Nghiên cứu khả năng ức chế hoạt tính Aurora kinaza in vitro của Derrone phân lập từ cây Vông Nem Erythrina orientalis L. Murr

Luận văn cao học ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NguyễnThịNhƣTrang NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨC CHẾ HOẠT TÍNH AURORA KINAZA IN VITRO CỦA DERRONE PHÂN LẬP TỪ CÂY VÔNG NEM ERYTHRINA ORIENTALIS L MURR LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HàNội - 2013 Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm i Luận văn cao học ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NguyễnThịNhƣTrang NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨC CHẾ HOẠT TÍNH AURORA KINAZA IN VITRO CỦA DERRONE PHÂN LẬP TỪ CÂY VÔNG NEM ERYTHRINA ORIENTALIS L MURR Chuyênngành:Sinhhọcthựcnghiệm Mãsố: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS HOÀNG THỊ MỸ NHUNG HàNội - 2013 Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm ii Luận văn cao học MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH MINH HỌA vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix MỞ ĐẦU Chƣơng – TỔNG QUAN .3 1.1 NGUYÊN PHÂN 1.1.1 Pha phân chia nhân (mitosis) 1.1.2 Pha phân chia tế bào chất (cytokinesis) 1.1.3 Một số kiện quan trọng nguyên phân 3.2 AURORA KINAZA VÀ VAI TRÒ TRONG UNG THƢ 10 3.2.1 Aurora kinaza 10 3.2.2 Vai trị Aurora kinaza hình thành ung thƣ 17 3.3 CÁC CHẤT SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU .19 3.3.1 VX680 - chất ức chế Aurora kinaza 19 3.3.2 Paclitaxel (Taxol) 21 3.3.3 Chế phẩm Derrone 22 Chƣơng – ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .24 2.1 ĐỐI TƢỢNG .24 Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm iii Luận văn cao học 2.2 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT 25 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .27 2.3.1 Hoạt hố ni cấy tế bào 27 2.3.2 Đánh giá độc tính chế phẩm Derrone phƣơng pháp MTT 28 2.3.3 Thử độc tính Derrone sử dụng phƣơng pháp xCELLigence 31 2.3.4 Miễn dịch huỳnh quang .33 2.3.5 Phƣơng pháp đếm tế bào dòng chảy Flow Cytometry 35 2.3.6 Phân tích kết quả, xử lý số liệu 37 Chƣơng – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 KẾT QUẢ HOẠT HÓA VÀ NHÂN NUÔI TẾ BÀO 38 3.2 KẾT QUẢ THỬ ĐỘC TÍNH TRÊN CÁC DỊNG TẾ BÀO MCF-7, H1299, HELA VÀ HEK 293 38 3.2.1 Kết thử độc tính dịng MCF-7 xCELLigence .39 3.2.2 Kết thử độc tính dịng H1299 xCELLigence 43 3.2.3 Kết thử độc tính dịng HeLa xCELLigence 46 3.2.4 Kết thử độc tính dịng HEK 293 phƣơng pháp MTT 49 3.3 ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA DERRONE LÊN CHU TRÌNH TẾ BÀO 51 3.3.1 Đánh giá ảnh hƣởng Derrone lên điểm kiểm soát thoi phân bào51 3.3.2 Ảnh hƣởng Derrone lên chu trình tế bào 54 3.4 ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA DERRONE LÊN SỰ BIỂU HIỆN H3PS10 …………………………………………………………………………….56 3.4.1 Đánh giá biểu H3PS10 dƣới ảnh hƣởng Derrone phƣơng pháp miễn dịch huỳnh quang 57 3.4.2 Định lƣợng ảnh hƣởng Derrone lên H3PS10 phƣơng pháp đếm tế bào dòng chảy 60 3.5 THẢO LUẬN 61 Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm iv Luận văn cao học KẾT LUẬN 66 KIẾN NGHỊ .67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Sự biểu mức hay khuếch đại gen Aurora kinaza nhiều loại ung thƣ khác 18 Bảng 2: Các chất ức chế Aurora kinaza 20 Bảng 3: Đặc điểm, nguồn gốc điều kiện ni cấy dịng tế bào sử dụng nghiên cứu .24 Bảng 4: Máy móc thiết bị sử dụng .25 Bảng 5: Dụng cụ vật tƣ tiêu hao 26 Bảng 6: Hóa chất sử dụng đề tài 26 Bảng 7: Tổng hợp giá trị IC50 số tƣơng quan R2 Derrone VX-680 48 Bảng 8: Bảng thống kê tỷ lệ tế bào HeLa bám đĩa đƣợc ủ với VX-680 chế phẩm Derrone 54 Bảng 9: Thang chuẩn đánh giá độ độc chất thông qua giá trị IC50 62 Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm v Luận văn cao học DANH MỤC HÌNH MINH HỌA Hình 1: Mitosis cytokinesis Hình 2: Sự phosphoryl hóa H3 kỳ trung gian Hình 3: Chức hoạt động Aurora B PP1 việc phosphoryl hóa H3 Ser10 .8 Hình 4: Cơ chế hoạt động điểm kiểm soát phân bào Hình 5: Cấu trúc Aurora kinaza A, B C .12 Hình 6: Sự phân bố Aurora A B nguyên