Bài viết khảo sát tác động của chủng H. pylori DN18 phân lập từ bệnh nhân Việt Nam lên sự hoạt động của nhân tố phiên mã NF-κB, một tác nhân điều hòa then chốt của quá trình viêm và sự biểu hiện của các gene đích của nó.
Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ – Khoa học Tự nhiên, 4(2):547-555 Bài nghiên cứu Open Access Full Text Article Khảo sát tác động chủng Helicobacter pylori DN18 phân lập Việt Nam lên hoạt hóa đường NF-κ B H2AX dịng tế bào AGS Phạm Thị Hồng Đào* , Hồ Thị Mỹ Trang, Nguyễn Thụy Vy* TÓM TẮT Use your smartphone to scan this QR code and download this article Bộ môn Di truyền, Khoa Sinh học – Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, ĐHQG-HCM, Việt Nam Nhiễm Helicobacter pylori (H pylori) yếu tố gây tăng nguy phát triển ung thư dày (UTDD) Cơ chế phân tử hình thành UTDD gây H pylori chưa hiểu cách rõ ràng Những nghiên cứu gần cho thấy nhiễm H pylori thúc đẩy trình ung thư thơng qua kích thích q trình viêm gây ổn định gene tế bào biểu mô dày Bên cạnh đó, tác động H pylori lên tế bào chủ liên quan đến độc tố vi khuẩn độc tố có đa dạng vùng địa lý dân tộc Vì vậy, nghiên cứu hướng tới khảo sát tác động chủng H pylori DN18 phân lập từ bệnh nhân Việt Nam lên hoạt động nhân tố phiên mã NF-κ B, tác nhân điều hòa then chốt trình viêm biểu gene đích Hơn nữa, tác động ổn định gene nghiên cứu thơng qua tích lũy đứt gãy mạch đôi DNA (DSB), sử dụng thị phosphoryl hóa protein histone H2AX (γ H2AX) Kết cho thấy chủng DN18 cảm ứng gây viêm tế bào biểu mô dày AGS, thông qua gia tăng hoạt động NF-κ B biểu mức phiên mã chất trung gian gây viêm IL-8, COX-2 Nhiễm chủng DN18 làm tăng phosphoryl hóa γ H2AX tế bào AGS Như vậy, nghiên cứu bước đầu cho thấy khả gây viêm gây tổn thương DNA tế bào chủ vi khuẩn H pylori phân lập từ bệnh nhân Việt Nam Từ khoá: Helicobacter pylori, ung thư dày, viêm, đứt gãy mạch đôi DNA, bất ổn định gen Liên hệ Phạm Thị Hồng Đào, Bộ môn Di truyền, Khoa Sinh học – Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, ĐHQG-HCM, Việt Nam Email: pthdao@hcmus.edu.vn Liên hệ Nguyễn Thụy Vy, Bộ môn Di truyền, Khoa Sinh học – Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, ĐHQG-HCM, Việt Nam Email: ntvy@hcmus.edu.vn Lịch sử • Ngày nhận: 19-3-2020 • Ngày chấp nhận: 18-5-2020 • Ngày đăng: 15-6-2020 DOI : 10.32508/stdjns.v4i2.898 Bản quyền © ĐHQG Tp.HCM Đây báo cơng bố mở phát hành theo điều khoản the Creative Commons Attribution 4.0 International license MỞ ĐẦU Ung thư dày (UTDD) bệnh lý gây tử vong hàng đầu người Theo thống kê Tổ Chức Y Tế Thế Giới (WHO), UTDD đứng thứ ba tỷ lệ tử vong bệnh ung thư gây chết cho 700.000 người năm Trong yếu tố nguy dẫn đến UTDD, nhiễm vi khuẩn Helicobacter pylori (H pylori) WHO xác định yếu tố gây ung thư nhóm I Vi khuẩn H pylori thúc đẩy tế bào biểu mơ hình thành khối u thơng qua nhiều tác động khác Trong đó, tác động gây viêm gây ổn định gene H pylori hai tác động then chốt nghiên cứu nhiều, điều hịa nhiều nhân tố quan trọng q trình hình thành phát triển khối u 2,3 Tác động quan trọng H pylori dẫn tới phản ứng viêm hoạt hóa mức nhân tố phiên mã NF-κ B, dẫn đến tăng biểu bất thường chất trung gian gây viêm tế bào biểu mô tế bào miễn dịch Ở tế bào biểu mô, IL-8 COX-2 hai protein quan trọng đóng vai trị điều biến q trình viêm nhiễm H pylori cytokine IL-6 chứng minh liên quan đến tiến