Xác định một số đường hóa học và chất bảo quản trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ********** BÙI THỊ MINH THÚY XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐƢỜNG HÓA HỌC VÀ CHẤT BẢO QUẢN TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ********** BÙI THỊ MINH THÚY XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐƢỜNG HÓA HỌC VÀ CHẤT BẢO QUẢN TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) CHUN NGÀNH: HĨA PHÂN TÍCH MÃ SỐ: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS PHẠM THỊ NGỌC MAI Hà Nội – 2014 LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Thị Ngọc Mai, Bộ mơn Hóa phân tích - Khoa Hóa - Trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên Hà Nội giao đề tài tận tình hƣớng dẫn tơi q trình thực đề tài Tơi xin trân trọng cảm ơn Ths.Vũ Thị Trang, CN Đinh Viết Chiến, ban lãnh đạo cán Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc Gia tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình triển khai nghiên cứu đề tài Tôi xin gửi lời trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng sau đại học thầy giáo, giáo Khoa Hóa học - Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội tận tình dạy dỗ, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành nội dung học tập thực đề tài thuận lợi Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Sở Y tế Thái Bình, Ban lãnh đạo tồn thể cán Khoa Xét nghiệm - Trung tâm Y tế Dự phịng Thái Bình tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu Cuối xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè ln bên cạnh động viên hai năm học tập trình làm luận văn Hà Nội, ngày tháng năm Học viên Bùi Thị Minh Thúy MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN .3 1.Giới thiệu chung chất bảo quản 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Axit benzoic Axit sorbic 1.2 Giới thiệu chung đƣờng hóa học 1.2.1 Định nghĩa 1.2.2 Phân loại: 1.2.3 Acesulfam-K, Aspartam, Saccarin 1.3 Tình hình sử dụng chất bảo quản, đƣờng hóa học thực phẩm 1.4 Giới hạn tồn dƣ tối đa hàm lƣợng chất thực phẩm 10 1.5 Tổng quan phƣơng pháp phân tích 11 1.5.1 Các phƣơng pháp giới 11 1.5.2 Các phƣơng pháp xu hƣớng nghiên cứu nƣớc 15 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Đối tƣợng, nội dung mục tiêu nghiên cứu 17 2.1.1 Đối tƣợng mục tiêu nghiên cứu 17 2.1.2 Nội dung nghiên cứu 17 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 18 2.2.1 Nguyên tắc chung HPLC 18 2.2.2 Pha tĩnh HPLC 19 2.2.3 Pha động HPLC 20 2.2.4 Các loại detector HPLC 20 2.2.5 Một số đại lƣợng đặc trƣng HPLC 22 2.2.6 Phân tích định tính định lƣợng HPLC 23 2.3 Hóa chất dụng cụ dùng nghiên cứu 24 2.3.1 Hóa chất 24 2.4 Chuẩn bị dung dịch hóa chất 25 2.4.1 Pha dung dịch chuẩn gốc 25 2.4.2 Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc chất phân tích 100 µg/ml 25 2.4.3 Pha thuốc thử 25 2.4.4 Pha dung dịch đệm 26 2.5 Mẫu phân tích 26 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Tối ƣu hóa điều kiện chạy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 27 3.1.1 Lựa chọn cột tách 27 3.1.2 Xác định bƣớc sóng phát cho chất phân tích sử dụng detector PDA 27 3.1.3 Khảo sát pH pha động 29 3.1.4 Khảo sát nồng độ dung dịch đệm pha động 30 3.1.5 Khảo sát tốc độ pha động 32 3.1.6 Khảo sát thành