phân .13 Hình 7: Aurora B điều hịa phân tách nhiễm sắc thể kiểm sốt thoi vơ sắc 16 Hình 8: Cây Thơng đỏ (Taxus brevifolia) cơng thức cấu tạo Paclitaxel 21 Hình 9: Cây vông nem Erythrina orientalis L Murr công thức cấu tạo Derrone 22 Hình 10: Nguyên lý hoạt động bƣớc phƣơng pháp MTT 29 Hình 11: Bố trí thí nghiệm đĩa ni cấy 96 giếng .30 Hình 12: Các thành phần nguyên tắc hoạt động hệ thống xCELLigence 31 Hình 13: Thành phần cấu tạo hoạt động hệ thống máy Flow Cytometry 35 Hình 14: Đồ thị biểu diễn trạng thái MCF-7 dƣới tác dụng Derrone theo thời gian 39 Hình 15: Phân tích tốc độ chết tế bào MCF-7 sau CI đạt giá trị cực đại mẫu ủ Derrone 40 Hình 16: Đồ thị biểu diễn trạng thái MCF-7 dƣới tác dụng VX-680 theo thời gian 41 Hình 17: Đồ thị biểu diến giá trị IC50 Derrone dòng MCF-7 từ thời điểm 118 đến 148 thí nghiệm 41 Hình 18: Đƣờng cong đáp ứng liều MCF-7 dƣới tác động Derrone 148 42 Hình 19: Đồ thị biểu diễn trạng thái H1299 dƣới tác dụng Derrone theo thời gian 43 Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm vi Luận văn cao học Hình 20: Đồ thị biểu diễn trạng thái H1299 dƣới tác dụng VX-680 theo thời gian 43 Hình 21: Phân tích tốc độ chết tế bào MCF-7 sau CI đạt giá trị cực đại mẫu ủ Derrone nồng độ 10 μg/ml .45 Hình 22: Đồ thị biểu diến giá trị IC50 Derrone dòng H1299 từ thời điểm 53 đến 76 thí nghiệm 45 Hình 23: Đồ thị biểu diễn đƣờng cong đáp ứng liều dòng H1299 dƣới tác động Derrone thời điểm 76 .46 Hình 24: Đồ thị biểu diễn trạng thái HeLa dƣới tác dụng Derrone theo thời gian 46 Hình 25: Đồ thị biểu diễn trạng thái HeLa dƣới tác dụng VX-680 theo thời gian 47 Hình 26: Đồ thị biểu diến giá trị IC50 Derrone dòng HeLa từ thời điểm 40 đến 78 thí nghiệm 47 Hình 27: Đồ thị biểu diễn đƣờng cong đáp ứng liều dòng HeLa dƣới tác động Derrone thời điểm 78 .48 Hình 28: Hình ảnh tế bào sau 48 ủ với chế phẩm Derrone Taxol 50 Hình 29: Đƣờng cong đáp ứng liều HEK 293 với chất Derrone Taxol 51 Hình 30: Hình ảnh tế bào HeLa dƣới tác động Taxol, VX-680 Derrone 52 Hình 31: Hình ảnh tế bào MCF7 dƣới tác động Taxol, VX-680 Derrone 53 Hình 32: Biểu đồ thể ảnh hƣởng Derrone lên chu trình tế bào mẫu đối chứng mẫu ủ Derrone 8, 15 24 55 Hình 33: Biểu đồ thể giá trị FSC tế bào mẫu đối chứng mẫu ủ Derrone 8, 15 24 56 Hình 34: Sự biểu H3PS10 kỳ khác trình phân chia tế bào HeLa mẫu đối chứng sinh học .57 Hình 35: So sánh biểu H3PS10 tế bào HeLa dƣới tác động thuốc 58 Hình 36: So sánh biểu H3PS10 Aurora B tế bào MCF-7 dƣới tác động VX-680, Derrone với đối chứng 59 Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm vii Luận văn cao học Hình 37: Biểu đồ thể cƣờng độ tín hiệu H3PS10 tế bào dƣới tác động Derrone 15μg/ml so với đối chứng Taxol dịng tế bào HeLa 60 Hình 38: Dự đốn khả vị trí liên kết Derrone với Aurora B sử dụng phần mềm AutoDock Vina, so sánh với Luteolin VX-680 63 Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm viii Luận văn cao học DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Viết đầy đủ Chữ viết tắt APC/C ATP BSA BTAK Cdk CPC ĐCDM ĐCSH Der DMEM DMSO DNA FBS PFA H3PS10 HP1 IC50 INCENP LSM MAPK MCAK MTT PBS PDB RPMI Ser10 FSC SSC Anaphase-promoting Complex/Cylosome Adenosine Triphosphate Bovine serum albumin Breast Tumor Activated Kinaza Cyclin-dependent Kinaza Chromosomal Passenger Complex – Phức hệ protein hành khách Đối chứng dung môi Đối chứng sinh học Derrone Dulbecco’s Modified Eagle Medium Dimethyl Sulfoxide Deoxyribonucleic Acid Fetal Bovine Serum Paraformaldehyde Histon H3 phosphoryl hóa Serine 10 Heterochromatin protein Inhibitory Concentration 50% - Nồng độ ức chế tăng sinh 50% Inner Centromere Protein Laser Scanning Microscope Mitogen – activated Protein Kinase Mitotic Centromere – associated kinesin 3-[4,5-dimethylthiazol-2]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide Phosphate Buffered Saline Protein Data Bank Roswell Park Memorial Institute Serine 10 Forward Scatter Side Scatter Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm ix Luận văn cao học MỞ ĐẦU Hóa trị phƣơng pháp truyền thống, mang tính chất