trình hình thành UTDD gây H pylori 5,6 Bên cạnh đó, đặc trưng tế bào UTDD nhiễm H pylori bất ổn định gene Đặc biệt, số nghiên cứu gần cho thấy có gia tăng đáng kể đứt gãy DNA mạch đôi (DSB), nguyên nhân dẫn đến bất ổn định NST tế bào biểu mô dày nhiễm H pylori 7–9 Hơn nữa, chủng H pylori thuộc vùng địa lý khác có đặc điểm kiểu gene khác đa dạng di truyền dẫn đến đa dạng độc lực hay khả tác động lên tế bào chủ chủng H pylori 10 Cho tới nay, chủng H pylori Việt Nam chủ yếu nghiên cứu dịch tễ học có cơng trình cho thấy tác động chủng lên tế bào chủ Vì vậy, nghiên cứu hướng tới mục tiêu khảo sát tác động gây viêm thơng qua hoạt hóa NFκ B, dẫn đến cảm ứng biểu chất trung gian gây viêm IL-8, IL-6 COX-2 mức độ phiên mã chủng H pylori Việt Nam mơ hình dịng tế bào biểu mô dày người AGS Đồng thời, nghiên cứu khảo sát tác động gây đứt gãy mạch đôi DNA thơng qua hoạt hóa H2AX tế bào VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Trích dẫn báo này: Đào P T H, Trang H T M, Vy N T Khảo sát tác động chủng Helicobacter pylori DN18 phân lập Việt Nam lên hoạt hóa đường NF-κB H2AX dòng tế bào AGS Sci Tech Dev J - Nat Sci.; 4(2):547-555 547 Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 4(2):547-555 Vật liệu - Dòng tế bào ung thư biểu mô dày người AGS (ATCC CRL 1739) - Chủng H pylori phân lập từ mẫu sinh thiết dày bệnh nhân viêm dày Việt Nam: DN18 Phương pháp Phân lập xác định kiểu gene cagA, vacA H pylori Mẫu sinh thiết dày nghiền 100 µ l mơi trường Brain Heart Infusion (BHI)(BD), trải đĩa môi trường thạch chọn lọc Columbia (BD) bổ sung 10% máu cừu, 1% iso vitalex (BD) hỗn hợp kháng sinh Skirrow’s selective supplement (SR96) gồm kháng sinh amphotericin, trimethoprim, polymyxin B vancomycin (Sigma Aldrich) Sau - ngày ủ, khuẩn lạc thu định danh thông qua quan sát hình thái thử nghiệm sinh hóa urease Đồng thời, sử dụng phương pháp Mutiplex PCR khuẩn lạc H pylori để xác định kiểu gene cagA, vacA Qui trình PCR cặp mồi cagA, vacA s1/s2 công bố báo Nguyễn Tuấn Anh cộng năm 2010 11 kết hợp với cặp mồi vacA m1/m2 12 Chúng chọn chứng dương DNA gene chủng H pylori 26695 (ATCC 700392, cagA+, s1m1) Tx30A (ATCC 51932, cagA-, s2m2), chứng âm mẫu không chứa H pylori Kết kiểm tra phương pháp điện di gel 5% Các gene độc tố xác định H pylori có kích thước sau: cagA – 349 bp, vacA s1/s2 – 259 bp/286 bp, vacA m1/m2 – 401 bp/476 bp Nuôi cấy H pylori H pylori nuôi đĩa thạch bổ sung 5% máu cừu hỗn hợp kháng sinh SR96, 37o C điều kiện vi hiếu khí, sử dụng hệ thống hộp khí (BD GasPak EZ standard incubation container - 260002) túi khí (BD gaspak ez campy container system sachets - 260680) ngày cấy chuyền qua đĩa thạch máu khác nuôi ngày Cuối cùng, vi khuẩn nuôi lỏng môi trường BHI, bổ sung 10% FBS (Sigma Aldrich) bất hoạt nhiệt 56o C 30 phút hỗn hợp kháng sinh SR96, nuôi lắc 130 vòng/phút 16 37o C điều kiện vi hiếu khí Mật độ vi khuẩn xác định cách đo mật độ quang bước sóng 600nm (1OD600 = 2x108 CFU/ml) 100 µ g/ml treptomycin, 0,5 µ g/ml amphotericin điều kiện 5% CO2 37o C Tất các hóa chất pha mơi trường ni cấy tế bào cung cấp hãng Sigma Aldrich Phương pháp nhiễm H pylori vào tế bào AGS Tế bào AGS cấy vào đĩa nuôi cấy giếng với mật độ 2x105 tế bào/giếng trước nhiễm 24h Dịch vi khuẩn sau nuôi lỏng ly tâm 3200 g 10 phút, 4o C, loại bỏ môi trường BHI, rửa với PBS 1X vi khuẩn hịa mơi trường