Đang tải... (xem toàn văn)
Mục tiêu của nghiên cứu là tiến hành khảo sát các điều kiện nuôi cấy (điều kiện stress) của chủng tảo Dunaliella sp. phân lập được, nhằm tăng sinh khối và khả năng tổng hợp β-carotene. Kết quả thu được cho thấy mật độ tế bào tốt nhất là 2,7 x 106 tế bào/ml và năng suất thu sinh khối khô đạt được khoảng 0,321g/l với nồng độ muối 2M. Mời các bạn tham khảo!
TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 16, SỐ T1 - 2013 Khảo sát khả tạo Beta-carotene chủng vi tảo Dunaliella phân lập Việt Nam • • • • • Huỳnh Hiệp Hùng Lê Thị Thanh Loan Nguyễn Thị Mỹ Lan Lê Thị Mỹ Phước Phạm Thành Hổ Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG-HCM (Bài nhận ngày 20 tháng 03 năm 2013, nhận đăng ngày 30 tháng năm 2013) TÓM TẮT: Beta-carotene sắc tố tự nhiên có khả chống oxy hố cao Nó tiền chất Vitamin A, thúc đẩy cải thiện hệ miễn dịch Hiện nay, chủng tảo Dunaliella xem nguồn sản xuất βcarotene tự nhiên tốt có chứa tỉ lệ cao đồng phân 9-cis-β-carotene, chứng minh có hoạt tính chống oxy hóa tốt nhiều đồng phân all-trans-βcarotene Trong đó, β-carotene tổng hợp chứa đồng phân all-trans-β-carotene Vì vậy, tiến hành nghiên cứu chủng tảo Dunaliella sp phân lập ruộng muối Việt Nam nhằm tìm kiếm chủng tảo có khả ni cấy quy mô công nghiệp Việt Nam tận dụng bờ biển tự nhiên trải dài nước ta Mục tiêu nghiên cứu tiến hành khảo sát điều kiện nuôi cấy (điều kiện stress) chủng tảo Dunaliella sp phân lập được, nhằm tăng sinh khối khả tổng hợp β-carotene Kết thu cho thấy mật độ tế bào tốt 2,7 x 10 tế bào/ml suất thu sinh khối khô đạt khoảng 0,321g/l với nồng độ muối 2M Ngồi ra, ni tảo điều kiện nồng độ muối cao hay thiếu hụt nguồn nitrogen kích thích tăng tích lũy βcarotene tế bào đạt hàm lượng βcarotene khoảng 9% sinh khối khô NaCl 3M Từ khóa: Beta-carotene, Dunaliella, nồng độ muối, thiếu hụt nitrogen, sinh khối khơ MỞ ĐẦU hóa, kích thích tế bào miễn dịch, phối hợp với Beta-carotene đồng phân quan trọng carotenoid, thuộc nhóm sắc tố hữu tự nhiên Nó chuyển hố thành vitamin A thể xem tiền thân tốt vitamin A loại carotenoid Ngoài ra, nhiều nghiên cứu phát nhiều lợi ích khác từ β-carotene, ví dụ đặc tính chống oxy chất chống oxi hố khác vitamin C E để giảm nguy nhiễm trùng, làm chậm q trình lão hố giảm tác hại ánh sáng mặt trời, giảm nguy số bệnh tim mạch ngừa số bệnh ung thư, [4, 5, 8] Trang 43 Science & Technology Development, Vol 16, No.T1 - 2013 Beta-carotene có nhiều dạng đồng phân loại β-carotene tổng hợp chứa đồng phân all-trans-β-carotene Trong đồng phân 9-cis lại thành phần chống oxi hoá chủ yếu β-carotene có βcarotene tự nhiên, thường thấy loại trái rau có màu vàng xanh đậm cà rốt, gấc, bí ngơ, khoai lang, rau ngót… chiếm khoảng 0,001 - 0,01% sinh khối khô (SKK); quan động vật gan cá, trứng,… Một số loài vi sinh vật nấm sợi Blakeslea, nấm men Rhodotorula chứa hàm lượng đáng kể -carotene 0,05-0,2% SKK Ở vi tảo, βcarotene thường chiếm khoảng 0,1% SKK, nhiên, số lồi, chiếm tới 5% SKK (Amphidinium carterae), chí tới 10% SKK (Dunaliella salina) [2, 7, 8] Milko (1963) đề cập đến khả tạo lượng lớn β-carotene Dunaliella sp Sau đó, nhiều nhà khoa học Ben-Amotz Avron (1983), Borowitzka (1988) chứng minh Dunaliella sinh nhiều β-carotene để làm chất bảo vệ cho máy quang hợp điều kiện môi trường bất lợi Các yếu tố môi trường cường độ ánh sáng cao, điều kiện dinh dưỡng giới hạn, nồng độ muối cao nhiệt độ cao tác động đến quang thụ quan cảm nhận ánh sáng hay kênh vận chuyển, làm giảm tính ổn định chúng, qua làm tăng stress oxy hoá nồng độ oxy đơn bội Các stress làm cho tăng trưởng Dunaliella bị giảm lại tăng cường tích luỹ carotenoid [3] Từ đó, nhà khoa học nhận