tồn thânvà phƣơng pháp đƣợc sử dụng điều trị ung thƣ Những tiến vƣợt bậc thập niên vừa qua góp phần khẳng định nâng cao vai trị hóa trị ung thƣ Các tiến lĩnh vực sinh học ung thƣ hoàn thiện phƣơng pháp điều trị việc tìm thuốc có chế tác động mang tính đặc hiệu Song song với đó, việc nghiên cứu chuyên sâu chất, chế phát sinh xâm lấn bệnh đƣợc quan tâm nghiên cứu Trong trình đa giai đoạn hình thành khối u, tế bào ung thƣ thu nhận biểu nhiều đặc điểm, có sáu khả sinh học bật tạo nên đặc tính phức tạp mặt tổ chức bệnh, bao gồm: trì tín hiệu tăng sinh; trốn tránh yếu tố ức chế khối u; chống lại chết tế bào; cho phép nhân lên gần nhƣ bất tử; cảm ứng hình thành mạch máu hoạt hóa trình xâm lấn di Quá trình xảy xuyên suốt để tế bào bất thƣờng hình thành khối u thể tăng sinh khơng kiểm sốt tế bào, mà ngun phân giai đoạn thiết yếu Vì để ngăn chặn ung thƣ, nguyên phân trở thành đích tác động đầy tiềm Kết hợp kiến thức thành tựu khoa học đó, có nhiều hợp chất đƣợc thử nghiệm nghiên cứu tác dụng ức chế phát triển tế bào ung thƣ nhắm đến yếu tố khác tham gia vào nguyên phân, enzym kinaza điều khiển chu trình tế bào mối quan tâm hàng đầu nhà khoa học giới năm gần Ở Việt Nam, hƣớng nghiên cứu mới, hứa hẹn phát mang tính đột phá Vốn đất nƣớc đƣợc thiên nhiên ƣu đãi, nằm vùng nhiệt đới gió mùa, Việt Nam có thảm thực vật vô phong phú đa dạng với 12.000 loài thực vật bậc cao khác Từ nhiều kỷ nay, thực vật không nguồn cung cấp dinh dƣỡng cho ngƣời mà phƣơng thuốc chữa bệnh quý giá bao gồm thuốc chống ung thƣ nói riêng bệnh khác nói chung Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học giảm rõ rệt so với đối chứng Đặc biệt, nhiều tế bào gần nhƣ khơng biểu tín hiệu - Tƣơng tự nhƣ VX-680, Derrone có khả làm giảm tín hiệu H3PS10 đáng kể hai nồng độ Đặc biệt nồng độ 30μg/ml, xuất VX-680 nhƣng có số tế bào phân chia có tín hiệu huỳnh quang gần nhƣ 0, chứng tỏ Derrone nồng độ có khả ức chế hồn tồn phosphoryl hóa histon H3 3.4.1.2 Dịng tế bào MCF-7 Hình 36: So sánh biểu H3PS10 Aurora B tế bào MCF-7 tác động VX-680, Derrone với đối chứng (Xanh lục: H3PS10; Đỏ: Aurora B; Xanh lam: Nhân) Trong thí nghiệm với dịng MCF-7, ngồi việc nhuộm miễn dịch huỳnh quang với kháng thể kháng histon H3 phosphoryl hóa, thực nhuộm với kháng thể kháng Aurora B để kiểm tra ảnh hƣởng Derrone lên Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm 59 Luận văn cao học biểu Aurora B khả hoạt động phosphoryl hóa Aurora B lên H3 Kết thu đƣợc số hình ảnh Hình 36 Kết nhuộm miễn dịch huỳnh quang dòng tế bào MCF-7 tƣơng đồng với kết dòng HeLa.Ở mẫu đối chứng mẫu tế bào ủ với Taxol, tín hiệu huỳnh quang H3PS10 (xanh) Aurora B (đỏ) rõ nét phân bố xác nhiễm sắc thể.Điều chứng tỏ Taxol thực khơng có ảnh hƣởng đến biểu hoạt động Aurora B H3PS10 Tuy nhiên mẫu tế bào ủ với Derrone 10 μg/ml VX680 0,093μg/ml, tín hiệu H3PS10 bị ức chế biểu hoàn toàn, Aurora B biểu với tín hiệu bình thƣờng 3.4.2 Định lƣợng ảnh hƣởng Derrone lên H3PS10 phƣơng pháp đếm tế bào dòng chảy Phƣơng pháp đếm tế bào dịng chảy cho phép định lƣợng hóa khả ức chế biểu H3PS10 Derrone Kết thu đƣợc chúng tơi biểu diễn Hình 37 Hình 37: Biểu đồ thể cường độ tín hiệu H3PS10 tế bào tác động Derrone 15μg/ml so với đối chứng Taxol dịng tế bào HeLa Nhìn vào biểu đồ ta thấy mẫu đối chứng Taxol, 84,9% số tế bào phân chia có biểu mạnh H3PS10 Tuy nhiên mẫu tế bào ủ với Derrone, tỷ lệ tế bào phân chia biểu H3PS10 mạnh giảm đáng kể, 43,1% số Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm 60 Luận văn cao học tế bào biểu H3PS10 yếu chiếm tỷ lệ cao, lên đến 51,3% Kết cho thấy Derrone có khả ức chế biểu H3PS10 tế bào lên đến 41,8% 3.5 THẢO LUẬN Hiện nay, thuốc chống phân bào nhƣ Colchicine, họ Taxane (paclitaxel, dcetaxel) hay Vinblastine đƣợc sử dụng nhiều việc điều trị ung thƣ[21] Tuy nhiên chất ảnh hƣởng đến tế bào thƣờng, tế bào phân chia không phân chia, gây suy tủy bệnh thần kinh cách ức chế giải trùng hợp sợi trục thần kinh hay tác động đến tế bào thần kinh đệm [34].Trong năm gần đây, có nhiều chất chống phân bào đƣợc nghiên cứu với tác