Đang tải... (xem toàn văn)
Mục đích : Xác định khả năng vi sinh vật sử.. dụng nguồn citrat như là nguồn cacbon duy nhất.[r]
(1)Các thử nghiệm sinh
Các thử nghiệm sinh
hóa
hóa
GV: Nguyễn Văn Hạnh
(2)Phân lập khuẩn lạc khiết
cần thiết cho định danh VSV
Việc định danh dựa chủ yếu vào
đặc điểm kiểu hình đặc biệt phản ứng sinh hóa
Có cách sử dụng thử nghiệm
sinh hóa để định danh VSV: ◦ Cách truyền thống
◦ Sử dụng KIT
(3)(4)Thử nghiệm khả lên
Thử nghiệm khả lên
men
men
Mục đích: thử nghiệm khả sữ dụng
nguồn CH VSV
Nguyên tắc: VSV sử dụng CH tao acid
giảm pH môi trường
Các loại carbonhydrate
◦ Monocarbonhydrate: glucose, xylose, rhamnose …
◦ Dicarbonhydrate: sucrose, lactose …
◦ Polycarbonhydrate: tinh bột, cellulose
◦ Các loại đường khử: đường mono chứa chức –CHO
(5)Phenol Red Carbohydrate
Phenol Red Carbohydrate
Broth
Broth
Hấp 115oC 15 phút Trang
(6)Thử nghiệm khả lên Thử nghiệm khả lên
men men
Môi trường: Phenolred broth
base bổ sung 0,5-1% đường cần thử nghiệm
VSV sử dụng nguồn
đường môi trường làm giảm pH thay đổi màu chất thị phenolred
Phản ứng (+): môi trường
chuyển vàng
Phản ứng (-): mơi trường có
(7)Thử nghiệm Citrate
Thử nghiệm Citrate
Mục đích: Xác định khả vi sinh vật sử
dụng nguồn citrat nguồn cacbon
Cở sở sinh hóa:
◦ VSV sử dụng citrate, sinh CO2 làm kiềm hóa MT
(8)Thử nghiệm Citrate Thử nghiệm Citrate
Môi trường Simmon citrate agar (tr 105)
Ammonium dihydrogen phosphate 1.0g Dipotassium hydrogen phosphate 1.0g
NaCl 5g
Sodium citrate 2g
MgSO4 0,2g
Bromothymol blue 0,08g
(9)Thử nghiệm Citrate Thử nghiệm Citrate
Chú ý
- Cấy lượng sinh khối vừa đủ - Có đối chứng trắng kèm
Đối chứng trắng
(10)Thử nghiệm Urease Thử nghiệm Urease
Mục đích: phát VSV có mang enzym urease Cơ sở sinh hoá:
(NH2)2CO + H2O NH3 + CO2
tăng pH môi trường đỏ phenol (vàng – đỏ)
Môi trường sử dụng:
◦ Urea Broth (Rustigian – Stuart)
(11)Môi trường Urea Broth
(12)Thực hiện
◦ Chuẩn bị môi trường
◦ Cấy VSV vào 5ml môi trường
◦ ủ 37oC/24
◦ Quan sát
(13)Thử nghiệm khả sinh H
Thử nghiệm khả sinh H22SS
Mục đích: phát khả sinh H2S Cơ sở sinh hóa:
Acid amin chứa S H2S
Thiosulfate H2S
H2S sinh nhận biết ion sắt, chì tạo kết tủa màu đen (FeS, PbS)
desulfohydras e
(14)Thử nghiệm khả sinh H
Thử nghiệm khả sinh H22SS
Để phân biệt loài thuộc họ
Enterobacteriaceae giống Proteus Môi trường sử dụng:
◦ KIA, TSI (thạch nghiêng)
◦ SIM, PIA (thạch sâu)
◦ BSA (thạch đĩa)
(15)Thử nghiệm khả sinh H
Thử nghiệm khả sinh H22SS
Đọc kết quả:
Xuất màu đen môi trường
Không xuất màu đen môi trường
(+)
(-)
(16)Thử nghiệm khả sinh H
Thử nghiệm khả sinh H22SS
(+) (+) (-)
Pancreatic digest of
casein (casitone) 20.0 g Peptic digest of
