ nghệ phân tích, trong công nghệ gen và trong bảo vệ môi trường. Ngày nay, những nghiên cứu về ứng dụng enzyme trong sản xuất công nghiệp phát triển rất mạnh. Các hướng nghiên cứu nhằm mục đích tăng khả năng sử dụng enzyme, kéo dài thời gian, số lần sử dụng enzyme giảm giá thành sử dụng enzyme. Một trong những bước tiến quan trọng nhất hiện nay là kỹ thuật cố đònh enzyme trên giá thể tạo ra các dạng enzyme cố đònh (enzyme không hòa tan). Enzyme cố đònh ở các nước phát triển đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều qui trình công nghệ như: chế biến thực phẩm, y sinh học và nghiên cứu khoa học. Tuy nhiên hiện nay việc nghiên cứu và ứng dụng enzyme cố đònh ở Việt Nam chưa được phổ biến lắm và vẫn còn là hướng phát triển mới mẻ. Để góp phần vào những nghiên cứu về enzyme cố đònh đồng thời được sự chấp thuận của bộ môn công nghệ sinh học trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh và bộ môn công nghệ sinh học trường Đại Học Bách Khoa Tp. Hồ Chí Minh, dưới sự hướng dẫn của Th.S Huỳnh Ngọc Oanh, tôi thực hiện đề tài “Cố đònh enzyme – amylase bằng gel alginate” tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học thuộc trường Đại Học Bách Khoa Tp. Hồ Chí Minh. 2 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. NHỮNG KHÁI NIỆM CHUNG VỀ ENZYME [2 ] 2.1.1 Khái niệm về enzyme Trong các phản ứng hóa học nếu ta cho thêm vào phản ứng một chất nào đó phản ứng sẽ xảy ra với tốc độ tăng hàng chục lần. Chất cho thêm vào này gọi là chất xúc tác. Chất xúc tác có hai đặc điểm quan trọng  Làm tăng phản ứng hóa học.  Bản thân chất xúc tác không có sự thay đổi nào sau phản ứng. Chất xúc tác hóa học chỉ làm thay đổi tốc độ phản ứng, chứ không tham gia làm thay đổi chiều hướng phản ứng, trạng thái phản ứng hay năng lượng sử dụng trong phản ứng. Trong các phản ứng sinh học xảy ra trong cơ thể sinh vật cũng có các chất làm tăng phản ứng. Chất đó dược gọi là enzyme. Enzyme được các cơ thể sinh vật tổng hợp nên và tham gia vào các phản ứng hóa học trong cơ thể. Enzyme là một chất hữu cơ, trong khi các chất xúc tác hóa học thường là chất vô cơ. Sau này các nhà khoa học xác đònh bản chất của enzyme là protein. Như vậy enzyme là một protein có khả năng tham gia xúc tác các phản ứng hóa học trong và ngoài cơ thể. Điểm rất khác biệt của enzyme là chúng hoạt động trong điều kiện nhiệt độ ôn hòa giống như nhiệt độ ôn hòa trong cơ thể sinh vật. Trong khi đó, các chất hóa học cần phải có nhiệt độ cần thiết cho phản ứng. Những ưu điểm cơ bản của enzyme có thể tóm tắt như sau : 3 1. Enzyme có thể tham gia hàng loạt các phản ứng trong chuỗi phản ứng sinh hóa để giải phóng hoàn toàn năng lượng hóa học có trong vật chất. 2. Enzyme có thể tham gia những phản ứng độc lập nhờ khả năng chuyển hóa rất cao. 3. Enzyme có thể tạo ra những phản ứng dây chuyền. Khi đó sản phẩm của phản ứng đầu sẽ là nguyên liệu hay cơ chất cho những phản ứng tiếp theo. 4. Trong các phản ứng enzyme, sự tiêu hao năng lượng thường rất ít. 5. Enzyme luôn luôn được tổng hợp trong tế bào của sinh vật. 6. Có nhiều enzyme không bò mất đi sau phản ứng. Ngày nay, các nhà khoa học đã tìm ra hơn 1000 loại enzyme khác nhau có trong tế bào sinh vật, số lượng này là rất nhỏ so với số lượng thật có trong mỗi tế bào. Dò hóa ngoài tế bào Vật chất có kích thước nhỏ Tế bào Vật chất dò hóa ra khỏi tế bào Vật chất tổng hợp ra khỏi tế bào Môi trường Sinh khối (sản phẩm bậc 1) Sản phẩm bậc 2 Hình 2.1 : Hệ thống tổng hợp enzyme trong tế bào sinh vật Enzym ngoại bào Vật chất có kích thước lớn Enzym Dò hóa nội bào trong tế Quá trình bào tổng hợp 4 2.