động đặc hiệu vào trình phân bào, nhằm tăng hiệu giảm độc tính so với thuốc truyền thống Trong nghiên cứu trƣớc đây, tiến hành sàng lọc thuốc từ 24 chất đƣợc cung cấp nhóm nghiên cứu TS Phƣơng Thiện Thƣơng, Viện Dƣợc liệu Trung Ƣơng cung cấp Cùng với đó, việc xác định so sánh cấu trúc phân tử chất với chất chống phân bào điển hình, chúng tơi dự đốn hợp chất Derrone ảnh hƣởng đến q trình phân bào, mà đích đến Aurora B Bƣớc đầu, tiến hành thử độc tính chế phẩm Derrone lên ba dịng tế bào ung thƣ MCF-7, H1299 HeLa Kết cho thấy Derrone có khả ức chế tiêu diệt tế bào ung thƣ, thể giá trị IC50 lần lƣợt 11,16; 11,71 10,55 μg/ml Theo thang chuẩn đánh giá độ độc chất ởBảng giá trị IC50 Derrone nằm khoảng giới hạn mức 2, chứng tỏ độc tính mạnh tế bào.Mặt khác, Derrone có khả ức chế tăng trƣởng dòng tế bào HEK 293, dịng tế bào thƣờng chuyển dạng có khả phân chia vô hạn nhƣ tế bào ung thƣ Điều chứng tỏ Derrone chất chống phân bào (anti – mitotic drug) Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm 61 Luận văn cao học Bảng 9: Thang chuẩn đánh giá độ độc chất thông qua giá trị IC50[59] IC50 Mức xếp hạng Đánh giá độ độc < μg/ml Rất cao – 10 μg/ml Cao 10 –100 μg/ml Trung bình >100 μg/ml Thấp Sự tác động Derrone lên sinh trƣởng chết quần thể tế bào có nhiều điểm tƣơng đồng với VX-680, chất ức chế Aurora B điển hình.Ở ba dịng tế bào ung thƣ mà chúng tơi thử nghiệm, Derrone VX-680 nồng độ thích hợp có khả làm tăng số tế bàođạt cực đại cao sớm so với mẫu đối chứng Đặc biệt, hai chất làm tốc độ chết tế bào tăng mạnh sau giá trị CI đại cực đại.Kiểm tra tác động lên điểm kiểm sốt thoi vơ sắc Derrone với đối chứng VX-680, nhận thấy tế bào bị bắt giữ kỳ nguyên phân hoạt động Paclitaxel hoạt hóa điểm kiểm sốt này, dƣới ảnh hƣởng Derrone làm tế bào có khả khỏi nguyên phân để trở lại pha G1 kỳ trung gian Với VX-680, điều giải thích thuốc tác động lên tế bào cách ức chế hoạt tính Aurora kinaza, làm tế bào vƣợt qua điểm kiểm soát thoi phân bào vào “mitotic slippage”[17, 29, 53] Hiện tƣợng xảy nhiều chu kỳ liên tiếp tế bào, làm tế bào trở thành dạng đa nhân 4n 8n, kích thƣớc tế bào tăng cao nhiều so với đối chứng, từ làm số CI tăng cao Tế bào sau chết theo chƣơng trình[53] Vậy tác động Derrone có chế tƣơng tự VX-680.Quả thật, chứng minh Derrone có ảnh hƣởng lớn đếnchu trình tế bào Quần thể tế bào dƣới tác động Derrone 24 có tỷ lệ tế bào pha S tăng cao bất thƣờng Không vậy, gần 20% số tế bào dạng đa nhân, nhiễm sắc thể > 4N, quần thể đối chứng 4,4% Điều chứng tỏ thuốc có khả tác động làm tế bào bị bắt giữ lại pha S vƣợt qua đƣợc điểm kiểm soát tiếp tục vào G1 Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm 62 Luận văn cao học Ngồi ra, ba dịng MCF-7, H1299 HeLa có biểu p53 không giống Nếu nhƣ MCF-7 biểu p53 bình thƣờng, dịng HeLa biểu p53 yếu, gần nhƣ khơng có, hay H1299 trí khơng có gen p53 Tuy nhiên tác động Derrone lên dòng tế bào cho kết tƣơng đồng giá trị IC50, số CI nhƣ kiểu hình tế bào.Vậy chúng tơi nhận định chế tác động Derrone lên tế bào không liên quan đến biểu hoạt động p53 Năm 2012, Fang Xie cộng chứng minh đƣợc số hợp chất thuộc nhóm flavonoid Luteolin, 3-Hydroxyflavone có khả tiêu diệt tế bào ung thƣ thông qua ức chế hoạt tính Aurora kinaza [27, 57] Cũng thành viên nhóm flavonoid, cơng thức hóa học Derrone có nhiều điểm tƣơng đồng với Luteolin hay 3-Hydroxyflavone Sử dụng phần mềm AutoDock Vina dự đoán khả liên kết Derrone với phân tử Aurora B, đồng thời so sánh với chế phẩm đƣợc nghiên cứu trƣớc, nhận thấy Derrone có khả liên kết lực với phân tử Aurora B (PDB: 4B8M) [52] Đặc biệt, vị trí liên kết Derrone trùng khớp với vị trí gắn Luteolin VX-680 lên phân tử Aurora B Đây vị trí gắn cạnh tranh với ATP để ức chế hoạt tính Aurora B thực chức (Hình 38) Hình 38: Dự đốn khả vị trí liên kết Derrone với Aurora B sử dụng phần mềm AutoDock Vina, so sánh với Luteolin VX-680 [57] Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm 63 Luận văn cao học Trong nghiên cứu này, để chứng minh tìm hiểu sâu chế tác động Derrone, tiến hành kiểm tra ảnh hƣởng Derrone lên