phần pha động 34 3.1.7 Khảo sát chƣơng trình gradient pha động 36 3.2 Tối ƣu qui trình xử lý mẫu 39 3.2.1 Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ đến trình thủy phân 41 3.2.2 Khảo sát ảnh hƣởng thời gian đến trình thủy phân 42 3.3 Đánh giá phƣơng pháp phân tích 43 3.3.1 Độ phân giải 43 3.3.2 Lập đƣờng chuẩn 44 3.3.3 Giới hạn phát (LOD), giới hạn định lƣợng (LOQ) phƣơng pháp 46 3.3.4 Đánh giá độ chụm (độ lặp lại) độ (độ thu hồi) 47 3.3.5 Kết chƣơng trình thử nghiệm thành thạo tiêu axit benzoic axit sorbic 50 3.4 Ứng dụng phân tích mẫu thực tế 50 3.4.1.Kết phân tích mẫu (có đánh giá độ thu hồi) 51 3.4.2 Kết phân tích mẫu giám sát 53 KẾT LUẬN .56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC 62 MỤC LỤC BẢNG Bảng 1.1 Thông tin chung chất bảo quản Bảng 1.2 Thơng tin chung đƣờng hóa học Bảng 3.1 Ảnh hƣởng pH pha động tới thời gian lƣu chất phân tích 29 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng nồng độ pha động tới thời gian lƣu chất phân tích 31 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng tốc độ pha động đến thời gian lƣu chất phân tích 33 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng tốc độ pha động đến độ phân giải 34 Bảng 3.5 Thời gian lƣu số chất bảo quản đƣờng hóa học .35 thành phần pha động khác 35 Bảng 3.6.Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân chất phân tích 41 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng thời gian đến hiệu suất thủy phân chất phân tích .42 Bảng 3.8 Độ phân giải pic liền kề 44 Bảng 3.9 Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ 45 Bảng 3.10 Giới hạn phát giới hạn định lƣợng chất phân tích .47 Bảng 3.11 Diện tích pic hỗn hợp chất nghiên cứu 48 mức thêm chuẩn khác 48 Bảng 3.12 Kết độ lặp lại độ thu hồi phƣơng pháp 49 Bảng 3.13 Độ thu hồi chất mẫu nƣớc mắm 51 Bảng 3.14 Độ thu hồi chất mẫu ô mai 52 Bảng 3.15 Độ thu hồi chất mẫu nƣớc mắm, mẫu ô mai 52 Bảng 3.16 Kết phân tích số mẫu ruốc thịt lợn 53 phát có sử dụng natribenzoat 53 Bảng 3.17 Kết phân tích số mẫu mai phát có sử dụng 54 natribenzoat, saccarin 54 MỤC LỤC HÌNH Hình 2.1 Sơ đồ hệ thống sắc ký lỏng 18 Hình 2.2 Sơ đồ detector Diode array 21 Hình 3.1 Sắc đồ tách đƣờng hóa học chất bảo quản cột Anion, nhiệt độ 400C 27 Hình 3.2 Phổ hấp thụ Aspartam, Axit benzoic, Axit sorbic, Acesulfam K ,saccarin.28 Hình 3.3 Ảnh hƣởng pH pha động tới thời gian lƣu chất phân tích 29 Hình 3.4 Ảnh hƣởng nồng độ pha động tới thời gian lƣu chất phân tích 31 Hình 3.5 Sắc đồ khảo sát chất phân tích với nồng độ pha động NaH2PO4 5mM (pH=8,2) bƣớc sóng 210nm 31 Hình 3.6 Sắc đồ khảo sát chất phân tích với tốc độ dịng pha động 32 1,5 ml/phút bƣớc sóng 210nm 32 Hình 3.7 Sắc đồ khảo sát chất phân tích với tốc độ dịng pha động 33 1,2 ml/phút bƣớc sóng 210nm 33 Hình 3.8 Sắc đồ khảo sát chất phân tích với tốc độ dịng pha động 33 1,0 ml/phút bƣớc sóng 210nm 33 Hình 3.9 Sắc đồ khảo sát chất phân tích 20 µg/ml với thành phần pha động đệm NaH2PO4 : ACN = 95:5 bƣớc sóng 210nm 35 Hình 3.10 Sắc đồ khảo sát chất phân tích theo chƣơng trình gradient 36 Hình 3.11 Sắc đồ khảo sát chất phân tích theo chƣơng trình gradient 37 Hình 3.12 Sắc đồ khảo sát chất phân tích theo chƣơng trình gradient 37 Hình 3.13 Sắc đồ khảo sát chất phân tích theo chƣơng trình gradient 38 Hình 