Định lượng Stipuleanosid R2 trong thân rễ sâm vũ diệp ( Panax bipinnatifidus seem.) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

U VN HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI rm ac Ph a DƯƠNG THỊ PHƯỢNG y, KHOA Y DƯỢC ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 TRONG THÂN an d RỄ SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.) Me dic ine BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Co py rig ht @ Sc ho ol of KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2018 U VN ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI rm ac Ph a DƯƠNG THỊ PHƯỢNG y, KHOA Y DƯỢC an d ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 TRONG THÂN RỄ SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.) ine BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG of Me dic HIỆU NĂNG CAO ho ol KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2013.Y ThS NGUYỄN THỊ HOÀNG ANH Co py rig ht @ Sc Người hướng dẫn: TS NGUYỄN HỮU TÙNG Hà Nội - 2018 U LỜI CẢM ƠN VN Trong suốt trình nghiên cứu hồn thành khóa luận này, tơi nhận rm ac y, nhiều giúp đỡ vô quý báu thầy cô giáo Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội với gia đình bạn bè Thời điểm hồn thành khóa luận lúc tơi xin phép bày tỏ lịng biết ơn chân thành với người dạy dỗ, hướng dẫn, dìu dắt giúp đỡ tơi suốt thời gian qua Trước hết, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới giáo viên hướng dẫn TS Nguyễn Hữu Tùng - Khoa Y dược, Đại học Quốc gia Hà Nội - người thầy Ph a dành nhiều thời gian tâm huyết hướng dẫn, giúp đỡ động viên trình thực đề tài Tơi xin gửi lời cảm ơn tới ThS Nguyễn Thị Hồng an d Anh ln dành thời gian hướng dẫn động viên tơi q trình hồn thiện khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm Khoa, thầy cô ine Khoa Y Dược đặc biệt Bộ mơn Hóa dược Kiểm nghiệm thuốc ln tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa luận dic Tơi xin cảm ơn tập thể lớp Dược học khóa QH.2013.Y, đặc biệt bạn Thùy, Phương, Chuyên đồng hành với suốt thời gian qua Tôi of Me xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thành viên nhóm nghiên cứu tơi chị Thủy chị Huệ ln giúp đỡ nhiệt tình bảo tơi suốt q trình thực đề tài Co py rig ht @ Sc ho ol Lời cuối cùng, tơi vơ biết ơn gia đình ni dạy, khích lệ sát cánh, giúp tơi có thêm động lực cố gắng để có kết ngày hôm Hà Nội, ngày 30 tháng năm 2018 Sinh viên Dương Thị Phượng VN Acetonitril BuOH Buthanol DAD Detector mảng điốt (Diode array detector) Dd Dung dịch EtOH Ethanol HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High performace liquid chromatography) LOD Giới hạn phát (Limit of Detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation) MeOH Methanol RSD Độ lệch chuẩn tương đối SKĐ Sắc ký đồ SKLM Sắc ký lớp mỏng Sti Stipuleanosid R2 SVD Sâm vũ diệp TB Trung bình TT Thứ tự UV Ultra violete VIS Visible rm ac Ph a an d ine dic Me of ol ho Sc @ ht rig y, ACN py Co U DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT VN U DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng Chương trình dung mơi 18 rm ac Bảng Tính thích hợp hệ thống y, Bảng Sự phù hợp hệ thống để xác định độ tinh khiết 23 24 Bảng Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp 26 Ph a Bảng Kết khảo sát khoảng tuyến tính stipuleanosid R2 Bảng Kết khảo sát độ phương pháp py rig ht @ Sc ho ol of Me dic ine an d Bảng Kết định lượng stipuleanosid R2 thân rễ sâm vũ diệp Co 19 27 28 VN U DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Hình ảnh sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Hình 1.4 Sắc ký đồ chất thông số đặc trưng rm ac Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo stipuleanosid R2 y, Hình 1.2 Các hợp chất tách từ rễ sâm vũ diệp 10 Hình 2.2 Hình ảnh stipuleanosid R2 phân lập 11 Ph a Hình 2.1 Mẫu rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái Sa Pa, Lào Cai vào ngày 15/7/2016 17 Hình 3.2 Sắc ký đồ xác định độ tinh khiết stipuleanosid R2 HPLC 19 Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu trắng 21 dic ine an d Hình 3.1 Sắc ký đồ stipuleanosid R2 phân lập sau phun H2SO4 10% /EtOH 21 Hình 3.5 Sắc ký đồ dung dịch thử 22 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn stipuleanosid R2 24 rig ht @ Sc ho ol of Me Hình 3.4 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn py Co VN U MỤC LỤC y, ĐẶT VẤN ĐỀ rm ac CHƯƠNG - TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP 1.1.1 Tên khoa học .2 Ph a 1.1.2 Đặc điểm thực vật .2 1.1.3 Đặc điểm phân bố sinh thái an d 1.1.4 Thành phần hóa học 1.1.5 Tác dụng dược lý .4 1.1.6 Công dụng 1.2 TỔNG QUAN VỀ STIPULEANOSID R2 ine 1.2.1 Cơng thức hóa học 1.2.2 Tính chất lý hóa dic 1.2.3 Tác dụng sinh học .6 1.2.4 Một số nghiên cứu định lượng stipuleanosid R2 HPLC Me 1.3 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) ho ol of 1.3.1 Nguyên tắc HPLC .6 1.3.2 Một số thông số đặc trưng 1.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích HPLC 1.3.4 Tổng quan nghiên cứu định lượng thành phần hóa học Sâm vũ diệp HPLC CHƯƠNG - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 Sc 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 10 ht @ 2.1.1 Nguyên liệu sâm vũ diệp 10 2.1.2 Chất tinh khiết stipuleanosid R2 .10 2.1.3 Dung mơi, hóa chất 11 2.1.4 Máy móc, dụng cụ 11 rig 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 12 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 Co py 2.3.1 Phương pháp chiết xuất hợp chất 12 2.3.2 Phương pháp định lượng stipuleanosid R2 cao rễ SVD HPLC 13 VN U 2.3.3 Định lượng stipuleanosid R2 cao sâm vũ diệp dược liệu sâm vũ diệp 16 2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 16 y, CHƯƠNG – KẾT LUẬN VÀ BÀN LUẬN 17 rm ac 3.1 KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT CỦA STIPULEANOSID R2 PHÂN LẬP ĐƯỢC 17 3.1.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng 17 3.1.2 Phương pháp HPLC 17 Ph a 3.1.3 Phương pháp đo độ nóng chảy 20 3.2 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 BẰNG HPLC 20 an d 3.2.1 Chương trình sắc ký 20 3.2.2 Thẩm định phương pháp định lượng .20 ine 3.3 ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 TRONG DƯỢC LIỆU SÂM VŨ DIỆP 27 3.4 BÀN LUẬN 28 Co py rig ht @ Sc ho ol of Me dic 3.4.1 Về xây dựng phương pháp định lượng stipuleanosid R2 HPLC 28 3.4.2 Về định lượng stipuleanosid R2 dược liệu cao sâm vũ diệp 29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31 U ĐẶT VẤN ĐỀ VN Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem., họ Nhân sâm - Araliaceae), rm ac y, gọi Trúc tiết nhân sâm, Tam thất xẻ, Sâm hai lần xẻ, Hoàng