thấy Dunaliella nguồn nguyên liệu chứa β-carotene tự nhiên tốt với đồng phân 9-cis (chiếm 41%), alltrans (42%), 15-cis (10%) đồng phân khác (7%) Chính vậy, từ đầu năm 1960, người ta bắt đầu sản xuất Dunaliella để thu βcarotene tự nhiên, đến cuối năm 1980, việc nuôi trồng Dunaliella salina quy mô công nghiệp bắt đầu triển khai Trang 44 Australia, Israel, Hoa Kì, Trung Quốc, Kuwait, Iran [3, 6, 10] Nhu cầu sử dụng β-carotene giới ngày cao nguồn cung cấp β-carotene chủ yếu từ tổng hợp hóa học (chiếm 84,8%), β-carotene ly trích từ tảo chiếm 8,5% từ thực vật chiếm 6,7% Do đó, việc sản xuất β-carotene từ vi tảo Dunalilella hướng đầy tiềm có khả ứng dụng cao, mở rộng khả cung ứng nguồn βcarotene có hoạt tính tốt, đồng thời tận dụng dải bờ biển dài nước ta cho việc ni trồng lồi vi tảo biển Chúng tơi tiến hành xác định số điều kiện môi trường ảnh hưởng đến tăng trưởng, tích lũy β-carotene chủng vi tảo Dunaliella sp phân lập từ ruộng muối Việt Nam nhằm xác định số điều kiện nuôi cấy phù hợp chủng tảo VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Chủng tảo Dunaliella sp phân lập từ ruộng muối cơng ty nước khống Vĩnh Hảo, Bình Thuận Bộ mơn Cơng nghệ sinh học thực vật Chuyển hóa sinh học thực Bộ mơn Sinh thái – Sinh học tiến hóa định danh theo hình thái Hai mơn thuộc Khoa Sinh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM Phương pháp Ni cấy quan sát hình thái Mơi trường ni cấy có thành phần gồm: KH2PO4 0,035 g/l, MgCl2.6H2O 4,5 g/l, CaCl2.H2O 0,03 g/l, NaHCO3 g/l, Tris g/l, FeCl3.6H2O 0,3 µg, EDTA 1,86 µg Tảo hoạt hóa ống nghiệm chứa 10 ml mơi trường Sau đó, nhân giống 200 ml mơi trường ni cấy để tiến hành khảo sát Dựng đường tương quan tuyến tính OD660nm mật độ tế bào tảo Dunaliella sp Mật TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 16, SỐ T1 - 2013 độ tế bào xác định buồng đếm hồng cầu Khảo sát ảnh hưởng số yếu tố môi trường đến tăng trưởng tích lũy βcarotene tảo Dunaliella sp Tảo Dunaliella sp tiến hành khảo sát loại điều kiện nhà khoa học cho có ảnh hưởng nhiều đến tích lũy β-carotene nồng độ NaCl nguồn nitrogen [6] Trong đó, nguồn nitrogen sử dụng môi trường KNO3 nên loại muối dùng bước khảo sát Ở sử dụng nồng độ NaCl 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 3,0 M hàm lượng KNO3 môi trường 0,25; 0,5; 0,75; 1,0 1,25 g/l Sinh trưởng tảo xác định thông qua giá trị mật độ quang đo bước sóng 660nm (OD660nm); hàm lượng β-carotene sinh khối tảo xác định theo công bố Shaish (1992) [1, 9] Khảo sát lượng β-carotene tích lũy Lấy ml dung dịch tảo, ly tâm 4000 vòng phút, thu cặn Hòa tan cặn với ml dung dịch ethanol: hexane (2: v/v) Thêm ml nước ml hexane, vortex, sau ly tâm 4000 vòng/phút phút Thu lớp dịch hexane chứa sắc tố (lớp bên trên), đem đo OD450nm Hàm lượng β-carotene có ml mẫu phân tích xác định theo cơng thức: OD450nm × 25,2 Xác định hàm lượng β-carotene sau khoảng thời gian ngày nuôi cấy [9] KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Nuôi cấy quan sát hình thái Tảo có xu hướng bám vào thành ống nghiệm trình quang hướng động Quan sát kính hiển vi quang học cho thấy chủng tảo Dunaliella sp có đặc điểm là: dạng đơn bào, nhỏ, di động nhanh, có màu xanh lục, hình tròn, hình trứng hay hình oval, có hai lơng roi dài nhau, đầu có lơng roi thường nhỏ đầu lại (Hình 1) Tảo ni mơi trường ni cấy có nồng độ muối 1,5 M nồng độ KNO3 g/l Hiệu suất thu sinh khối khơ trung bình đạt 0,32 g/l Tế bào tảo Dunaliella A B Hình Dung dịch tảo hoạt hóa (hình A) hình thái tế bào Dunaliella sp buồng đếm hồng cầu quan sát kính hiển vi (400x) (hình B) Ảnh hưởng nồng đ muối đến tăng trưởng tích lũy β-carotene tảo Dunaliella sp Tảo nuôi 60 ngày, tiến hành