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme a. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính enzyme Cơ chế tác động của enzyme vào cơ chất qua ba giai đoạn Giai đoạn 1 : Enzyme tương tác với cơ chất tạo thành phức enzyme cơ chất E S. Giai đoạn 2 : Phức enzyme cơ chất sẽ được tách ra. Giai đoạn 3 : Enzyme sẽ được giải phóng, cơ chất sẽ chuyển thành sản phẩm. Như vậy ở giai đoạn đầu, nếu cơ chất có nồng độ thấp thì tốc độ phản ứng enzyme sẽ phụ thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất. Hình 2.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến tốc độ phản ứng của enzyme Vận tốc phản ứng được tính như sau : SKSVVmmax Phương trình trên gọi là phương trình Michealis Menten Trong giai đoạn đầu khi nồng độ cơ chất tăng, tốc độ phản ứng sẽ tăng. Nhưng khi tốc đố phản ứng đạt giá trò cực đại, cho dù có tăng nồng độ cơ chất, tốc độ phản ứng cũng sẽ hoàn toàn không có khả năng tăng theo. Nồng độ cơ chất Tốc độ phản ứng Km 5 b. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme Trong các phản ứng hóa học, nhiệt độ càng tăng, tốc độ phản ứng xúc tác càng tăng. Trong các phản ứng sinh học, nhiệt độ tăng khả năng xúc tác của enzyme sẽ tăng. Nhưng khả năng tăng của tốc độ phản ứng có một giới hạn nhất đònh. Quá giới hạn nhiệt độ đó, phản ứng enzyme sẽ giảm và giảm rất nhanh. Hình 2.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng của enzyme Hiện tượng đặc biệt này ở enzyme có liên quan đến bản chất hóa học của enzyme. Các enzyme là những protein thường không bền nhiệt. Trường hợp ta tăng nhiệt độ trong giai đoạn đầu của phản ứng enzyme sẽ làm tăng khả năng tạo cấu trúc không gian của enzyme cho phù hợp với cấu trúc không gian của cơ chất. Khi vượt quá giới hạn về nhiệt độ, cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động của enzyme không còn phù hợp với cấu trúc không gian của cơ chất nữa, khi đó hoạt tính enzyme sẽ mất dần và đi đến chỗ triệt tiêu. c. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme Trong những nghiên cứu thí nghiệm về ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme, các nhà khoa học cho thấy hiện tượng : nếu tăng hoặc giảm giá trò pH tới một điểm xác đònh nào đó, vận tốc phản ứng enzyme sẽ tăng dần và đạt tới điểm cực đại giá trò pH, mà ở đó vận tốc phản ứng enzyme đạt giá trò cực đại gọi là pH tối ưu cho hoạt động của enzyme. Vượt quá giá trò pH này hoạt động enzyme sẽ giảm. Nhiệt độ Tốc độ phản ứng 6 Hình 2.4: Ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme Mỗi loại enzyme sẽ có khoảng pH tối ưu và điểm pH tối ưu. pH có ảnh hưởng rất lớn đến trạng thái ion hóa của các nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme, trạng thái ion hóa của cơ chất và phức chất ES. d. Ảnh hưởng của các chất kìm hãm các hoạt tính enzyme Hoạt tính của enzyme có thể bò ảnh hưởng bởi những chất kìm hãm. Những chất kìm hãm là những chất hoa học có khả năng làm giảm hoạt tính hoặc làm ngưng hoạt tính của enzyme. Các chất kìm hãm thường là những ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ và cả protein. Các chất chia ra làm 2 loại : Chất kìm hãm cạnh tranh. Chất