animal tissue (beef extract)
6.1 g
Ferrous ammonium
sulfate 0.2 g
Sodium thiosulfate 0.2 g
(17)Thử nghiệm khả sinh Indol
Thử nghiệm khả sinh Indol
Mục đích
Phát VSV có khả sinh indol
VSV có hệ emzym tryptophanase
Chủng VSV
Chủng VSV MT canh tryptonMT canh trypton
Thu c th ố
Kovac’s
Pứ dương tính
Pứ dương tính Pứ âm tínhPứ âm tính
(18)Thử nghiệm khả sinh Indol
Thử nghiệm khả sinh Indol
Là phản ứng giúp phân biệt
◦ E coli (+) với Klebsiella (-)
◦ Proteus mirabilis (-) với Proteus khác (+) ◦ Bacillus alvei (+) với Bacillus khác (-)
…
Đối chứng (+) Proteus rettgeri
(19)Thử nghiệm KIA/TSI
Thử nghiệm KIA/TSI
KIA: Kligler iron agar (trang 99)
Pepton 20g
Lactose 20g
Glucose 1g
NaCl 5g
Feric ammonium citrate 0,5g
Sodium thiosulphate 0,5g
Agar 15g
Phenol red 0,025g
(20)Thử nghiệm KIA/TSI
Thử nghiệm KIA/TSI
TSI: Triple sugar iron agar (trang 106)
Pepton 20g
Lactose 10g
Sucrose 10g
Glucose 1g
NaCl 5g
Feric ammonium sulphate o,2g
Sodium thiosulphate 0,2g
Agar 13g
Phenol red 0,025g Nước cất lít
(21)Thử nghiệm KIA/TSI
Thử nghiệm KIA/TSI
Mục đích: phát khả
◦ sử dụng nguồn cacbonhydrate ◦ sinh H2S
◦ tạo (gas)
Ủ 37oC/24 Ủ 37oC/24
Quan sát:
(22)Thử nghiệm KIA/TSI
Thử nghiệm KIA/TSI
1
1 22 33 44 55 66 77 88 99 1010 1111
(23)Thử nghiệm MR (Methyl red) Thử nghiệm MR (Methyl red)
Mục đích: xác định vi sinh vật sản xuất
trì acid bền trình lên men glucose
Cơ sở sinh hóa:
◦ Chất thị pH: methyl red
◦ MR (+) – kéo dài thời gian nuôi cấy – môi trường
càng acid
◦ MR (-) – kéo dài thời gian ni cấy – chất có tính acid bị chuyển hóa – mơi trường dần trung tính Thời gian ủ – ngày 37oC
(24)Thử nghiệm MR (Methyl Thử nghiệm MR (Methyl
red) red)
Môi trường: Glucose Phosphate (MR-VP broth)
Chủng VSV
Chủng VSV
ủ – ngày 37oC
Pứ âm tính
Pứ âm tính Pứ dương tínhPứ dương tính ĐCĐC MR-VP broth
(25)Thử nghiệm VP (Voges –
Thử nghiệm VP (Voges –
Proskauer)
Proskauer)
Mục đích: Phát vsv tạo sản
phẩm trung tính (acetoin) q trình lên men glucose
Cở sở sinh hóa: Acetoin tạo
trong điều kiện yếm khí hồn tồn
(26)(27)Thử nghiệm VP (Voges –
Thử nghiệm VP (Voges –
Proskauer)
Proskauer)
Môi trường sử dụng: MR-VP Phương pháp tiến hành:
◦ Cấy vi sinh vật môi trường MR-VP ◦ Ủ 24 – 48 giờ, nhiệt độ 37oC
◦ Bổ sung thuốc thử vào môi trường, lắc nhẹ ◦ Đọc kết sau 20 phút chậm
(28)Thử nghiệm VP (Voges –
Thử nghiệm VP (Voges –
Proskauer)
Proskauer)
Kiểm tra thuốc thử
bằng đối chứng
(+) : Enterobacter cloacea
(-) : E coli
Đọc kết quả:
(+): màu đỏ môi trường
(-): mặt môi trường không
(29)Thử nghiệm Bile Esculin
Thử nghiệm Bile Esculin
Mục đích: xác định khả thủy giải
glucoside esculin thành esculetin glucose có diện muối mật.