3.14 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân 41 Hình 3.15 Ảnh hƣởng thời gian đến hiệu suất thủy phân 42 Hình 3.16 Sắc đồ hỗn hợp chất 50 µg/ml bƣớc sóng 210nm 44 Hình 3.17 Đƣờng chuẩn Aspartam theo diện tích pic 45 Hình 3.18 Đƣờng chuẩn Axit Sorbic theo diện tích pic 45 Hình 3.19 Đƣờng chuẩn Axit Benzoic theo diện tích pic 45 Hình 3.20 Đƣờng chuẩn Acesulfam-K theo diện tích pic 45 Hình 3.21 Đƣờng chuẩn Saccarin theo diện tích pic 46 Hình 3.22 Sắc đồ phân tích mẫu nƣớc mắm thêm dung dịch chuẩn 51 axit sorbic, axit benzoic, acesulfam-K 51 Hình 3.23 Sắc đồ phân tích mẫu mai thêm dung dịch chuẩn 52 Aspartam, Acesulfam-K, Saccarin 52 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ace-K Acesulfam-K ACN Acetonitril AOAC Association of Analytical Communities (Hiệp hội phân tích hợp tác) Asp Aspartam A.Ben Axit Benzoic A.Sor Axit Sorbic BYT Bộ Y tế CE Điện di mao quản HPLC High-pressure liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao ) INS International Numbering System (Hệ thống đánh số quốc tế) KPH Không phát LOD Giới hạn phát LOQ Giới hạn định lƣợng PDA Photodiode array Sac Saccarin TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam UPLC Sắc ký lỏng siêu hiệu suất UV-VIS Quang phổ hấp thụ phân tử * Đối với mẫu mai, xí muội: Trong đợt giám sát năm 2013 với tổng số 46 mẫu đƣợc lấy Hà Nội, Thái Nguyên, Hà Nam, Bắc Ninh, Ninh Bình, Nam Định, Bắc Giang, Thái Bình, Lạng Sơn, Lào Cai có 3/46 mẫu (6,5%) mẫu phát có sử dụng natribenzoat, 20/46 mẫu (43,5%) mẫu phát sử dụng Saccarin Kết phân tích mẫu phát có sử dụng natribenzoat, saccarin đƣợc thể bảng sau: Bảng 3.17: Kết phân tích số mẫu mai phát có sử dụng natribenzoat, saccharin STT Tên mẫu Hàm lƣợng (mg/kg) Địa điểm lấy QĐ Bộ Natri QĐ Bộ Y tế benzoat Y tế 312 200 KPH 1000 Thái Nguyên 569 200 KPH 1000 Hà Nội 132 200 KPH 1000 Hà Nội 45 200 KPH 1000 200 1000 200 KPH KPH mẫu Saccarin Thái Nguyên Ô mai mơ gừng Nam Định Thái Bình 570 2530 Hà Nội KPH 200 101 1000 Hà Nội 2561 200 KPH 1000 Bắc Ninh 123 200 KPH 1000 Ninh Bình 145 200 KPH 1000 Hà Nam 850 200 341 1000 Bắc Ninh 37,61 200 KPH 1000 Hà Nội 200 1000 200 KPH 953 10 Ô mai mơ xào Ơ mai mơ Ơ mai mơ xí muội 11 12 Ô mai Đào 13 1000 14 Ô mai quất Hà Nội 32 KPH 15 Ơmai gừng Ninh Bình 141 200 KPH 1000 16 Ơmai mận Ninh Bình 3429 200 KPH 1000 1000 17 18 19 Ô mai mơ mận Ô mai mận xào chua Hà Nội 63 200 KPH 1000 Nam Định 49 200 KPH 1000 Bắc Ninh 136 200 KPH 1000 1590 200 KPH 1000 100 200 KPH 1000 57 200 KPH 1000 20 Ô mai mận xào 21 Ô mai khế xào Lạng Sơn Nam Định 22 Ômai sấu Hà Nội Từ kết bảng 3.18, chúng tơi nhận thấy: có 3/3 mẫu mai xí muội phát có sử dụng Natri benzoat nhƣng nằm giới hạn cho phép 8/20 mẫu mai xí muội phát có sử dụng chất tạo saccarin có hàm lƣợng saccarin vƣợt giới hạn cho phép (theo Thông tƣ 27/2012/TT-BYT) Qua kết xác định mẫu thực theo chƣơng trình giám sát chất lƣợng thực phẩm cho thấy có qui định chặt chẽ hàm lƣợng chất bảo quản đƣờng hóa học đƣợc phép sử dụng nhƣng natribenzoat saccarin đƣợc sử dụng phổ biến loại mẫu đƣợc phân tích (đặc biệt mẫu mai) có hàm lƣợng vƣợt giới hạn cho phép từ 1,6 đến 17 lần so với tiêu chuẩn cho phép KẾT LUẬN Qua nghiên cứu điều kiện thực nghiệm nhằm ứng dụng kỹ thuật phân tích HPLC sử dụng cột anion với detector PDA