kìm hãm không cạnh tranh. Chất kìm hãm cạnh tranh : Các chất kìm hãm cạnh tranh có cấu trúc không gian tương tự cấu trúc không gian của cơ chất. Do đó, chúng có khả năng kết hợp với enzym, kết quả là enzym không thể kết hợp được với cơ chất để tạo thành phức chất ES. pH Vận tốc phản ứng pH op 7 Hình 2.5 : Ảnh hưởng của chất kìm hãm cạnh tranh đến hoạt tính enzyme Chất kìm hãm không cạnh tranh : Các chất kìm hãm không cạnh tranh tham gia kết hợp với enzym không phải ở trung tâm hoạt động của enzym mà là ở một vò trí ngoài trung tâm hoạt động của enzym. Người ta còn gọi vò trí này là trung tâm kìm hãm của enzym. Khi chất kìm hãm kết hợp với enzym ở ngoài trung tâm hoạt động của enzym sẽ làm thay đổi cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động của enzym. Nhờ vậy, chúng sẽ làm giảm tốc độ phản ứng của enzym. Trong rất nhiều trường hợp, sản phẩm cuối của chuỗi phản ứng hay của một phản ứng thường là chất kìm hãm không cạnh tranh. Hình 2.6 : Ảnh hưởng của chất kìm hãm không cạnh tranh đến hoạt tính enzyme 8 e. Ảnh hưởng của chất hoạt hóa đến hoạt tính của enzym Các chất hoạt hóa (activator) là những chất làm tăng khả năng xúc tác của enzym. Các chất hoạt hóa có bản chất hóa học khác nhau. Các amin, các chất hữu cơ có cấu trúc hóa học khác nhau. Khả năng làm tăng hoạt tính của enzym của những chất hoạt hóa cũng có một giới hạn nhất đònh, vượt quá giới hạn này rất có thể lại làm giảm hoạt tính của enzym. 2.2. NHỮNG KHÁI NIỆM CHUNG VỀ ENZYM CỐ ĐỊNH 2.2.1. Khái niệm, đặc điểm của enzym cố đònh a. Khái niệm enzym cố đònh Enzym cố đònh (immobilised enzym) hay enzym không hòa tan (insolube enzym) được hiểu theo cả nghóa hẹp và nghóa rộng. Theo nghóa hẹp : được hiểu theo Michael Trevan: thuật ngữ enzyme cố đònh là những enzyme được đưa vào những pha riêng rẽ, pha này được tách riêng với pha dung dòch tự do. Pha enzyme thường không tan trong nước và được gắn với những polymer ưa nước có trọng lượng phân tử lớn. Pha enzyme // Pha dung dòch tự do Hình 2.7 : Mô hình hệ thống hai pha của enzym cố đònh Theo nghóa rộng : Theo Kkaus Mosbach : Các chất xúc tác cố đònh là các enzyme, tế bào, cơ thể sống ở trạng thái cho phép sử dụng lại. Như vậy theo nghóa rộng, enzyme không hòa tan bao gồm cả enzyme đã được cố đònh và một 9 chất mang, bao gồm cả enzyme có trong tế bào sống được cố đònh trong các bình phản ứng sinh học có sự gắn kết vào một chất mang cho phép ta sử dụng nhiều lần. Enzyme cố đònh thường là những enzyme hòa tan được gắn vào một chất mang bằng nhiều kỹ thuật khác nhau. Nhờ quá trình gắn này enzyme chuyển từ trạng thái hòa tan sang trạng thái không hòa tan. b. Đặc điểm của enzyme cố đònh Nhờ những tính chất ưu việt do đó ngày nay enzyme cố đònh đang ngày càng sử dụng rộng rãi trong các lónh vực công nghệ : Những ưu điểm nổi bật của enzyme cố đònh. Enzyme là những chế phẩm sinh học đắt tiền, nếu sử dụng ở dạng hòa tan thì chỉ sử dụng được một lần và khó thu hồi trở lại. Ngược lại khi enzyme được cố đònh trên giá thể polymer nên có thể sử dụng liên tục trong nhiều ngày, thậm chí hàng tháng mà không mất hoặc chỉ giảm hoạt tính, vì vậy rất kinh tế. Do được cố đònh ở một pha riêng, do đó dễ dàng tách sản phẩm ra khỏi enzyme, vì vậy sản phẩm dễ tinh sạch hơn do không trộn lẫn với enzyme. Điều này đặc biệt có ý nghóa khi ứng dụng enzyme cố đònh trong dược học, trong