Bài viết Chế tạo và khảo sát khả năng kháng E. Coli của hạt nano bạc và hạt nano titan dioxit được thực hiện với hai mục tiêu là điều chế hỗn dịch nano bạc, màng nano titan dioxit và khảo sát hoạt tính kháng E.Coli của hai chế phẩm thu được.
Công trình nghiên cứu KHOA HC TRNG I HC Y DƯỢC HẢI PHÒNG CHẾ TẠO VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG E COLI CỦA HẠT NANO BẠC VÀ HẠT NANO TITAN DIOXIT Phan Minh Châu*, Nguyễn Thị Hương*, Đồng Thị Mai*, Nguyễn Thị Phương Thảo* TÓM TẮT 39 Hỗn dịch nano bạc (AgNPs) điều chế phương pháp khử hóa học nano titan dioxit chế tạo phương pháp thủy nhiệt sau tiến hành tạo màng phương pháp điện di Cả nano bạc nano titan dioxit có khả kháng khuẩn diệt khuẩn cho thấy hiệu khác Chúng xác định khả diệt vi khuẩn nano bạc nano titan dioxit theo TCVN 6187-2:1996 tiến hành so sánh khả kháng khuẩn chúng đến phát triển vi khuẩn gây bệnh đường ruột Escherichia coli Từ khóa: nano bạc, nano titan dioxit, vi khuẩn E Coli SUMMARY SYNTHESIS AND EVALUATION OF ANTIBACTERIAL EFFECT OF SILVER NANOPARTICLES AND TITANIUM DIOXIDE NANOPARTICLES AGAINST E.COLI Silver nanoparticles (AgNPs) were prepared by chemical reduction and titanium dioxide nanoparticles (TiO2NPs) were prepared by hydrothermal method We synthesized TiO2 thin film by electrophoresis Both of AgNPs and TiO2NPs have antibacterial and bactericidal *Trường Đại học Y Dược Hải Phòng Chịu trách nhiệm chính: Phan Minh Châu Email: pmchau@hpmu.edu.vn Ngày nhận bài: 18.2.2022 Ngày phản biện khoa học: 19.3.2022 Ngày duyệt bài: 29.5.2022 264 activities and show different effects We determined the antibacterial and bactericidal ability of AgNPs and TiO2NPs according to TCVN 6187-2:1996 and compared their effect to the growth of pathogenic bacteria Escherichia coli Keywords: Silver nanoparticles, titanium dioxide nanoparticles, E Coli I ĐẶT VẤN ĐỀ Với công nghệ nano, đặc biệt y học, có bước tiến dài lịch sử Ví dụ: nhiều phương pháp điều trị khác thử nghiệm để hạn chế khối u phát triển tiêu diệt chúng cấp độ tế bào Không dừng lại đó, nhà khoa học cịn nghiên cứu dự án nanorobot có kích thước siêu nhỏ, vào bên thể người để đưa thuốc điều trị đến phận cần thiết Ở hướng khác, có nhiều cơng trình nghiên cứu tiến hành tìm kiếm vật liệu kháng khuẩn, diệt khuẩn Tiểu phân nano bạc đường kính - 32 nm cho có khả làm tăng tác dụng diệt khuẩn nhiều loại kháng sinh Penicillin G, Amoxicillin, Erythromycin, Clindamycin Vancomycin vi khuẩn tụ cầu vàng E.coli [1] Bên cạnh đó, hạt nano titan dioxit chế tạo phương pháp thủy nhiệt chứng minh có hoạt tính diệt khuẩn chọn lọc, loại bỏ gần 50% tế bào trực khuẩn mủ xanh khoảng 20% tế bào tụ cầu vàng [2] TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 515 - THÁNG - SỐ ĐẶC BIỆT - PHẦN II - 2022 Tuy nhiên, nhóm nghiên cứu nhận thấy chưa có cơng bố so sánh khả kháng khuẩn hạt nano bạc hạt nano titan dioxit Vì vậy, đề tài: “Chế tạo khảo sát khả kháng E.Coli hạt nano bạc hạt nano titan dioxit” thực với hai mục tiêu điều chế hỗn dịch nano bạc, màng nano titan dioxit khảo sát hoạt tính kháng E.Coli hai chế phẩm thu II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu hỗn dịch nano bạc, màng nano titan dioxit chủng vi khuẩn gây bệnh đường ruột E Coli 2.2 Hóa chất nghiên cứu 2.2.1 Hóa chất điều chế nano bạc nano titan dioxit STT Hóa chất Cơng thức 10 Bạc nitrat Acid nitric Natri bohidrua Ethanol Polyvinyl pyrolidon (PVP K30) Natri clorua Nước cất, nước trao đổi ion đạt tiêu chuẩn DĐVN IV Acid sulfuric Titan oxid (TiO2 thương mại) Natri hydroxid AgNO3 HNO3 NaBH4 C2H5OH (C6H9NO)n NaCl H2O H2SO4 TiO2 NaOH Nơi sản xuất Trung Quốc Trung Quốc Hàn Quốc Việt Nam Trung Quốc Trung Quốc Việt Nam Trung Quốc Đức Việt Nam 2.2.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật (VSV) STT Mơi trường Mục đích Canh thang lauryl tryptoza (LSB) Môi trường canh thang lactoza – lục sáng mật BGBL Môi trường EC Nước trypton Môi trường phân lập Nơi sản xuất Merk, Đức Kiểm tra tính sinh khí Merk, Đức Kiểm tra tính sinh khí Thử phản ứng indol Merk, Đức Merk, Đức 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp điều chế nano bạc Chúng tơi sử dụng phương pháp khử hóa học để khử ion bạc tạo thành hạt nano bạc Nguyên lý phương pháp thể sau: Ag+ + X => Ago => AgNPs Ion Ag+ tác dụng chất khử tạo nguyên tử Ago Sau đó, nguyên tử kết hợp với tạo thành hạt Ag có kích thước nano [3] 265 Công trình nghiên cứu KHOA HC TRNG I HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG 2.3.2 Phương pháp điều chế nano titan dioxit Trong nghiên cứu sử dụng hệ thủy nhiệt tự chế gồm có hai phận bình thủy nhiệt phận gia nhiệt Bình thủy nhiệt gồm có bình chứa mẫu bình bảo vệ Dung dịch hóa chất (TiO2 thương mại P25 dung môi) đưa vào phận chứa mẫu, đậy kín, đặt vào phận bảo vệ; sau tiến hành gia nhiệt cho q trình thủy nhiệt Phương pháp thủy nhiệt TiO2 với loại bazơ khác (như NaOH, KOH, LiOH,…) cho sản phẩm có cấu trúc đơn, kích thước tương đối nhỏ, diện tích bề mặt lớn [5] Sau chế tạo thành công bột nano titan dioxit, tiếp tục tiến hành tạo màng đế dẫn điện suốt truyền qua (ITO) phương pháp lắng đọng điện di (EPD) 2.3.3 Xác định khả diệt vi khuẩn nano bạc nano titan dioxit theo TCVN 6187-2:1996 Chúng sử dụng quy trình “Xác định - Hình Hỗn dịch nano bạc điều chế phương pháp khử hóa học 266 phát đếm vi khuẩn Coliform, vi khuẩn Coliform chịu nhiệt Escherichia coli giả định” Công ty cổ phần cơng nghệ phân tích chất lượng cao Hải Dương III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Điều