phosphoryl hóa H3 Ser10, thƣớc đo hoạt tính Aurora Bkhi nghiên cứu chất có khả ức chế enzym này[23, 57] Kết cho thấy tác động Derrone làm giảm rõ rệt biểu H3PS10 mà không ảnh hƣởng đến biểu Aurora B, từ ảnh hƣởng đến chu trình tế bào, nhân đơi tăng sinh tế bào ung thƣ Q trình phosphoryl hóa H3 Ser10 có vai trị quan trọng kỳ trung gian giai đoạn phân chia tế bào Ở kỳ trung gian, trình giúp nhiễm sắc thể tháo xoắn đồng thời kích hoạt chép hay phiên mã gen[7, 37, 39].Sự ngăn cản trình phosphoryl hóa H3 Ser10 gây bất thƣờng chép tổng hợp protein cần thiết cho trình phân chia Chính vậy, Derrone tác động lên tế bào, ức chế phosphoryl hóa H3 làm tế bào bị dừng pha S, làm tỷ lệ tế bào pha S tăng cao Không vậy, lƣợng lớn tế bàotrở thành dạng đa nhân ảnh hƣởng Derrone lên trình phosphoryl hóa quan trọng Sự giảm biểu H3PS10 Derrone ức chế hoạt tính Aurora kinaza B, dẫn đến tƣợng “mitotic slippage”, làm tăng tỷ tệ đa nhân quần thể tế bào Mặc dù tƣơng tự nhƣ VX-680, Derrone có khả làm giảm đáng kể biểu H3PS10, nhiên kích thƣớc tế bào ủ với Derrone khơng tăng nhiều so với đối chứng Nhƣ vậy, dự đốn Derrone tác động lên khơng Aurora B, mà cịn ảnh hƣởng đến Aurora A, Aurora C trí lên enzym kinaza khác, có liên quan trực tiếp đến phosphoryl hóa H3 Ser10 nhƣ VRK1 hay Nercc1, gián tiếp lên phosphoryl hóa histon H3 Ser10[39, 56] Ngồi ra, PP1 đích tác động đầy tiềm Việc kích thích phiên mã hay hoạt động PP1 gây giảm mạnh mẽ biểu H3PS10 phân bào[37, 39] Để chứng minh đƣợc liệu Derrone có thực ức chế Aurora kinaza, cần phải tiến hành thí nghiệm nhƣ phản ứng kinase assay, hệ thống phân tích tƣơng tác enzym – chất để khẳng định điều [49] Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm 64 Luận văn cao học Mặc dù vậy, từ đặc điểm trên, nhận định Derrone chất ức chế Aurora kinaza mức độ in vitro tế bào Với nguồn gốc từ thiên nhiên, việc tìm chất có khả ức chế Aurora kinaza bƣớc tiến có tính khả thi việc điều trị ung thƣ với độc tính thấp độ an tồn cao Ngồi ra, việc tìm hiểu sâu cấu trúc phân tử Derrone giúp nhà khoa học tìm phƣơng án cải thiện tiềm hiệu chế phẩm việc điều trị ung thƣ Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm 65 Luận văn cao học KẾT LUẬN Từ kết thí nghiệm phân tích đây, rút số kết luận nhƣ sau: - Chế phẩm Derrone thể độc tính dịng tế bào ung thƣ vú MCF-7, dòng tế bào ung thƣ phổi H1299 dòng tế bào ung thƣ cổ tử cung HeLa với giá trị IC50 lần lƣợt 11,16;11,71 10,55μg/ml (R2> 0,99) Ngoài Derrone tác động lên tế bào thận phôi HEK 293 với IC50 10,86μg/ml (R2> 0,9) - Derrone có khả tác động đến chu trình tế bào, làm tăng tỷ lệ tế bào pha S, tăng tỷ lệ tế bào đa nhân kích thích tế bào khỏi điều hịa điểm kiểm sốt thoi vơ sắc - Derrone có tác dụng ức chế rõ ràng biểu histon H3 bị phosphoryl hóa nồng độ 15 30 μg/ml in vitro Derrone nồng độ 15μg/ml có khả ức chế biểu H3PS10 lên đến 41,8% Đặc biệt, nồng độ 30 μg/ml có khả ức chế hoàn toàn biểu tế bào Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm 66 Luận văn cao học KIẾN NGHỊ - Sử dụng phƣơng pháp Flow Cytometry Western Blot để định lƣợng xác tác động ức chế biểu H3PS10 Derrone, dòng tế bào ung thƣ khác - Thực phản ứng Kinase assay enzym kinaza để đánh giá xác chế tƣơng tác Derrone Aurora kinaza - Tiếp tục kiểm tra tác động Derronelên mơ hình 2D, 3D dịng tế bào ung thƣ khác thử nghiệm in vivo mơ hình động vật thí nghiệm chuột Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm 67 Luận văn cao học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Nguyễn Thị Ngọc Ánh (2012), Nghiên cứu khả chống ung thư hoạt chất phân lập từ Vông nem (Erythrina orientalis (L.) Murr., Fabaceae) Hậu phác (Magnolia officinalis Rehd Et wils, Magnoliaceae), Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc Gia Hà Nội, Hà Nội PGS TS Nguyễn Thanh Long, PGS TS Bùi Đức Dƣơng, Ths Phan Thị Thu Hƣơng (2012), Xét nghiệm đếm tế bào T-CD4 điều trị HIV/AIDS, Bộ Y tế Tài liệu Tiếng Anh Adams RR, Wheatleya SP, Gouldsworthy AM, Kandels-Lewis SE, Carmena M, Smythe C, Gerloff DL, Earnshaw WC (2000), "INCENP binds the