xác định mật độ tế bào hàm lượng β-carotene tích lũy đạt (Hình 2,3 4) Trang 45 Science & Technology Development, Vol 16, No.T1 - 2013 Hình Đồ thị biểu diễn mật độ tế bào tảo Dunaliella sp theo thời gian với nồng độ muối khác Chủng tảo Dunalilella sp tăng trưởng vào pha log ngày 25 ổn định ngày 45 với mật độ tế bào cao đạt 15,7 106 tế bào/ml nồng độ muối 1,5 M; nồng độ NaCl M thấp NaCl M Hình Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nồng độ muối đến tích lũy β-carotene dung dịch tảo Đối với tích lũy β-carotene sinh khối tảo nồng độ NaCl tốt M với lượng β-carotene thu 18 g/ml (Hình 4) Tuy nhiên, nồng độ NaCl M dù mật độ tế bào đạt thấp hàm lượng β-carotene đạt không khác nhiều so với nồng độ M 1,5 M Từ suy gia tăng nồng độ muối làm tăng tích lũy β-carotene tế bào tảo Dunaliella sp Điều Trang 46 chứng minh rõ hình với lượng β-carotene tích lũy tế bào tảo đạt cao NaCl M đạt 1,9 pg/tế bào thấp nồng độ NaCl M 1,5 M Kết phù hợp với kết nghiên cứu Çelekli A (2006) Zhu Y.H (2008), nồng độ NaCl tốt cho tăng trưởng 2M để tích luỹ β-carotene 3M (hàm lượng β-carotene đạt khoảng 25 g/ml) TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 16, SỐ T1 - 2013 Hình Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nồng độ muối đến tích lũy β-carotene tế bào tảo Ảnh hưởng nồng đ nitrogen đến tăng trưởng tích lũy β-carotene tảo Dunaliella sp Tiến hành xác định mật độ tế bào hàm lượng β-carotene tích lũy tảo 60 ngày nuôi cấy Kết đạt thể Hình 5,6 Hình Đồ thị biểu diễn mật độ tế bào tảo Dunaliella sp theo thời gian với nồng độ KNO khác Chủng tảo Dunalilella sp tăng trưởng vào pha log ngày 25 vào pha ổn định ngày 45 với mật độ tế bào cao đạt 18,5 ×106 tế bào/ml nồng độ KNO3 0,5 0,75 g/l thấp KNO3 0,25 1,25 g/l Trang 47 Science & Technology Development, Vol 16, No.T1 - 2013 Hình Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nồng độ KNO3 đến tích lũy β-carotene dung dịch tảo Đối với tích lũy β-carotene dịch tảo nồng độ KNO3 tốt 0,5 0,75g/l với lượng β-carotene đạt 27,2 g/ml thấp KNO3 0,25 1,25g/l Như vậy, thấy có tương quan mật độ tế bào tích lũy β-carotene dung dịch tảo; tảo tăng trưởng tốt lượng β-carotene tích lũy dịch tảo cao ngược lại Điều phù hợp với kết Hình mà tích lũy β- carotene tế bào tảo Dunaliella sp có chênh lệch với nồng độ KNO3 Trong đó, tích lũy β-carotene tảo cao nồng độ KNO3 0,5g/l đạt 1,58pg/tế bào Kết phù hợp với nghiên cứu Çelekli A (2006) Prieto A (2010) với nồng độ muối nitrate khoảng 0,45 g/l (hàm lượng β-carotene đạt khoảng 30 g/ml) Hình Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nồng độ KNO3 đến tích lũy β-carotene tế bào tảo Trang 48 TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 16, SỐ T1 - 2013 KẾT LUẬN Chủng tảo Dunaliella sp phân lập có thời gian tăng trưởng khoảng 55 ngày Pha log ngày thứ 25 Hàm lượng β-carotene tối đa đạt pha ổn định nên thời điểm thu sinh khối tảo β-carotene tốt ngày 45 Điều kiện nuôi tảo thu sinh khối tối ưu nồng độ NaCl 1,5 M KNO3 0,5 g/l Kết cho thấy điều kiện stress gia tăng nồng độ NaCl môi trường ni kích thích tích lũy β-carotene tế bào tảo lại giảm tăng trưởng tế bào, nồng độ nitrate lại ảnh hưởng Hàm lượng β-carotene sinh khối khô tối đa đạt với nồng độ NaCl M 9%; với nồng độ KNO3 0,5 g/l 8,3% Tuy nhiên, điều kiện stress làm giảm lượng β-carotene thu dịch ni tảo mà hiệu thu nhận β-carotene thực tế, nuôi cấy chủng Dunaliella nên điều kiện môi trường nuôi cấy để thu β-carotene đề xuất nồng độ NaCl M KNO3 0,5 g/l với lượng β-carotene đạt tương ứng khoảng 18 27,5 g/ml Investigation of beta-carotene production from microalgae Dunaliella isolated in Vietnam • • • • Huynh Hiep Hung Nguyen Thi My