công nghệ sản xuất hóa chất và trong phân tích. Có thể dừng hóa trình chuyển hóa ở bất kỳ giai đoạn nào cần thiết khi dễ dàng tách enzyme cố đònh ra khỏi cơ chất trong trường hợp yêu cầu sản phẩm chỉ là các sản phẩm trung gian của quá trình chuyển hóa. – Khi được cố đònh trên giá thể enzyme có khả năng bền vững hơn, hoạt tính ổn đònh hơn khi có những thay đổi của môi trường như nhiệt độ, pH,… so với enzyme tự do. Nhờ được cố đònh trên giá thể nên enzyme ít bò biến tính hơn khi môi trường thay đổi. Sử dụng chế phẩm enzyme cố đònh, đặc biệt thích hợp với các qui trình công nghệ liên tục, tự động hóa ngày nay. Thường thì enzyme cố đònh được nhồi 10 vào các cột, tháp, fermentor, với dòng cơ chất liên tục được chảy vào và đầu ra là sản phẩm. Tuy nhiên enzyme cố đònh cũng có những nhược điểm nhất đònh là vì được cố đònh nên đã hạn chế khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất. Vì vậy hoạt tính riêng (specific activity) của enzyme cố đònh thường thấp hơn so với enzyme tự do, đặc biệt là trong trường hợp cơ chất là các chất có trọng lượng phân tử lớn như : protein, tinh bột, chitosan. Trong trường hợp enzyme được cố đònh bằng phương pháp nhốt (entrapment method) trong khuôn gel thì chỉ một phần enzyme nằm ở lớp vỏ ngoài của gel là hoạt động. Đặc biệt khi enzyme được cố đònh bằng phương pháp cộng hóa trò thì một lượng đáng kể enzyme bò mất hoạt tính do chất hoạt hóa và có thể do liên kết không đặc hiệu xảy ra ở trung tâm hoạt động của enzyme. 2.2.2. Chất mang dùng để cố đònh enzyme  Theo Michael Trevan, một chất mang lý tưởng cần có những tính chất sau đây : + Chất mang lý tưởng trong sử dụng cố đònh enzyme điều trước hết là cần phải rẻ. Điều này liên quan đến hiệu quả kinh tế của qui trình công nghệ. + Chất mang phải có tính chất cơ lý bền vững, ổn đònh. + Về mặt hóa học, chất mang phải bền vững, không tan trong môi trường phản ứng. Chất mang không được làm mất hoạt tính enzyme. + Chất mang phải có tính kháng khuẩn cao, bền vững với sự tấn công của vi sinh vật. + Chất mang phải có độ trương tốt, có diện tích bề mặt tiếp xúc lớn. Tính chất này của chất mang vừa tăng khả năng cố đònh enzyme vừa tăng khả năng tiếp xúc của cơ chất với enzyme, nhờ đó làm tăng hoạt tính enzyme cố đònh và số lần tái sử dụng. [...]... này cho phép giữ enzyme trong dung dòch gần giống với tự nhiên và sử dụng enzyme nhiều lần Enzyme + alginate CaCl2 Hạt Calcium alginate với enzyme cố đònh 19 Phương trình phản ứng : 2 Na( A lg inate) Ca Ca( A lg inate) 2 2 Na  Đặc điểm của gel alginate Gel alginate có khả năng nhốt một lượng lớn tế bào và enzyme, hiệu suất nhốt enzyme cao, thao tác và kỹ thuật tiến hành đơn giản Hạt gel có kích thước... thích hợp để tách enzyme không được gắn” lên vật liệu cố đònh, mà không gây ảnh hưởng xấu đến enzyme được gắn Khi lựa chọn hệ cố đònh cần để ý đến phản ứng cụ thể và thật vô nghóa nếu đưa enzyme vào vật liệu cố đònh mà bản chất vật liệu cố đònh là polymer bò phân giải bởi enzyme này xúc tác hoặc đặc biệt nếu enzyme bò ức chế bởi sản phẩm của phản ứng tạo ra 2.3 ỨNG DỤNG CỦA ENZYME CỐ ĐỊNH [3] 2.3.1 Trong... trung tâm hoạt động của enzyme Trên đây là một số phương pháp cố đònh enzyme, sự lựa chon đúng phương pháp thích hợp cho từng enzyme và vật liệu cố đònh chuyên biệt là một yếu tố tối quan trọng để thu được chế phẩm enzyme cố đònh có hoạt tính cao Đồng