Cơ sở sinh hoá:
◦ Esculin hợp chất nhân tạo
(30)Môi trường Bile Esculine
Môi trường Bile Esculine
Agar
Agar
Beef extract 3g
Pepton 5g
Esculin 1g
Mật bò (Oxgall) 40g
Ferric citrate 0,5g
Agar 15g
(31)Glucose
Esculetin e
(32)Sự phân giải Esculine thành Glucose Esculetine
Thử nghiệm Bile Esculin
(33)(34)Thử nghiệm Malonate
Thử nghiệm Malonate Mục đích
Phát VSV có khả sử dụng malonate nguồn carbon
Cơ sở sinh hoá
Malonate chất cạnh tranh với succinate Khi VSV phân hủy malonate phân huỷ nguồn đạm vô khác
(35)Thử nghiệm Malonate
Thử nghiệm Malonate
Môi trường sử dụng:
Malonate broth (bromothymol blue)
Dương tính: MT chuyển
màu xanh da trời
Âm tính: MT không đổi
màu không sinh khối
(+ )
(-) Đ
C
(36)Thử nghiệm catalase
Thử nghiệm catalase
Mục đích: phát vi sinh vật có hệ
enzym catalase
Cơ sở sinh hoá:
◦ Catalase diện VSV hiếu khí kỵ khí tùy ý
◦ H2O2 H2O + O2 (bọt khí) (hydrogen peroxide)
(37)Thử nghiệm catalase
Thử nghiệm catalase
Thực
◦ VSV lấy từ môi trường nuôi cấy (lỏng, rắn)
◦ Đặt VSV lên lam kính
◦ Nhỏ H2O2 30%
◦ Quan sát sau 1-2 giây
Phản ứng (+): có bọt khí xuất hiện
(38)Thử nghiệm catalase
(39)Thử nghiệm catalase
Thử nghiệm catalase
(40)Thử nghiệm
Thử nghiệm
decarboxylase
decarboxylase
Mục đích: xác định khả tạo enzyme
decarboxylase xúc tác phân cắt nhóm carboxyl số acid amin
(41)3 thử nghiệm quan trọng
◦ Lysine decarboxylase (LDC)
◦ Ornithine decarboxylase (ODC)
◦ Arginine decarboxylase (ADC) / Arginine dehydrolase (ADH)
Các enzyme enzyme cảm ứng, tạo môi trường
(42)Cơ sở sinh hoá
◦ Các sp tạo làm tăng pH môi trường
đổi màu chất thị
Môi trường sử dụng:
Decacboxylase Basal Medium
chỉ thị bromocresol purple (5,2 – 6,8)
Thử nghiệm decarboxylase
pH <5,2 5,2 –
(43)Biểu sinh hoá
Dương tính: pH mơi trường tăng Âm tính: pH giảm
MT trước
MT trước
cấy
cấy Pứ dương tínhPứ dương tính Pứ âm tínhPứ âm tính
Thử nghiệm decarboxylase
(44)THỬ NGHIỆM COAGULASE
THỬ NGHIỆM COAGULASE
Mục đích: Thử nghiệm khả làm đông
tụ huyết tương enzyme coagulase
Là bước cuối định danh giống
Staphylococcus
Chủng đối chứng (+): S aureus
(-): S epidermidis
Thử nghiệm tiến hành với huyết tương
(45)THỬ NGHIỆM COAGULASE
THỬ NGHIỆM COAGULASE
Thử nghiệm cách
Thử phiến kính
Đọc kết quả
Giọt nước + Sinh khối vsv + Huyết tương người
Thử nghiệm ống nghiệm:
0,5ml huyết tương 0,5ml huyết dịch sinh
khối
(46)THỬ NGHIỆM COAGULASE
THỬ NGHIỆM COAGULASE
Kết thử nghiệm Coagulase
(47)Thử nghiệm gelatinase
Thử nghiệm gelatinase
Mục đích: thử nghiệm khả phân giải
gelatine gelatinase
Cơ sở sinh hóa:
Gelatine polypeptide + acid amin
Gelatine môi trường dinh dưỡng môi trường đông đặc
VSV phân hủy gelatine môi trường lỏng
(48)Thử nghiệm gelatinase
Thử nghiệm gelatinase
Đối chứng dương: Aeromonas
hydrophila
âm: E coli
Môi trường sử dụng Nutrient Gelatine Dạng ống nghiệm thạch sâu
(49)Thử nghiệm gelatinase
Thử nghiệm gelatinase
Đọc kết
(+) môi trường tan chảy
(50)TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ƠXI HĨA
TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ƠXI HĨA
Mục đích: thử nghiệm khả chuyển
hố glucose theo đường khác nhau
Cơ sở sinh hóa:
◦ Lên men: q trình kỵ khí, tạo mơi trường acid cao
(51)TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ƠXI HĨA
TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ƠXI HĨA
Mơi trường sử dụng:
Oxidation/Fermentation media (Hugh & Leifson media)