chế khảo sát khả kháng E Coli nano bạc 3.1.1 Điều chế dung dịch keo nano bạc phương pháp khử hóa học Cho 50 ml dung dịch NaBH4 0,002M vào cốc mỏ 100 ml Sau cho ml dung dịch AgNO3 0,001M từ buret vào cốc mỏ (1giọt/giây), đồng thời sử dụng khuấy từ (500 vịng/phút) Đến thể tích AgNO3 thêm vào khoảng ml dung dịch chuyển sang màu vàng nhạt đậm dần ta thu dung dịch keo nano bạc Tiếp tục nhỏ từ từ 0,5 ml dung dịch chất ổn định PVP 0,1% vào dung dịch khuấy từ (3 giọt/giây) Kết thúc khuấy từ, cho dung dịch keo nano bạc vào bình tối màu sạch, bảo quản nơi khơ mát, tránh ánh sáng Hình Phổ UV-VIS dung dịch keo nano bạc điều chế TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 515 - THÁNG - SỐ ĐẶC BIỆT - PHẦN II - 2022 Về mặt cảm quan, dung dịch keo nano bạc điều chế suốt, có màu vàng sậm, khơng mùi, khơng có tượng vẩn đục hay biến màu sau bảo quản thời gian 3.1.2 Nghiên cứu khả kháng khuẩn dung dịch keo nano bạc Sử dụng quy trình “Xác định - phát đếm vi khuẩn Coliform, vi khuẩn Coliform chịu nhiệt Escherichia coli giả định” Công ty Cổ phần công nghệ phân tích chất lượng cao Hải Dương Phương pháp giúp xác định vi khuẩn E coli loại nước việc nuôi cấy chúng môi trường hệ gồm nhiều ống nghiệm tính tốn số có xác suất cao chúng có mẫu thử 3.1.2.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy vi khuẩn Để khảo sát khả diệt khuẩn dung dịch keo bạc nano điều chế được, nhóm nghiên cứu pha chế môi trường phân lập canh thang lauryl tryptoza (LSB) với nồng độ nano bạc khác mẫu đối chứng âm (mẫu nước cất tiệt trùng), mẫu đối chứng dương (mẫu vi khuẩn), 5ppm, 10ppm, 15ppm, 20ppm sau hấp khử trùng ni cấy vi khuản nhiệt độ 37oC 24 - 48 Bảng Các mơi trường ni cấy vi khuẩn Thế tích dung dịch Nồng độ bạc môi STT nano bạc điều chế trường LSB (ppm) (ml) Đối chứng âm (ĐCÂ) ml Đối chứng dương ml (ĐCD) 5ppm x ml 10ppm 2x ml 15ppm 3x ml 20ppm 4x ml 3.1.2.2 Nuôi cấy vi khuẩn Tiến hành pha lỗng mẫu vi khuẩn để có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 ống nước muối (9ml/ống) cấy vào loại mơi trường LSB có chứa nano bạc không chứa nano bạc Các thao tác thực tủ an toàn sinh học tiệt trùng Nuôi ống môi trường cấy mẫu 48 nhiệt độ 37 ± 0,5oC tủ ấm Kiểm tra Khối lượng LSB (g) Thể tích nước cất (ml) 3,56 Vừa đủ 100ml 3,56 Vừa đủ 100ml 3,56 3,56 3,56 3,56 Vừa đủ 100ml Vừa đủ 100ml Vừa đủ 100ml Vừa đủ 100ml ống sau 24 nuôi ấm Để khẳng định có mặt E.coli, cấy truyền ống dương tính (vẩn đục, sinh khí ống Durham) vào ống trypton để tạo indol vịng 24 Sau cho 0,2 ml, 0,3 ml thuốc thử kovac vào ống nước trypton (đã cấy mẫu) Việc xuất màu đỏ sau lắc nhẹ chứng tỏ có mặt indol 267 Công trình nghiên cứu KHOA HC TRNG I HỌC Y DƯỢC HẢI PHỊNG Hình Các mơi trường phân lập vi khuẩn có chứa nano bạc