Phản ứng sinh hóa kiểm nghiệm vi sinh vật

Các th nghi m sinh hóaử ệ Các th nghi m sinh hóaử ệ GV: Nguy n Văn H nhễ ạ Ch ng 4ươ  Phân l p khu n l c thu n khi t là c n ậ ẩ ạ ầ ế ầ thi t cho đ nh danh VSVế ị  Vi c đ nh danh d a ch y u vào đ c ệ ị ự ủ ế ặ đi m ki u hình đ c bi t là các ph n ng ể ể ặ ệ ả ứ sinh hóa.  Có 3 cách s d ng các th nghi m sinh ử ụ ử ệ hóa đ đ nh danh VSV:ể ị ◦ Cách truy n th ngề ố ◦ S d ng các b KITử ụ ộ ◦ S d ng các thi t b t đ ngử ụ ế ị ự ộ Th nghi m kh năng lên menử ệ ả Th nghi m kh năng lên menử ệ ả  Mục đích: thử nghiệm khả năng sữ dụng các nguồn CH của các VSV  Nguyên tắc: VSV sử dụng CH  tao acid  giảm pH môi trường  Các loại carbonhydrate ◦ Monocarbonhydrate: glucose, xylose, rhamnose … ◦ Dicarbonhydrate: sucrose, lactose … ◦ Polycarbonhydrate: tinh bột, cellulose ◦ Các loại đường khử: đường mono chứa chức –CHO ◦ Các loại đường rượu: chứa chức -OH Phenol Red Carbohydrate Broth Phenol Red Carbohydrate Broth H p 115ấ ở o C trong 15 phút Trang 104 Th nghi m kh năng lên menử ệ ả Th nghi m kh năng lên menử ệ ả  Môi trường: Phenolred broth base bổ sung 0,5-1% đường cần thử nghiệm  VSV sử dụng được nguồn đường trong môi trường sẽ làm giảm pH  thay đổi màu chất chỉ thị phenolred  Phản ứng (+): môi trường chuyển vàng  Phản ứng (-): môi trường có màu đỏ Th nghi m Citrateử ệ Th nghi m Citrateử ệ  Mục đích: Xác định khả năng vi sinh vật sử dụng nguồn citrat như là nguồn cacbon duy nhất.  Cở sở sinh hóa: ◦ VSV sử dụng citrate, sinh ra CO 2 làm kiềm hóa MT ◦ VSV sử dụng muối ammonium là nguồn đạm duy nhất tạo ra NH 3 làm kiềm hóa MT Th nghi m Citrateử ệ Th nghi m Citrateử ệ Môi trường Simmon citrate agar (tr. 105) Ammonium dihydrogen phosphate1.0g Dipotassium hydrogen phosphate 1.0g NaCl 5g Sodium citrate 2g MgSO 4 0,2g Bromothymol blue 0,08g Agar 13g Th nghi m Citrateử ệ Th nghi m Citrateử ệ  Chú ý - Cấy lượng sinh khối vừa đủ - Có đối chứng trắng đi kèm Đ i ch ng tr ngố ứ ắ P âm tínhứ P d ng tínhứ ươ Th nghi m Ureaseử ệ Th nghi m Ureaseử ệ  Mục đích: phát hiện VSV có mang enzym urease  Cơ sở sinh hoá: (NH 2 ) 2 CO + H 2 O  2 NH 3 + CO 2  tăng pH môi trường  đỏ phenol (vàng – đỏ)  Môi trường sử dụng: ◦ Urea Broth (Rustigian – Stuart) ◦ Christensen Urea (môi trường thạch nghiêng) [...]... trường Urea Broth Thử nghiệm Urease  Thực hiện ◦ Chuẩn bị môi trường ◦ Cấy VSV vào 5ml môi trường ◦ ủ 37oC/24 giờ ◦ Quan sát Thử nghiệm khả năng sinh H2S Mục đích: phát hiện khả năng sinh H2S  Cơ sở sinh hóa:  Acid amin chứa S Thiosulfate desulfohydrase thiosulfate reductase H2S H2S  H2S sinh ra được nhận biết bởi ion sắt, chì tạo kết tủa màu đen (FeS, PbS) Thử nghiệm khả năng sinh H2S Để phân biệt... VSV có khả năng sinh indol  các VSV có hệ emzym tryptophanase 37oC / 24h Thuốc thử Kovac’s Chủng VSV MT canh trypton Pứ dương tính Pứ âm tính Thử nghiệm khả năng sinh Indol  Là phản ứng giúp phân biệt ◦ E coli (+) với Klebsiella (-) ◦ Proteus mirabilis (-) với Proteus khác (+) ◦ Bacillus alvei (+) với Bacillus khác (-) …  Đối chứng (+) Proteus rettgeri (-) Serratia marcescens Thử nghiệm KIA/TSI ... ĐC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Thử nghiệm MR (Methyl red)   Mục đích: xác định vi sinh vật sản xuất và duy trì các acid bền trong quá trình lên men glucose Cơ sở sinh hóa: ◦ Chất chỉ thị pH: methyl red dưới 4,4 5,0 – 5,8 trên 6,0 ◦ MR (+) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – môi trường càng acid ◦ MR (-) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – các chất có tính acid bị chuyển hóa – môi trường d ần trung tính... tiến hành:  ◦ ◦ ◦ ◦ Cấy vi sinh vật trong môi trường MR-VP Ủ 24 – 48 giờ, nhiệt độ 37oC Bổ sung thuốc thử vào môi trường, lắc nhẹ Đọc kết quả sau 20 phút và chậm nhất là 4 giờ Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer)  Kiểm tra thuốc thử bằng đối chứng (+) : Enterobacter cloacea (-) : E coli  Đọc kết quả: (+): màu đỏ trên môi trường (-): mặt môi trường không đổi màu (-) (+) Thử nghiệm Bile Esculin  Mục... Ủ (37oC, 24 – 48h) Thử nghiệm khả năng sinh H2S  (+) (-) Đọc kết quả: Xuất hiện màu đen trong môi trường Không xuất hiện màu đen trong môi trường ĐC (+) Thử nghiệm khả năng sinh H2S Pancreatic digest of casein (casitone) 20.0 g Peptic digest of animal tissue (beef extract) 6.1 g Ferrous ammonium sulfate 0.2 g Sodium thiosulfate 0.2 g Agar 3.5 g (-) (+) (+) Thử nghiệm khả năng sinh Indol  Mục đích... sử dụng: Malonate broth (bromothymol blue) pH 7,6 Dương tính: MT chuyển màu xanh da trời  Âm tính: MT không đổi màu và không sinh khối  Đ C (+) (-) Thử nghiệm catalase  Mục đích: phát hiện các vi sinh vật có hệ enzym catalase  Cơ sở sinh hoá: ◦ Catalase hiện diện ở các VSV hiếu khí và kỵ khí tùy ý catalase H2O2 ◦ (hydrogen peroxide) H2O + O2 (bọt khí) ... 5 ngày ở 37oC Thử nghiệm MR (Methyl red)  Môi trường: Glucose Phosphate (MR-VP broth) ủ 2 – 5 ngày 37oC Chủng VSV MR-VP broth Pứ âm tính Pứ dương tính ĐC Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer)  Mục đích: Phát hiện vsv tạo sản phẩm trung tính (acetoin) trong quá trình lên men glucose  Cở sở sinh hóa: Acetoin được tạo ra trong điều kiện yếm khí hoàn toàn 2 pyruvate acetoin + 2 CO2 Thử nghiệm VP (Voges –... sự hiện diện của muối mật  Cơ sở sinh hoá: ◦ Esculin là hợp chất nhân tạo ◦ Esculetine được phóng thích phản ứng với Fe2+ tạo thành phức hợp màu đen Môi trường Bile Esculine Agar Beef extract Pepton Esculin Mật bò (Oxgall) Ferric citrate Agar Nước cất 3g 5g 1g 40g 0,5g 15g 1 lít Esculetine Phân tử Esculine Glucose Sự phân giải Esculine thành Glucose và Esculetine Thử nghiệm Bile Esculin Khuẩn lạc Enterococcus... Thử nghiệm KIA/TSI  TSI: Triple sugar iron agar (trang 106) Pepton Lactose Sucrose Glucose NaCl Feric ammonium sulphate Sodium thiosulphate Agar Phenol red Nước cất pH 7,4±0,2 20g 10g 10g 1g 5g o,2g 0,2g 13g 0,025g 1 lít Thử nghiệm KIA/TSI  Mục đích: phát hiện khả năng ◦ sử dụng các nguồn cacbonhydrate ◦ sinh H2S ◦ tạo hơi (gas) Ủ 37oC/24 giờ Quan sát: Phần nghiêng / phần sâu / hơi / H2S Thử nghiệm. .. Esculin Khuẩn lạc Enterococcus faecalis cho kết quả BEA (+) Thử nghiệm Malonate Mục đích Phát hiện các VSV có khả năng sử dụng malonate như nguồn carbon duy nhất  Cơ sở sinh hoá Malonate là chất cạnh tranh với succinate Khi VSV phân hủy được malonate thì cũng phân huỷ được các nguồn đạm vô cơ khác  tạo thành sp kiềm  làm tăng pH môi trường  Thử nghiệm Malonate  Môi trường sử dụng: Malonate broth (bromothymol . nghi m Ureaseử ệ Thử nghiệm khả năng sinh H Thử nghiệm khả năng sinh H 2 2 S S  Mục đích: phát hiện khả năng sinh H 2 S  Cơ sở sinh hóa: Acid amin chứa. tính Pứ âm tính Pứ âm tính 37 o C / 24h Thử nghiệm khả năng sinh Indol Thử nghiệm khả năng sinh Indol  Là phản ứng giúp phân biệt ◦ E. coli (+) với Klebsiella