Chỉ thị pH: bromocresol purple
pH <5,2 5,2 –
(52)TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ƠXI HĨA TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ƠXI HÓA
Trực khuẩn gram âm
O (oxidation) Pseudomonas aeruginosa
F (fermentation) Serratia marcescens
Cầu khuẩn gram dương
O (oxidation) Micrococcus luteus
(53)TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ƠXI
HĨA HĨA
Đọc kết quả:
A: đối chứng
B: phản ứng Ơxi hóa
(54)Thử nghiệm nitratase (khử Thử nghiệm nitratase (khử
nitrate) nitrate)
Mục đích: Thử nghiệm khả khử
nitrate
Cở sở sinh hóa:
3 , 3, 2, ,
nitratase
NO NO NH N NH OH NO
NO2 + sulphanilamine/N-napthylethylenediamine hydrochloride chất màu hồng
(55)Thử nghiệm nitratase (khử Thử nghiệm nitratase (khử
nitrate) nitrate)
Phương pháp tiến hành:
◦ Nuôi cấy chủng vi sinh vật môi trường chứa nitrate
◦ Bổ sung chất thử để kiểm tra diện nitrite
◦ Phản ứng định tính nitrite (-) bổ sung
(56)Thử nghiệm nitratase (khử Thử nghiệm nitratase (khử
(57)Thử nghiệm oxydase
Thử nghiệm oxydase
Mục tiêu: phát VSV có hệ enzym
oxydase (hệ cytochrom C)
Cơ sở sinh hoá
Cytochrom C khử + H+ + O2 Cytochrom C ơxi hố + H2O
Cytochrom C ơxi hố + TMPD khử TMPD ơxi hố (màu
(58)Thử nghiệm oxydase
Thử nghiệm oxydase
Thuốc thử
◦ TMPD (0,1%): N,N,N’,N’-tetramethyl-p-phenylenediamine
◦ Bảo quản lạnh tối
◦ Thời hạn bảo quản: tuần
Đối chứng (+): Serratia marcescens
(59)Thử nghiệm oxydase
Thử nghiệm oxydase Thực hiện:
◦ Lấy VSV từ Nitrient Agar đặt lên giấy thấm ◦ Nhỏ thuốc thử TMPD
◦ Quan sát sau 30 giây
(60)Thử nghiệm oxydase
(61)Thử nghiệm ONPG
Thử nghiệm ONPG
Mục đích: phát vi sinh
vật có hệ enzyme ß-galactosidase
– enzyme cảm ứng
Cơ sở sinh hóa:
ONPG o-nitrophenol
Màu vàng
Màu vàng
Không màu
(62)Thử nghiệm ONPG
Thử nghiệm ONPG
Lactose agar
Lactose agar
Chủng VSV
Chủng VSV 2ml ONPG broth2ml ONPG broth Pứ (+)Pứ (+) Pứ (-)Pứ (-)
ủ qua đêm
37o
C
Màu vàng
(63)Thử nghiệm khả tan
Thử nghiệm khả tan
huyết
huyết
Mục tiêu: phát vi sinh
vật có khả làm tan hồng cầu
◦ Máu sử dụng: cừu, bê non, thỏ …
Cơ sở sinh hoá:
◦ Các heamolysine tác nhân làm tan hồng cầu động vật
◦ Vi sinh vật khác heamolysine
khác cường độ biểu
(64)Thử nghiệm khả tan
Thử nghiệm khả tan
huyết
huyết
Phân loại: kiểu tan huyết
◦ Tan huyết hồn tồn (ß): vịng tan huyết trong, rõ
◦ Tan huyết khơng hồn tồn (α):xung quanhvà khuẩn lạc chuyển đục có màu khác
(65)Thử nghiệm CAMP
Thử nghiệm CAMP
Mục tiêu: thử nghiệm khả cộng
hưởng tan huyết VSV
Cơ sở sinh hóa:
◦ S aureus tiết β-lysin gay tan hồng cầu ◦ VSV tiết CAMP gây tan huyết
◦ β-lysin + CAMP gây tan huyết mạnh,
hoàn toàn
Ý nghĩa: dùng phân biệt Streptococcus
(66)Staphylococcus aureus
Streptococcus agalactiae
Streptococcus pyogenes
(+)
(67)Thử nghiệm tính di động
Thử nghiệm tính di động
Mục đích: Xác định khả di động
vi sinh vật
Cở sở: Vi sinh vật di động nhờ tiêm mao
Các tiến hành: Cấy đâm sâu vi sinh vật
vào môi trường thạch mềm (0,5% agar)
◦ Vi sinh vật di động làm môi trường đục, phát triển lan khỏi vết cấy
(68)Thử nghiệm tính di động
Thử nghiệm tính di động
(69)Ứng dụng thử nghiệm sinh Ứng dụng thử nghiệm sinh
hóa để định danh VSV hóa để định danh VSV
Mỗi lồi vsv có đặc tính sinh
hóa khác
Thực kiểm tra thử nghiệm
sinh hóa giúp xác định tên lồi (định danh) vi sinh vật
Bảng sinh hóa dùng định danh
(70)(71)(72)(73)