nồng độ khác Hình Mơi trường trước (trái) sau (phải) nuôi cấy phân lập vi khuẩn E coli 3.1.2.3 Khảo sát khả kháng khuẩn nano bạc Lặp lại thí nghiệm lần, sau lần làm thí nghiệm chúng tơi tiến hành xác định số ống có dấu hiệu dương tính Từ tính tốn cách tham khảo bảng tra thống kê Dựa bảng tra thống kê TCVN 9716:2013 (ISO 8199:2005) (Phụ lục 1) nhóm nghiên cứu xác định phần trăm vi khuẩn bị tiêu diệt, kết thể Bảng Bảng Đánh giá khả diệt khuẩn nano bạc (Đơn vị%) Nồng độ Lần Lần Lần Trung bình 5pmm 99,07 98,80 98,38 98,75 10pmm 99,60 99,60 99,68 99,63 15ppm 99,47 99,47 99,57 99,50 20ppm 99,60 99,60 99,68 99,63 Hình Biểu đồ cột thể khả khuẩn bạc nano nồng độ khác 268 TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 515 - THÁNG - SỐ ĐẶC BIỆT - PHẦN II - 2022 3.2 Điều chế khảo sát khả kháng E Coli nano titan dioxit 3.2.1 Điều chế nano titan dioxit phương pháp thủy nhiệt Tạo 20 ml dung dịch NaOH nồng độ 10M với dung môi nước cất hai lần sau cho 3g TiO2 thương mại P25 vào tiến hành trộn sử dụng máy rung siêu âm 60 phút Hỗn hợp thu cho vào bình thủy nhiệt giữ nhiệt nhiệt độ 130oC 13 Mẫu lấy hòa vào nước cất hai lần, rung siêu âm, xử lý axit HCl loãng, sau tiến hành rửa với nước cất hai lần lọc chân khơng nhiều lần Tiếp hỗn hợp đem sấy khô nhiệt độ 100oC 24 Cuối vật liệu nghiền nhỏ cối mã não nung lên 500oC 3.2.2 Đánh giá khả diệt khuẩn màng nano titan dioxit Để thử nghiệm khả diệt khuẩn vật liệu nano TiO2 (TNT) lựa chọn loại vi sinh sử dụng thí nghiệm vi khuẩn E coli Các thí nghiệm diệt khuẩn tiến hành Công ty Cổ Phần Công nghệ Phân tích chất lượng cao Hải Dương Để tăng diện tích tiếp xúc vật liệu vi khuẩn, vật liệu TNT tiến hành tạo màng đế dẫn điện suốt truyền qua (ITO) phương pháp lắng đọng điện di (EPD) 3.2.2.1 Thiết kế thí nghiệm Mơi trường ni cấy có bổ sung đế ITO lắng đọng điện di màng nano titan dioxit Các công thức cho thí nghiệm khảo sát tính diệt khuẩn vật liệu màng nano titan dioxit vi khuẩn E coli ATCC 25922 • Canh thang LSB + mẫu nước cất khử trùng (mẫu đối chứng âm) • Canh thang LSB + mẫu vi khuẩn (mẫu đối chứng dương) • Canh thang LSB + màng nano titan dioxit lắng đọng dòng điện 75V 1, 3, 5, phút đế ITO + mẫu vi khuẩn 3.2.2.2 Pha môi trường nuôi cấy Các bước pha môi trường nuôi cấy quy trình TCVN 6187-2:1996, thêm màng nano titan dioxit lắng đọng dòng điện 75V đế ITO thời gian khác (vật liệu diệt khuẩn) 3.2.2.3 Khảo sát khả kháng khuẩn nano titan dioxit Các bước thí nghiệm tiến hành theo quy trình “Xác định Coliform, Coliform chịu nhiệt E coli” Cơng ty cổ phần cơng nghệ phân tích chất lượng cao Hải Dương Thí nghiệm lặp lại lần để đảm bảo tính xác khách quan Bảng Đánh giá khả diệt khuẩn màng nano titandioxit (Đơn vị%) Thời gian Lần Lần Lần Trung bình phút 47,83 