Aurorarelated kinase AIRK2 and is required to target it to chromosomes, the central spindle and cleavage furrow".Current biology : CB, 10 (17), p 1075-1078 Bolanos-Garcia VM (2005), "Aurora kinases".The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 37 (8), p 1572-1577 Brown J, Koretke K, Birkeland M, Sanseau P, Patrick D (2004), "Evolutionary relationships of Aurora kinases: Implications for model organism studies and the development of anti-cancer drugs".BMC Evolutionary Biology, (1), p 39 Cazales M, Schmitt E, Montembault E, Dozier C, Prigent C, Ducommun B (2005), "CDC25B Phosphorylation by Aurora A Occurs at the G2/M Transition and is Inhibited by DNA Damage".Cell Cycle, (9), p 1233-1238 Cerutti H, Casas-Mollano JA (2009), "Histone H3 phosphorylation: Universal code or lineage specific dialects?".Epigenetics, (2), p 71-75 Cooper GM, Hausman RE (2007), The Cell A Molecular Approach, De Souza CPC, Osmani AH, Wu L-P, Spotts JL, Osmani SA (2000), "Mitotic Histone H3 Phosphorylation by the NIMA Kinase in Aspergillus nidulans".Cell, 102 (3), p 293-302 10 Ditchfield C, Johnson VL, Tighe A, Ellston R, Haworth C, Johnson T, Mortlock A, Keen N, Taylor SS (2003 April 28), "Aurora B couples chromosome alignment with anaphase by targeting BubR1, Mad2, and Cenp-E to kinetochores".J Cell Biol, 161(2) (p 267–280 Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm 68 Luận văn cao học 11 Edziri H, Mastouri M, Mahjoub MA, Mighri Z, Mahjoub A, Verschaeve L (2012), "Antibacterial, Antifungal and Cytotoxic Activities of Two Flavonoids from Retama raetam Flowers".Molecules, 17 (6), p 7284-7293 12 Fu J, Bian M, Jiang Q, Zhang C (2007), "Roles of Aurora Kinases in Mitosis and Tumorigenesis".Molecular Cancer Research, (1), p 1-10 13 Fukasawa K (2007), "Oncogenes and tumour suppressors take on centrosomes".Nat Rev Cancer, (12), p 911-924 14 Glover DM, Leibowitz MH, McLean DA, Parry H (1995), "Mutations in aurora prevent centrosome separation leading to the formation of monopolar spindles".Cell, 81 (1), p 95-105 15 Goto H, Yasui Y, Nigg EA, Inagaki M (2002), "Aurora-B phosphorylates Histone H3 at serine28 with regard to the mitotic chromosome condensation".Genes to Cells, (1), p 11-17 16 Hannak E, Kirkham M, Hyman AA, Oegema K (2001), "Aurora-A kinase is required for centrosome maturation in Caenorhabditis elegans".The Journal of Cell Biology, 155 (7), p 1109-1116 17 Harrington EA, Bebbington D, Moore J, Rasmussen RK, Ajose-Adeogun AO, Nakayama T, Graham JA, Demur C, Hercend T, Diu-Hercend A, Su M, Golec JMC, Miller KM (2004), "VX-680, a potent and selective small-molecule inhibitor of the Aurora kinases, suppresses tumor growth in vivo".Nat Med, 10 (3), p 262-267 18 Hauf S, Cole RW, LaTerra S, Zimmer C, Schnapp G, Walter R, Heckel A, Meel Jv, Rieder CL, Peters J-M (2003 April 28), "The small molecule Hesperadin reveals a role for Aurora B in correcting kinetochore–microtubule attachment and in maintaining the spindle assembly checkpoint".J Cell Biol., 161(2) (p 281–294 19 Hirota T, Lipp JJ, Toh B-H, Peters J-M (2005), "Histone H3 serine 10 phosphorylation by Aurora B causes HP1 dissociation from heterochromatin".Nature, 438 (p 1176-1180 20 Hsu J-Y, Sun Z-W, Li X, Reuben M, Tatchell K, Bishop DK, Grushcow JM, Brame CJ, Caldwell JA, Hunt DF, Lin R, Smith MM, Allis CD (2000), "Mitotic Phosphorylation of Histone H3 Is Governed by Ipl1/aurora Kinase and Glc7/PP1 Phosphatase in Budding Yeast and Nematodes".Cell, 102 (3), p 279-291 Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm 69 Luận văn cao học 21 Jordan MA, Wilson L (2004), "Microtubules as a target for anticancer drugs".Nat Rev Cancer, (4), p 253-265 22 Katayama H, Sen S (2010), "Aurora kinase inhibitors as anticancer molecules".Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms, 1799 (10–12), p 829-839 23 Keen N, Taylor S (2004), "Aurora-kinase inhibitors as anticancer agents".Nat Rev Cancer, (12), p 927-936 24 Khan J, Ezan F, Crémet J-Y, Fautrel A, Gilot D, Lambert M, Benaud C, Troadec M-B, Prigent C (2011), "Overexpression of Active Aurora-C Kinase Results in Cell Transformation and Tumour Formation".PLoS ONE, (10), p e26512 25 Kimura M, Matsuda Y, Yoshioka T, Okano Y (1999), "Cell Cycle-dependent Expression and Centrosome Localization of a Third Human Aurora/Ipl1related Protein Kinase, AIK3".Journal of Biological Chemistry, 274 (11), p 7334-7340 26 Kollareddy M, Dzubak P, Zheleva D, Hajduch M (2008), "Aurora kinases: structure, functions and their association with cancer".Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub, 152(1) (p 27–33 27 Lang Q, Zhang H, Li J, Xie F, Zhang Y, Wan B, Yu L (2010), "3Hydroxyflavone inhibits endogenous Aurora B and induces growth inhibition of cancer cell line".Molecular Biology Reports, 37 (3), p 1577-1583 28 Li X, Sakashita G, Matsuzaki H, Sugimoto K, Kimura K, Hanaoka F, Taniguchi H, Furukawa K, Urano T (2004), "Direct Association with Inner Centromere Protein (INCENP) Activates the Novel Chromosomal Passenger Protein, Aurora-C".Journal of Biological Chemistry, 279 (45), p 4720147211 29 Li Y, Zhang Z-F, Chen J, Huang D, Ding Y, Tan M-H, Qian C-N, Resau JH, Kim H, Teh BT (2010), "VX680/MK-0457, a potent and selective Aurora kinase inhibitor, targets both tumor and endothelial cells in clear cell renal cell carcinoma".Am J Transl Res, (3), p 296-308 30 Liebmann JE, Cook JA, Lipschultz C, Teague D, Fisher J, Mitchell JB (1993), "Cytotoxic studies of pacfitaxel (Taxol®) in human tumour cell lines".Br J Cancer, 68 (p 1104-1109 31 Marumoto T, Zhang D, Saya H (2005), "Aurora-A - A guardian of poles".Nat Rev Cancer, (1), p 42-50 Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm 70 Luận văn cao học 32 Meerloo J, Kaspers GL, Cloos J (2011), Cell Sensitivity Assays: The MTT Assay, Humana Press, 33 Meraldi P, Honda R, Nigg EA (2002), "Aurora-A overexpression reveals tetraploidization as a major route to centrosome amplification in p53–/– cells".EMBO Journal, 21(4) (p 483-492 34 Mielke S, Sparreboom A, Mross K (2006), "Peripheral neuropathy: A persisting challenge in paclitaxel-based regimes".European Journal of Cancer, 42 (1), p 24-30 35 Oh W, Lee C-H, Seo J, Chung M, Cui L, Fomum ZT, Kang J, Lee H (2009), "Diacylglycerol acyltransferase-inhibitory compounds from Erythrina senegalensis".Archives of Pharmacal Research, 32 (1), p 43-47 36 Ota T, Suto S, Katayama H, Han Z-B, Suzuki F, Maeda M, Tanino M, Terada Y, Tatsuka M (2002), "Increased Mitotic Phosphorylation of Histone H3 Attributable to AIM-1/Aurora-B Overexpression Contributes to Chromosome Number Instability".Cancer Research, 62 (18), p 5168-5177 37 Pérez-Cadahía B, Drobic B, Davie JR (2009), "H3 phosphorylation: dual role in mitosis and interphaseThis paper is one of a selection of papers published in this Special Issue entitled 30th Annual International Asilomar Chromatin and Chromosomes Conference and has undergone the Journal’s usual peer review process".Biochemistry and Cell Biology, 87 (5), p 695-709 38 Petersen J, Paris J, Willer M, Philippe M, Hagan IM (2001), "The S pombe aurora-related kinase Ark1 associates with mitotic structures in a stage dependent manner and is required for chromosome segregation".Journal of Cell Science, 114 (24), p 4371-4384 39 Prigent C, Dimitrov S (2003), "Phosphorylation of serine 10 in histone H3, what for?".Journal of Cell Science 116 (p 3677-3685 40 Qi G, Ogawa I, Kudo Y, Miyauchi M, Siriwardena BSMS, Shimamoto F, Tatsuka M, Takata T (2007), "Aurora-B expression and its correlation with cell proliferation and metastasis in oral cancer".Virchows Archiv, 450 (3), p 297-302 41 Rahman M, lane A, Swindell A, Bartram S (2006), Introduction to Flow Cytometry, AbD serotec, 42 Roghi C, Giet R, Uzbekov R, Morin N, Chartrain I, Le Guellec R, Couturier A, Doree M, Philippe M, Prigent C (1998), "The Xenopus protein kinase pEg2 associates with the centrosome in a cell cycle-dependent manner, binds to the Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm 71 Luận văn cao học spindle microtubules and is involved in