để xác định số đƣờng hóa học chất bảo quản thực phẩm, thu đƣợc số kết sau đây: Khảo sát chọn đƣợc điều kiện phù hợp cho việc xác định hàm lƣợng aspartam, axit sorbic, axit benzoic, acesulfam K, saccarin có mẫu thực phẩm kỹ thuật HPLC với detector PDA: cột tách anion, bƣớc sóng phát chất phân tích sử dụng detector PDA Aspartam, saccarin 210 nm; Axit benzoic Acesulfam K 225 nm; Axit sorbic 254 nm; pha động: kênh A dung dịch NaH2PO4 5mM (pH=8,2), kênh B acetonitril; chƣơng trình rửa giải gradient, tốc độ dịng 1ml/phút Đã tìm đƣợc điều kiện tối ƣu (nhiệt độ thủy phân: 500C, thời gian thủy phân: 30 phút) cho trình thủy phân mẫu với đối tƣợng thực phẩm Xây dựng đƣờng chuẩn xác định chất phân tích khoảng 2100µg/ml, đƣờng chuẩn có hệ số tƣơng quan R>0,999 Giới hạn phát phƣơng pháp acid benzoic, acid sorbic mg/l (mg/kg); aspartam, acesulfam K, saccarin mg/l (mg/kg); độ lặp lại độ thu hồi đạt yêu cầu AOAC Độ phân giải (R) tính đƣợc từ 1,04 - 2,7 Ứng dụng phƣơng pháp để phân tích hàm lƣợng natribenzoat, saccarin mẫu ruốc thịt lợn, mẫu mai xí muội theo chƣơng trình giám sát chất lƣợng cho thấy: 6/6 mẫu phát sử dụng natri benzoat vƣợt giới hạn cho phép 49 mẫu ruốc thịt lợn xét nghiệm; có 0/3 mẫu phát có sử dụng natri benzoat 8/20 mẫu phát có sử dụng chất tạo saccarin có hàm lƣợng saccarin vƣợt giới hạn cho phép tổng số 46 mẫu ô mai xét nghiệm Tiến hành phân tích dạng mẫu: mẫu lỏng (mẫu nƣớc mắm) mẫu rắn (ô mai) để đánh giá độ thu hồi Kết cho thấy độ thu hồi chất phân tích từ 92,2-104,0% Từ kết thu đƣợc nhận thấy phƣơng pháp HPLC sử dụng cột anion với detector PDA phù hợp cho việc xác định đồng thời hàm lƣợng axit benzoic, axit sorbic, acesulfam K, aspartam, saccarin thực phẩm Phƣơng pháp công cụ hữu hiệu để tra, kiểm định chất lƣợng sản phẩm phục vụ lĩnh vực an toàn thực phẩm bảo vệ sức khỏe ngƣời tiêu dùng TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bộ Y tế (2010)- QCVN 4-12:2010/BYT ngày 22/12/2010-Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia phụ gia thực phẩm-chất bảo quản Bộ Y tế (2010)- QCVN 8-12:2010/BYT ngày 25/5/2010-Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia phụ gia thực phẩm-chất tổng hợp Bộ Y tế (2012)- Thông tƣ số 27/2012/TT-BYT ngày 30/11/2012 Bộ Y tế, Thông tư hướng dẫn việc quản lý phụ gia thực phẩm Nguyễn Thuần Anh (2012), “Thận trọng sử dụng sản phẩm có chứa Aspartam”, Tạp chí thuốc sức khỏe, số 447, tr.14-15 Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xn Trung (2007), Hóa học phân tích, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Lê Hoàng (2006), Xác định phụ gia thực phẩm phương pháp sắc lý lỏng hiệu cao, Luận văn thạc sĩ khoa học, Khoa Hóa học, Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội Nguyễn Văn Ri (2011), Các phương pháp tách , Tài liệu dùng cho học viên cao học, Bộ mơn Hóa Phân Tích, Khoa Hóa Học, trƣờng đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội TCVN 6428:2007, Xác định hàm lượng axit benzoic - Phương pháp quang phổ TCVN 8122:2009, Xác định hàm lượng axit benzoic axit sorbic - Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 10 TCVN 8471:2010, Thực phẩm-Xác định acesulfame-K, aspartame saccharin- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 11 Tạ Thị Thảo (2010), Giáo trình mơn học Thống