67,39 54,35 56,52 phút 83,69 83,69 90,65 86,01 phút 79,78 79,78 83,69 81,08 phỳt 67,39 73,91 83,69 75,0 269 Công trình nghiªn cøu KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHỊNG Hình Biểu đồ cột thể khả khuẩn nano titan dioxit nồng độ khác IV BÀN LUẬN Phân tích phổ UV-VIS mẫu dung dịch nano bạc điều chế cho thấy xuất đỉnh hấp thụ cực đại bước sóng 407 nm nằm khoảng 400 – 430 nm Điều cho thấy có mặt hạt nano bạc dung dịch [4] Chúng tiến hành kiểm nghiệm hình dạng kích thước nano bạc SEM Kết thu cho thấy mẫu nano bạc điều chế có tỷ lệ tiểu phân bạc hình cầu cao với 91,5% có kích thước tiểu phân bạc mức nano (từ 15 - 100 nm) với đa số khoảng kích thước nhỏ 15 - 30 nm với tỷ lệ 94,5% Về tính kháng khuẩn, từ nồng độ thấp ppm, nano bạc tiêu diệt xấp xỉ 90,67 % lượng vi khuẩn so với ống chứng dương (+), nồng độ 10 ppm tỷ lệ vi khuẩn bị tiêu diệt đạt 99,63% với số ống có phản ứng dương tính ống môi trường phân lập Từ số liệu thực nghiệm xác định nồng độ nano bạc tối thiểu cho phép tiêu diệt 98,75% vi khuẩn E coli 5ppm Tuy nhiên, nồng độ bạc tăng không 270 làm tăng khả diệt khuẩn bạc Điều giải thích sau Ở nồng độ cao, tiểu phân bạc dễ dàng bị kết tụ tạo thành tiểu phân có kích thước lớn làm giảm khả diệt khuẩn dung dịch bạc nano Nano bạc nồng độ 15 ppm tiêu diệt 99,63% lượng vi khuẩn Vì nồng độ ppm nồng độ diệt khuẩn tối ưu nano bạc điều chế Kết ảnh SEM mẫu nano titan dioxit cho thấy, P25 ban đầu hạt nano kính thước khoảng 25 -40 nm Sau phản ứng thủy nhiệt nhiệt độ 130oC sản phẩm thu có dạng ống nanơ đường kính cỡ nm, chiều dài ống khoảng 200 đến 450 nm Khi ủ nhiệt nhiệt độ 500oC, kích thước ống thay đổi lớn dần có cấu trúc dạng ống rõ rệt kèm xuất hạt nano TiO2 có kích thước từ 20 nm đến 40 nm xen kẽ với ống nano Khả kháng khuẩn tốt với màng lắng đọng hạt nano titan dioxit dòng điện 75V với thời gian phút Tăng thời gian lắng đọng TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 515 - THÁNG - SỐ ĐẶC BIỆT - PHẦN II - 2022 điện di không làm tăng khả kháng khuẩn thời gian lâu nên hạt nano titan dioxit bị kết tụ lại không giữ cấu trúc nano ban đầu khiến bề mặt lớp màng khơng cịn che phủ tốt phút Vật liệu nano Nano bạc Xét khả kháng khuẩn, theo kết thu được, khả kháng khuẩn hạt nano bạc tốt hạt nano titan dioxit Phân tích số ưu nhược điểm hạt bạc nano hạt nano titan dioxit sau: Ưu điểm Nhược điểm Có khả kháng khuẩn tốt, dùng nhiều trường hợp - Giá nguyên vật liệu đắt bạc kim loại quý tự nhiên có giá trị cao mặt kinh tế Nếu dùng diện rộng, quy mô lớn tốn - Điều chế dạng dung dịch khó thu hồi lại hòa tan tạo dung dịch đồng nhất, khó tái sử dụng - Giá nguyên vật liệu, hóa chất điều chế chế tạo rẻ hơn, Nano titan dioxit Khả kháng khuẩn chưa tốt nano kim loại titan không