bipolar mitotic spindle assembly".Journal of Cell Science, 111 (5), p 557-572 43 Schumacher JM, Golden A, Donovan PJ (1998), "AIR-2: An Aurora/Ipl1related Protein Kinase Associated with Chromosomes and Midbody Microtubules Is Required for Polar Body Extrusion and Cytokinesis in Caenorhabditis elegans Embryos".The Journal of Cell Biology, 143 (6), p 1635-1646 44 Schumacher JM, Ashcroft N, Donovan PJ, Golden A (1998), "A highly conserved centrosomal kinase, AIR-1, is required for accurate cell cycle progression and segregation of developmental factors in Caenorhabditis elegans embryos".Development, 125 (22), p 4391-4402 45 Slanina H, König A, Claus H, Frosch M, Schubert-Unkmeir A (2011), "Realtime impedance analysis of host cell response to meningococcal infection".Journal of Microbiological Methods, 84 (1), p 101-108 46 Slattery SD, Mancini MA, Brinkley BR, Hall RM (2009), "Aurora-C kinase supports mitotic progression in the absence of Aurora-B".Cell Cycle, (18), p 2986-2997 47 Smith SL, Bowers NL, Betticher DC, Gautschi O, Ratschiller D, Hoban PR, Booton R, Santibanez-Koref MF, Heighway J (2005), "Overexpression of aurora B kinase (AURKB) in primary non-small cell lung carcinoma is frequent, generally driven from one allele, and correlates with the level of genetic instability".Br J Cancer, 93 (6), p 719-729 48 Sorrentino R, Libertini S, Pallante PL, Troncone G, Palombini L, Bavetsias V, Spalletti-Cernia D, Laccetti P, Linardopoulos S, Chieffi P, Fusco A, Portella G (2005), "Aurora B Overexpression Associates with the Thyroid Carcinoma Undifferentiated Phenotype and Is Required for Thyroid Carcinoma Cell Proliferation".Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 90 (2), p 928-935 49 Stöcklein WFM, Behrsing O, Scharte G, Micheel B, Benkert A, Schưßler W, Warsinke A, Scheller FW (2000), "Enzyme kinetic assays with surface plasmon resonance (BIAcore) based on competition between enzyme and creatinine antibody".Biosensors and Bioelectronics, 15 (7–8), p 377-382 50 Stoepel J, Ottey MA, Kurischko C, Hieter P, Luca FC (2005), "The Mitotic Exit Network Mob1p-Dbf2p Kinase Complex Localizes to the Nucleus and Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm 72 Luận văn cao học Regulates Passenger Protein Localization".Molecular Biology of the Cell, 16 (12), p 5465-5479 51 Toda K, Naito K, Mase S, Ueno M, Uritani M, Yamamoto A, Ushimaru T (2012), "APC/C-Cdh1-dependent anaphase and telophase progression during mitotic slippage".Cell Division, (4), p 52 Trott O, Olson AJ (2010), "AutoDock Vina: Improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading".Journal of Computational Chemistry, 31 (2), p 455-461 53 Tyler RK, Shpiro N, Marquez R, Eyers PA (2007), "VX-680 Inhibits Aurora A and Aurora B Kinase Activity in Human Cells".Cell Cycle, (22), p 28462854 54 Vader G, Lens SMA (2008), "The Aurora kinase family in cell division and cancer".Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer, 1786 (1), p 60-72 55 Van Hooser A, Goodrich DW, Allis CD, Brinkley BR, Mancini MA (1998), "Histone H3 phosphorylation is required for the initiation, but not maintenance, of mammalian chromosome condensation".Journal of Cell Science, 111 (23), p 3497-3506 56 Wei Y, Yu L, Bowen J, Gorovsky MA, Allis CD (1999), "Phosphorylation of Histone H3 Is Required for Proper Chromosome Condensation and Segregation".Cell, 97 (1), p 99-109 57 Xie F, Lang Q, Zhou M, Zhang H, Zhang Z, Zhang Y, Wan B, Huang Q, Yu L (2012), "The dietary flavonoid luteolin inhibits Aurora B kinase activity and blocks proliferation of cancer cells".European Journal of Pharmaceutical Sciences, 46 (5), p 388-396 58 Yan X, Cao L, Li Q, Wu Y, Zhang H, Saiyin H, Liu X, Zhang X, Shi Q, Yu L (2005), "Aurora C is directly associated with Survivin and required for cytokinesis".Genes to Cells, 10 (6), p 617-626 Tài liệu Website 59 http://www.janusinfo.se/Beslutsstod/Miljo-och-lakemedel/About-theenvironment-and-pharmaceuticals/About-classification/ Nguyễn Thị Như Trang K20 - Sinh học thực nghiệm 73