kê Hóa phân tích 12 Nguyễn Duy Thịnh (2004), Các chất phụ gia dùng sản xuất thực phẩm, Bài giảng sử dụng cho học viên cao học ngành công nghiệp thực phẩm Trƣờng Đại học Bách khoa Hà nội, Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm 13 Viện kiểm nghiệm ATVSTP Quốc Gia (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội TIẾNG ANH 14 Agata Zygler, Andrzej Wasik, Jacek Namies´nik, (2009), “Analytical methodologies for determination of artificial sweeteners in foodstuffs”, Trends in Analytical Chemistry, Vol 28, No 9, page 1082-1102 15 Agata Zygler & Andrzej Wasik & Agata Kot-Wasik & Jacek Namieśnik (2011), “Determination of nine high-intensity sweeteners in various foods by highperformance liquid chromatography with mass spectrometric detection”, Anal Bioanal Chem, 400, page 2159–2172 16 Ana Beatriz Bergamo, José Alberto Fracassi da Silva, Dosil Pereira de Jesus (2011), “Simultaneous determination of aspartame, cyclamate, saccharin and acesulfame-K in soft drinks and tabletop sweetener formulations by capillary electrophoresis with capacitively coupled contactless conductivity detection”, Food Chemistry 124, page 1714–1717 17 C.M Lino, A Pena, (2010), “Occurrence of caffeine, saccharin, benzoic acid and sorbic acid in soft drinks and nectars in Portugal and subsequent exposure assessment”, Food Chemistry, 121, page 503508 18 E Cubuk Demiralay, G.Oăzkan,&, Z.Guzel-Seydim (2006), “Isocratic Separation of Some Food Additives by Reversed Phase Liquid Chromatography”, Chromatographia, 63, page 91-96 19 Fatma Turak , Mahmure Üstün Özgür , and Abdürrezzak Bozdogan (2009), “PLS-UV Spectrophotometric Method for the Simultaneous Determination of Ternary Mixture of Sweeteners (Aspartame, Acesulfame-K and Saccharin) in Commercial Products”, Innovations in Chemical Biology, p.305-311 20 J.F Garc´ıa-Jim´enez, M.C Valencia, L.F Capit´an-Vallvey, (2007), “Simultaneous determination of antioxidants, preservatives and sweetener additives in food and cosmetics by flow injection analysis coupled to a monolithic column”, Analytica Chimica Acta, 594, page 226–233 21 Li Xiu-Qin, Ji Chao, Yong Wei, Ling Yun, Yang Min-Li, Chu Xiao-Gang (2008), “UPLC-PDAD Analysis for Simultaneous Determination of Ten Synthetic Preservatives in Foodstuff”,Chromatographia, 68, page 57–63 22 Maja SERDAR and Zorka KNEŽEVIĆ,(2011),“Determinatinon of artificial sweeterners in beverages and special nutritional products using high performance liquid chromatography”, Arh Hig Rada Toksikol 2011;62:169-173 23 Miguel A Cantarelli , Roberto G Pellerano , Eduardo J Marchevsky , José M Camiña a, (2009), “Simultaneous determination of aspartame and acesulfame-K by molecular absorption spectrophotometry using multivariate calibration and validation by high performance liquid chromatography”, Food Chemistry, 115, page 1128–1132 24 Natalia E Llamas & María S Di Nezio & Miriam E Palomeque & Beatriz S Fernández Band (2008), “Direct Determination of Saccharin and Acesulfame-K in Sweeteners and Fruit Juices Powders”, Food Anal Methods, 1:43–48 25 N Dossi, R Toniolo, S Susmel, A Pizzariello, G Bontempelli (2006), “Simultaneous RP-LC Determination of Additives in Soft Drinks”, Chromatographia, 63, page 557-562 26 Qing-Chuan Chen, Jing