đắt bạc, khơng thích hợp sử dụng bạc trường hợp cần có khả kháng khuẩn diệt - Chế tạo dạng màng, tức khuẩn tối ưu, phù hợp trường dạng vật liệu rắn dễ dàng thu hợp phòng sàng lọc hồi làm sạch, dễ tái sử dụng nhiều lần V KẾT LUẬN Chúng điều chế nano bạc chế tạo màng nano titan dioxit Màng nano titan dioxit xác định có khả kháng vi khuẩn E.coli tốt phủ nano titan dioxit phút với mức điện áp 75V, tỷ lệ kháng khuẩn 86,01% Bên cạnh đó, dung dịch keo nano bạc điều chế có khả kháng vi khuẩn E.coli nồng độ thấp từ 5ppm, tối ưu 10ppm với tỷ lệ kháng khuẩn 99,63% Nhóm nghiên cứu khẳng định khả kháng khuẩn vi khuẩn E coli hạt nano bạc tốt hạt nano titan dioxit VI KIẾN NGHỊ Nhóm nghiên cứu hướng đến tiếp tục khảo sát thông số khác ảnh hưởng đến trình điều chế nano bạc hạt nano titan dioxit để tìm điều kiện tốt giỳp quỏ 271 Công trình nghiên cứu KHOA HC TRNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHỊNG trình tổng hợp đạt hiệu suất cao hơn, kích thước nhỏ đồng Đồng thời tiến hành mở rộng nghiên cứu thử nghiệm tính kháng khuẩn nano bạc hạt nano titan dioxit với chủng vi khuẩn gây bệnh khác TÀI LIỆU THAM KHẢO Shahverdi, A R., Fakhimi, A., Shahverdi, H R., & Minaian, S (2007) Synthesis and effect of silver nanoparticles on the antibacterial activity of different antibiotics against Staphylococcus aureus and Escherichia coli Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, 3(2), 168–171 272 Bhadra, C M., Khanh Truong, V., Pham, V T H., Al Kobaisi, M., Seniutinas, G., Wang, J Y., Juodkazis, S., Crawford, R J., & Ivanova, E P (2015) Antibacterial titanium nano-patterned arrays inspired by dragonfly wings Scientific Reports, 5, 1–12 Chaloupka, K., Malam, Y., & Seifalian, A M (2010) Nanosilver as a new generation of nanoproduct in biomedical applications Trends in Biotechnology, 28(11), 580–588 Bùi Duy Du, Đặng Văn Phú, Nguyễn Triệu, Nguyễn Quốc Hiến (2007) Nghiên cứu chế tạo bạc nano phương pháp chiếu xạ Hóa Học Và Ứng Dụng, 3, 40-43 Chen, X., & Mao, S S (2007) Titanium Dioxide Nanomaterials: Synthesis, Properties, Modifications, and Applications Chemical Reviews, 107(7), 2891–2959 ... sánh khả kháng khuẩn hạt nano bạc hạt nano titan dioxit Vì vậy, đề tài: ? ?Chế tạo khảo sát khả kháng E .Coli hạt nano bạc hạt nano titan dioxit? ?? thực với hai mục tiêu điều chế hỗn dịch nano bạc, ... LUẬN Chúng điều chế nano bạc chế tạo màng nano titan dioxit Màng nano titan dioxit xác định có khả kháng vi khuẩn E .coli tốt phủ nano titan dioxit phút với mức điện áp 75V, tỷ lệ kháng khuẩn 86,01%... khuẩn, theo kết thu được, khả kháng khuẩn hạt nano bạc tốt hạt nano titan dioxit Phân tích số ưu nhược điểm hạt bạc nano hạt nano titan dioxit sau: Ưu điểm Nhược điểm Có khả kháng khuẩn tốt, dùng