RPMI 1640 có bổ sung 10% FBS, mM glutamine, khơng có kháng sinh Nhiễm vi khuẩn vào tế bào với MOI 100 tất thử nghiệm Phương pháp biến nạp thử nghiệm luciferase reporter Tế bào AGS cấy đĩa 96 giếng cấy 0,5x104 tế bào/giếng Sau 24 giờ, chúng tơi sử dụng phương pháp hóa biến nạp, sử dụng 0,2 µ l hóa chất TurboFect Transfection Reagent (Thermo) biến nạp hai plasmid pGL4.32 (50 ng) pRL-SV40 (5 ng) cho giếng Sau biến nạp 24h, tiến hành nhiễm vi khuẩn vào tế bào Plasmid pGL4.32 mang gene mã hóa cho enzyme firefly luciferase (luc2P) biểu gene chịu điều khiển nhân tố phiên mã NF-κ B thông qua yếu tố đáp ứng với NF-κ B nằm thượng nguồn gene Plasmid pRL-SV40 mang gene mã hóa enzyme Renilla luciferase (Rluc), có promoter cho phép biểu gene Renilla luciferase tế bào Chúng sử dụng hệ thống Dual-Glo Luciferase Assay (Promega) để phân tích hoạt động luciferase Kết hiển thị cường độ ánh sáng phát mẫu thí nghiệm đo máy Synergy HT Multi-Detection Reader Trong mẫu có hai giá trị: giá trị tương ứng với luciferase firefly (LF) biểu thị cho hoạt động NF-κ B giá trị tương ứng với luciferase Renilla (LR) xem chứng nội dùng để chuẩn hóa hiệu suất biến nạp số lượng tế bào mẫu Số lần thay đổi (n) mức độ hoạt hóa NF-κ B mẫu nhiễm H pylori tính theo cơng thức: LF (1) n = LR LF (2) LR Trong đó: (1): Mẫu nhiễm; (2): Mẫu khơng nhiễm Ni cấy AGS Dịng tế bào AGS ni cấy bám dính mơi trường RPMI 1640 (Hyclone) bổ sung 10% FBS bất hoạt nhiệt, mM glutamine, 100 U/ml penicillin 548 Real-time RT PCR Tế bào AGS thu sau nhiễm 12 24 giờ, sau tách chiết thu RNA tổng số kit RNAspin Mini Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ – Khoa học Tự nhiên, 4(2):547-555 Kit (GE Healthcare) mRNA sau tách chiết phiên mã ngược thành cDNA, sử dụng mồi hexamer, kit Affinity Script RT (Agilent) Phản ứng real-time PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho IL-8, IL-6, COX-2 GADPH, chất phát huỳnh quang EvaGreen (Biotium) Kết thay đổi biểu gene thể qua khác biệt giá trị Ct (threshold Cycle) – chu kỳ phản ánh số DNA diện mẫu thời điểm GADPH sử dụng làm chứng nội, thông tin cặp mồi thể Bảng Giá trị Ct mẫu nhiễm mẫu không nhiễm sử dụng để tính tỷ lệ thay đổi biểu gene Mức độ thay đổi biểu gene tính theo cơng thức: Mức độ thay đổi biểu gene = 2−△△Ct Trong đó: ∆∆Ct=∆Ct(nhiễm) - ∆Ct(khơng nhiễm) ∆Ct=Ct(gene mục tiêu) - Ct(gene chứng nội) Kết số lần thay đổi biểu gene (tăng/giảm) gene mục tiêu mẫu nhiễm so với mẫu khơng nhiễm chuẩn hóa với biểu GADPH Phương pháp Western Blot Sau nhiễm 12, 24 48 giờ, tế bào thu ly giải thu nhận protein tổng biến tính phân tách kích thước gel polyacrilamide Sau đó, protein chuyển lên màng lai cuối phát kháng thể chuyên biệt, sử dụng kháng thể sơ cấp anti-γ -H2AX (sc-517348) anti-β actin (sc-81178), kháng thể thứ cấp anti-mouse-HRP (P0260), sử dụng phần mềm ImageJ để phân tích hình ảnh Nghiên cứu sử dụng protein “giữ nhà” β actin để làm chứng nội chuẩn hóa lượng protein tổng mẫu Công thức định lượng tương đối biểu protein mục tiêu tế bào nhiễm H pylori với tế bào chứng không nhiễm, thu thời điểm giờ: Số lần thay đổi biểu protein γ − H2AX β − actin = γ − H2AX β − actin (1) (2) Với (1): Mẫu nhiễm; (2): Mẫu khơng nhiễm Xử lý phân tích thống kê Các thí nghiệm lặp lại lần độc lập Xử lý thống kê phần mềm Prism5Graph, phương pháp thống kê Student’s t-test chiều, với (*) p-value