Wang, (2001), “Simultaneous determination of artificial sweeteners, preservatives,caffeine, theobromine and theophylline in food and pharmaceutical preparations by ion chromatography”, Journal of Chromatography A, 937, page 57–64 27 Richard A Frazier, Elizabeth L Inns, Nicolo Dossi, Jennifer M Ames, Harry E Nursten (2000), “Development of a capillary electrophoresis method for the simultaneous analysis of artificial sweeteners, preservatives and colours in soft drinks”, Journal of Chromatography A, 876, page 213–220 28 Tenghao Liu & Zi-Tao Jiang & Rong Li & Jin Tan (2013), “Simultaneous Determination of Cyclamate, Acesulfame,and Aspartame in Beverages by Titania-Based RP-HPLC”, Food Anal Methods, DOI 10.1007/s12161-0139762-x 29 Yan Zhua, Yingying Guoa, Mingli Ye, Frits S James (2005), “Separation and simultaneous determination of four artificial sweeteners in food and beverages by ion chromatography”, Journal of Chromatography A, 1085, p.143–146 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Một số sắc đồ khảo sát tối ƣu hóa điều kiện sắc ký 1.Khảo sát pH pha động (Chuẩn hỗn hợp chất 20 µg/ml) Sac/77.282/1995720 20 Ace-K/47.537/484652 30 A.Ben/17.240/881119 Asp/5.327/468492 40 A.Sor/10.276/882439 mAU 50 210nm,4nm (1.00) 10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Tại pH = 8,2 Sac/66.074/6489 20 Ace-K/41.051/2831 30 A.Ben/15.341/12842 Asp/5.472/12626 40 A.Sor/9.225/19137 mAU 210nm4nm (1.00) 10 0 10 20 30 40 50 60 70 20 Sac/69.311/6852 30 Ace-K/42.665/3113 Asp/5.820/13590 40 A.Ben/15.808/14171 mAU 210nm4nm (1.00) A.Sor/9.545/23088 Tại pH = 9,0 10 -10 10 20 30 40 Tại pH = 9,5 50 60 70 Khảo sát nồng độ pha động (Chuẩn hỗn hợp chất 20 µg/ml)-Pha động: 90 % NaH2PO4 (pH= 8,2) 10% ACN mAU 210nm4nm (1.00) 35 10 Ace-K/43.545 15 A.Ben/20.108 20 A.Sor/12.699 Asp/5.229 25 Sac/57.124 30 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 Nồng độ pha động NaH2PO4 mM 60.0 mAU 50 210nm4nm (1.00) 45 40 20 15 Sac/46.289 25 Ace-K/34.951 30 /16.229 Asp/4.643 A.Sor/10.323 35 10 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 Nồng độ pha động NaH2PO4 2,5 mM 50.0 mAU 40 210nm4nm (1.00) Ace-K/21.731 10 A.Ben/10.266 Asp/3.525 A.Sor/6.662 20 Sac/28.601 30 -10 -20 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 Nồng độ pha động NaH2PO4 7,5 mM 30.0 27.5 mAU 210nm4nm (1.00) 50 Ace-K/19.791 20 Sac/26.001 30 A.Ben/9.332 Asp/3.303 A.Sor/6.086 40 10 -10 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 Nồng độ pha động NaH2PO4 10 mM Khảo sát thành phần pha động (chuẩn hỗn hợp chất 20 µg/ml) mAU 80 210nm,4nm (1.00) 40 30 Ace-K/36.751 Asp/5.216 50 A.Ben/16.857 A.Sor/10.692 60 Sac/48.528 70 20 10 -10 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 Thành phần pha động: 90 % NaH2PO4 5mM - 10% ACN mAU 210nm4nm (1.00) 20 Ace-K/31.344 30 A.Ben/15.290 Asp/4.929 A.Sor/9.849 40 Sac/38.785 50 10 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 Thành phần pha động: 85 % NaH2PO4 5mM - 15% ACN mAU 210nm,4nm (1.00) 100 25 Sac/24.431 Ace-K/20.904 A.Ben/12.131 A.Sor/8.265 50 Asp/4.270 75 -25 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 Thành phần pha động: 80 % NaH2PO4 5mM - 20% ACN Phụ lục 2: Sắc đồ khảo sát điều kiện tối ƣu xử lý mẫu 1.Khảo sát nhiệt độ ảnh hƣởng đến trình thủy phân mAU 