thời cần xác đònh các điều kiện hoạt động thích hợp cho enzyme cố đònh Vì vậy để cho quá trình cố đònh có kết quả nên lưu ý : Enzyme phải ổn đònh trong... chặt chẽ với vật liệu cố đònh bằng liên kết cộng hóa trò, nên enzyme không bò ly giải trong suốt quá trình sử dụng Enzyme dễ dàng tiếp xúc cơ chất do enzyme được gắn trên bề mặt vật liệu cố đònh Enzyme có khả năng ổn đònh với sự thay đổi nhiệt độ 21  Nhược điểm Enzyme có thể bò mất hoạt tính vì cấu trúc của enzyme bò thay đổi do quá trình liên kết Giảm khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất do đó... và cơ chất do đó làm giảm hoạt tính enzyme cố đònh Vật liệu cố đònh không tái sử dụng được, phương pháp này áp dụng cho các enzyme ổn đònh hoạt tính khi cố đònh  Enzyme cố đònh có thể tạo ra bằng hai cách – Nối đồng hóa trò liên kết các phân tử enzyme riêng biệt lại thành một liên hợp cao phân tử không hòa tan Đây là phương pháp không sử dụng chất mang Các phân tử enzyme sẽ liên kết với nhau qua các... enzyme với vật liệu cố đònh không hòa tan bằng liên kết cộng hóa trò Điều chế các enzyme cố đònh loại 1, khi dùng các tác nhân lưỡng chức như bisdiazobenzidin, bisdiazobenzidin, 2,2’ disulfur acid và một số hợp chất khác Đặc biệt người ta thường dùng glutaraldehyte làm tác nhân để đính các phân tử enzyme lại với nhau Các enzyme cố đònh loại 2 thường được điều chế phổ biến hơn Chất mang để cố đònh enzyme. .. năng khâu mạch của gel trong dung dòch khâu mạch glutaraldehyde khi được khâu mạch hạt gel không tan và ổn đònh cao 18  Giới thiệu về gel alginate thương phẩm Là loại vật liệu thích hợp nhốt enzyme Phương pháp tạo hạt rất đơn giản Hỗn hợp enzyme và alginate được nhỏ xuống dung dòch CaCl2 để tạo hạt gel bao bọc lấy enzyme Sản phẩm khi hòa tan hoàn toàn trong nước sẽ tạo thành dạng gel liên kết thành... năng cố đònh bằng phương pháp cộng hóa trò cao Những ứng dụng của vật liệu này vô cùng phong phú 2.2.3 Các phương pháp cố đònh enzyme Hiện nay có 4 phương pháp chính điều chế enzyme cố đònh dựa trên cơ sở lý hóa học như sau : – Phương pháp hấp thụ vật lý enzyme lên các vật liệu cố đònh không hòa tan có mang hoặc không mang điện tích – Phương pháp nhốt enzyme ở bên trong polymer tạo thành xung quanh enzyme. .. glucoamylase cố đònh Hãng Corning Glass đã sử dụng glucoamylase cố đònh để sản xuất 450 kg glucose/ngày Chế phẩm glucoamylase cố đònh được thu nhận bằng cách gắn enzyme trên silicagel, nhốt trong sợi triacetate cellulose hấp thụ trên DEAE Cellulose 30 Ngoài ra, hiện nay vô số enzyme đắt tiền khác đang được tiến hành cố đònh và nghiên cứu sử dụng ở qui mô công nghiệp 2.3.2 Trong y học Enzyme cố đònh được... trình cố đònh enzyme có thể xảy ra qua một giai đoạn nếu vật liệu cố đònh cố đònh có chứa các nhóm có khả năng tham gia tương tác trực tiếp với nhóm amin của enzyme Trường hợp ngược lại quá trình xảy ra qua 2 giai đoạn :  Giai đoạn hoạt hóa vật liệu cố đònh bằng cách đưa vào các nhóm chức năng có khả năng phản ứng hơn  Giai đoạn hai giai đoạn kết hợp enzyme Trường hợp không cần hoạt hóa vật liệu cố . phép giữ enzyme trong dung dòch gần giống với tự nhiên và sử dụng enzyme nhiều lần. Enzyme + alginate CaCl2 Hạt Calcium alginate với enzyme cố đònh. gel alginate Gel alginate có khả năng nhốt một lượng lớn tế bào và enzyme, hiệu suất nhốt enzyme cao, thao tác và kỹ thuật tiến hành đơn giản. Hạt gel