Lan Le Thi My Phuoc Pham Thanh Ho University of Science, VNU-HCM ABSTRACT Beta-carotene is known as one of nature’s most powerful antioxidants It is also a major pro-vitamin A nutrient, and simulative effects on the immune system Nowadays, the microalga Dunaliella is the best commercial source of natural βcarotene since it has a mixture composed mainly of 9-cis isomer which is evident is a better antioxidant than the all-trans isomer In addition, synthetic β-carotene only contains the all-trans isomer, natural (alltrans) beta-carotene is found together with other carotenoids In this study, we chose the microalga Dunaliella sp which is isolated at salter in Vietnam since it could grow more easily in this climate Therefore, it has a great potential for largescale culture in Vietnam coast The research aims at investigating the optimization of cultural conditions and stresses depth for Trang 49 Science & Technology Development, Vol 16, No.T1 - 2013 cell growth and β-carotene production of this alga The obtained results showed that the highest cell density was attained at 2M salt concentration with 2.7 ×10 cell/ml and productivity of dry biomass was 0.321g/l Furthermore, β-carotene content increased to 9% of dry biomass under high salinities (NaCl 3M) or nitrogen starvation of cultural condition Keywords: Beta-carotene, Dunaliella, dry mass, nitrogen starvation, salt concentration TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] A Ҫelekli, G Donmer, Effect of pH, light intensity, salt and nitrogen concentrations on growth and β-carotene accumulation by a new isolate of Dunaliella sp., Journal of Microbiological Methods, 22, 183-189 (2006) [2] M Garcia-Gonzalez, J C Monreno, F J Florencio, M G Guerreo, Production of Dunaliella salina biomass rich in 9-ciscarotene and lutein in a closed tubular photobioreactor, Journal of Biotechnology, 115, 81-90 (2005) [3] T A Hosseini, M Shariati, Dunaliella biotechnology: methods and applications, Journal of Applied Microbiology, 107, 14-35 (2009) [4] D M M Kleinegris, M A Van Es, M Janssen, W A Brandebnurg, R H Wijffels, Carotenoid fluorescence in Dunaliella salina Journal of Applied Phycology, 22, 645-649 ( 2010) Trang 50 [5] J T Landrum, Carotenoids: Physical, chemical and biological functions and properties, CRC Press (2010) [6] Michael a Borowitzka, The mass culture of Dunaliella salina, Algal Biotechnology Laboratory, Murdoch University (2002) [7] Oren A., Review: A hundred years of Dunaliella research: 1905-2005, Saline Systems (2005) [8] Y I Posudin, N P Massjuk G G., Liliskaya, Photomovement of Dunaliella Teod., Vieweg Teubner Verlag, 23-83 (2010) [9] Prieto A., Canavate J.P., Garcia-Gonzalez M., Assessment of carotenoids production by Dunaliella salina in different culture systems and operation regimes, Journal of Biotechnology, 151, 180-185 (2010) [10] Z H Ye, J G Jiang, G H Wu, Biosynthesis and regulation of carotenoids in Dunaliella: Progresses and prospects, Biotechnology Advances, 26, 953-959 (2008) ... ta cho vi c ni trồng lồi vi tảo biển Chúng tiến hành xác định số điều kiện môi trường ảnh hưởng đến tăng trưởng, tích lũy β-carotene chủng vi tảo Dunaliella sp phân lập từ ruộng muối Vi t Nam nhằm... hành khảo sát Dựng đường tương quan tuyến tính OD660nm mật độ tế bào tảo Dunaliella sp Mật TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 16, SỐ T1 - 2013 độ tế bào xác định buồng đếm hồng cầu Khảo sát ảnh hưởng... hưởng số yếu tố môi trường đến tăng trưởng tích lũy βcarotene tảo Dunaliella sp Tảo Dunaliella sp tiến hành khảo sát loại điều kiện nhà khoa học cho có ảnh hưởng nhiều đến tích lũy β-carotene nồng