liên thất vị thuốc quý phân bố Trung Quốc dãy núi Hoàng Liên Sơn Tây Bắc nước ta [3,22] Gần sâm vũ diệp hóa bước đầu trồng thử nghiệm số địa phương Hà Giang, Lào Cai Về mặt y học, sâm vũ diệp sử dụng làm thuốc bổ thành phần số thuốc truyền thống dân tộc vùng núi Tây Bắc [3,22] Theo tài liệu công bố sâm vũ diệp cho Ph a thấy saponin thành phần hoạt chất mang lại tác dụng dược lý giá trị sử dụng dược liệu quý y học Do vậy, việc tập trung nghiên cứu thành an d phần saponin SVD định lượng thành phần có ý nghĩa quan trọng việc ứng dụng dược liệu SVD thực tiễn ine Qua trình tra cứu tài liệu, thấy nước ta có nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng sinh học tác dụng dược lý sâm vũ diệp để phát triển sử dụng dược liệu quý thuộc chi sâm Panax Trên sở đó, thực đề tài nghiên cứu thành phần hóa học thân rễ dic SVD thu hái Sapa, Lào Cai với hợp chất saponin phân lập từ phân đoạn Me buthanol xác định stipuleanosid R2 thành phần saponin có thân rễ SVD [24] Tiếp nối nghiên cứu trên, thực đề tài “Định lượng ho ol of stipuleanosid R2 thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao” Kết đề tài sở cho việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm tra chất lượng dược liệu sâm vũ diệp phục vụ việc quản lý chất lượng dược liệu thị trường tối ưu hóa quy trình chiết xuất saponin SVD sau rig ht @ Sc Mục tiêu đề tài: Xây dựng phương pháp định lượng stipuleanosid R2 phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Xác định hàm lượng stipuleanosid R2 cao sâm vũ diệp dược liệu sâm vũ diệp thu hái Tây Bắc Đề tài phần đề tài cấp Nhà nước thuộc Chương trình Tây Bắc “Ứng dụng giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên Co py liệu tạo sản phẩm từ hai loài Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.)”, mã số: KHCNTB.07C/13-18 U CHƯƠNG - TỔNG QUAN VN 1.1 TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP 1.1.1 Tên khoa học rm ac y, SVD có tên khoa học Panax bipinnatifidus Seem [3,21], SVD thuộc chi Sâm (Panax L), họ Ngũ gia bì (Araliaceae) [2] 1.1.2 Đặc điểm thực vật Ph a Sâm vũ diệp thân thảo sống nhiều năm, ưa bóng đặc biệt ưa ẩm [3,21] Thân rễ dài có nhiều đốt vết sẹo thân rụng hàng năm để lại Thân khí sinh mảnh, cao 20 - 30 cm, thường đơn độc, mọc thẳng, rỗng giữa, có vạch dọc, thường lụi vào mùa đông, mọc chồi thân từ tháng đến đầu ol of Me dic ine an d tháng dương lịch Lá kép chân vịt, gồm - mọc vòng Lá chét - (ít 3) thn, dài 2,5 - 14 cm, rộng 1,5 - cm, gốc trịn, đầu thn thành mũi nhọn, xẻ thùy khơng đều, mép có cưa, có lơng ho Hình 1.1 Hình ảnh sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.)[3,21] Sc 1.1.3 Đặc điểm phân bố sinh thái Co py rig ht @ Sâm vũ diệp loài sâm mọc tự nhiên phát tương đối sớm nước ta Trong tự nhiên, SVD phân bố dãy núi Hoàng Liên Sơn: huyện Sa Pa, Bát Xát - Lào Cai huyện Than Uyên - Lai Châu Tây Bắc nước ta [3,21,22] Gần sâm vũ diệp nghiên cứu bước đầu trồng thử nghiệm số địa phương Hà Giang, Lào Cai Hiện vùng phân bố SVD bị thu hẹp dần đứng trước nguy tuyệt chủng Do SVD loài dược liệu quý cần bảo tồn gìn giữ để phát triển tương lai Sâm vũ diệp thường mọc rải rác hay tập trung tán rừng ẩm, gần quanh năm có sương mù Hàng năm vào cuối tháng đầu tháng 3, từ phần đầu mầm VN U [35] M Schwarz, B Klier, and H Sievers (2009), "Herbal reference standards", "Planta Med", 75(7), pp 689-703 rm ac y, [36] H F Tang, Y H Yi, Z Z Wang, Y P Jiang, and Y Q Li (1997), "Oleanolic acid saponins from the root bark of Aralia taibaiensis", "Yao Xue Xue Bao", 32(9), pp 685-90 Ph a [37] D Q Wang, J Fan, B S Feng, S R Li, X B Wang, C R Yang, et al (1989), "[Studies on saponins from the leaves of Panax japonicus var bipinnatifidus(Seem.)Wu et Feng]", "Yao Xue Xue Bao", 24(8), pp 593-599 [38] Y Weng, L Yu, J Cui, Y R Zhu, C Guo, G Wei, et al (2014), "Antihyperglycemic, hypolipidemic and antioxidant activities of total an d saponins extracted from Aralia taibaiensis in experimental type diabetic rats", "J Ethnopharmacol", 152(3), pp 553-560 [39] M Xi, C Hai, H Tang, A Wen, H Chen, R Liu, et al (2010), "Antioxidant ine and antiglycation properties of triterpenoid saponins from Aralia taibaiensis traditionally used for treating diabetes mellitus", "Redox Rep", 15(1), pp 20- dic 28 Me [40] WHO (1997), A WHO guide to good manufacturing practice (GMP) requirements - Part 2: Validation, Word Health Organization, Geneva of C Trang web [41] http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/74029835#section=Top Co py rig ht @ Sc ho ol [42] http://www.hmdb.ca/metabolites/HMDB0040855 U PHỤ LỤC VN Phụ lục 01 Phiếu kết giám định mẫu Phụ lục 02 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 – Xây dựng đường hồi y, quy tuyến tính rm ac Phụ lục 03 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 – Xây dựng đường hồi quy tuyến tính Ph a Phụ lục 04 Sắc ký đồ mẫu trắng (MeOH) Co py rig ht @ Sc ho ol of Me dic ine an d Phụ lục 05 Sắc ký đồ cao sâm vũ diệp rig py Co ht @ ol ho Sc of Me ine dic an d y, rm ac Ph a VN U Phụ lục 01 Phiếu kết giám định mẫu U VN Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 – Xây dựng đường hồi quy tuyến tính an d Ph a rm ac y, Phụ lục 02 of Me dic ine Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 nồng độ 15,625 µg/ml Co py rig ht @ Sc ho ol Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 nồng độ 37,5 µg/ml Ph a rm ac y, U VN Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 nồng độ 75 µg/ml ol of Me dic ine an d Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 nồng độ 150 µg/ml Co py rig ht @ Sc ho Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 nồng độ 200 µg/ml Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 nồng độ 300 µg/ml U VN y, rm ac Co py rig ht @ Sc ho ol of Me dic ine an d Ph a Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 nồng độ 400 µg/ml Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 – Kiểm tra tính thích U Phụ lục 03 Co py rig ht @ Sc ho ol of Me dic ine an d Ph a rm ac y, VN hợp hệ thống rig py Co ht @ ol ho Sc of Me ine dic an d y, rm ac Ph a VN U rig py Co ht @ ol ho Sc of Me ine dic an d y, rm ac Ph a VN U rig py Co ht @ ol ho Sc of Me ine dic an d y, rm ac Ph a VN U rig py Co ht @ ol ho Sc of Me ine dic an d y, rm ac Ph a VN U rig py Co ht @ ol ho Sc of Me ine dic an d y, rm ac Ph a VN U rig py Co ht @ ol ho Sc of Me ine dic an d y, rm ac Ph a VN U PHỤ LỤC 04 Sắc ký đồ mẫu trắng (MeOH) rig py Co ht @ ol ho Sc of Me ine dic an d y, rm ac Ph a VN U PHỤ LỤC 05 Sắc ký đồ cao sâm vũ diệp rig py Co ht @ ol ho Sc of Me ine dic an d y, rm ac Ph a VN U