210nm,4nm (1.00) 50 25 Sac/28.573/1894806 75 Ace-K/24.611/476039 Asp/6.960/635381 100 A.Ben/15.766/1496338 A.Sor/11.697/1160546 125 -25 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 Sắc đồ phân tích mẫu thủy phân nhiệt độ 400C mAU 210nm,4nm (1.00) 50 25 Sac/28.543/1872708 75 Ace-K/24.606/498669 Asp/6.962/636515 100 A.Ben/15.777/1375308 A.Sor/11.697/1221642 125 -25 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 Sắc đồ phân tích mẫu thủy phân nhiệt độ 500C mAU 210nm,4nm (1.00) 50 25 Sac/28.571/1811407 Asp/6.966/620736 75 Ace-K/24.625/477795 100 A.Ben/15.767/1359662 A.Sor/11.674/1081805 125 -25 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 Sắc đồ phân tích mẫu thủy phân nhiệt độ 600C 30.0 25 Ace-K/24.803/448321 50 A.Ben/15.812/1509684 Asp/6.939/604622 75 A.Sor/11.734/1256596 100 Sac/28.900/1753416 mAU 210nm4nm (1.00) -25 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 Sắc đồ phân tích mẫu thủy phân nhiệt độ 700C mAU 210nm,4nm (1.00) 50 25 Sac/28.531/1876597 Asp/6.959/609739 75 Ace-K/24.609/514963 100 A.Ben/15.770/1365204 A.Sor/11.690/1176968 125 -25 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 Sắc đồ phân tích mẫu thủy phân nhiệt độ 800C 2.Khảo sát thời gian ảnh hƣởng đến trình thủy phân mAU 150 210nm4nm (1.00) 125 25 Sac/27.087/940163 50 Ace-K/23.497/242547 A.Sor/11.377/558499 Asp/6.471/272275 75 A.Ben/15.193/674607 100 -25 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 30.0 Sắc đồ phân tích mẫu thủy phân 10 phút mAU 210nm4nm (1.00) 125 25 Sac/27.076/849781 50 Ace-K/23.514/225546 A.Sor/11.378/557316 Asp/6.474/271327 75 A.Ben/15.185/744483 100 -25 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 Sắc đồ phân tích mẫu thủy phân 20 phút mAU 150 210nm4nm (1.00) 125 25 Sac/27.121/996836 50 Ace-K/23.556/272828 A.Sor/11.430/588584 Asp/6.458/286215 75 A.Ben/15.226/753568 100 -25 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 Sắc đồ phân tích mẫu thủy phân 30 phút mAU 150 210nm4nm (1.00) 125 25 Sac/27.117/992824 50 Ace-K/23.574/259295 A.Sor/11.393/587309 Asp/6.482/277209 75 A.Ben/15.205/739705 100 -25 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 Sắc đồ phân tích mẫu thủy phân 40 phút mAU 150 210nm4nm (1.00) 125 25 Sac/27.098/1002054 50 Ace-K/23.544/254310 A.Sor/11.392/563693 Asp/6.476/274573 75 A.Ben/15.214/640884 100 -25 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 Sắc đồ phân tích mẫu thủy phân 50 phút mAU 150 210nm4nm (1.00) 125 25 Sac/27.095/996331 50 Ace-K/23.529/261867 A.Sor/11.394/589382 Asp/6.471/278585 75 A.Ben/15.191/800343 100 -25 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 Sắc đồ phân tích mẫu thủy phân 60 phút Phụ lục 3: Một số sắc đồ phân tích mẫu thực (mẫu giám sát) mAU 225nm4nm (1.00) A.Ben/18.708/1059984 30 25 20 15 10 -5 -10 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 Sắc đồ phân tích mẫu ruốc thịt lợn-Hà Nam mAU 50 225nm4nm (1.00) A.Ben/18.025/681142 40 30 20 10 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 Sắc đồ phân tích mẫu ruốc thịt lợn-Hà Nội mAU 225nm4nm (1.00) 25 A.Ben/18.127/218526 20 15 10 -5 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 Sắc đồ phân tích mẫu mai quất-Hà Nội Phụ lục 4: Kết đánh giá tiêu axit benzoic, axit sorbic chƣơng trình kiểm nghiệm liên phòng