Xây dựng phương án tách dòng gen kháng sâu cry1ab từ vi khuẩn bacillus thuringinesis

Họ tên : Nguyễn Thị Thắm MSSV : 20175153 Lớp : KTSH-01-K62 BÁO CÁO THÍ NGHIÊM TIN SINH Nhóm : sáng thứ Đề tài: Xây dựng phương án tách dòng gen kháng sâu Cry1Ab từ vi khuẩn Bacillus Thuringinesis I.Giới thiệu tinh sinh học - Tin sinh học (Bioinformatic) bao gồm việc xây dựng, quản lý lưu trữ nguồn liệu thơng tin quy mơ tồn cầu liên quan đến sinh học làm môi trường liệu sở, xây dựng hoàn thiện chương trình xử lý liệu ứng dụng  cơng cụ hỗ trợ hiệu cho việc nghiên cứu khám phá chất sinh học sinh giới, thu nhận sản phẩm sinh học quý, thiết kế sản xuất sản phẩm sinh học mong muốn… - Sự đời tin sinh học trở thành công cụ mới, trợ giúp đắc lực hiệu quả, đẩy nhanh tốc độ nghiên cứu ứng dụng CNSH - Cơ sở liệu CNSH không dừng lại việc tổng hợp kết nghiệm đơn thuần, mà cịn có khả khái qt hóa, mơ hóa thành “đối tượng số” giới sinh học - Yêu cầu thực hành thí nghiệm tin sinh:  Tìm hiểu sở liệu CNSH  Trình bày thực hành minh họa khai thác ứng dụng Clustol Omega xây dựng phương án thiết kế mồi phục vụ tách dòng gen mong muốn (gen mong muốn em tự lựa chọn) thông tin gen khai thác từ CSDL trực tuyến NCBI Từ dự đốn tính chất protein, khối lượng phân tử, cấu trúc 3D …  Xây dựng phương án tách dòng gen mong muốn II Cơ sở liệu trực tuyến CNSH( Biotechnolgical Database Online) - CSDL giới thiệu Trung tâm Thông tin Quốc gia CNSH Mỹ (National Center for Biotechnology Information tên viết tắt NCBI ) + Đường link dẫn vào trang chủ NCBI sau https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore - CSDL thứ hai Cơ sở liệu thuộc Viện Tin-Sinh học châu Âu ( European Bioinformatics Institute, England tên viết tắt EBI ) + Đường link dẫn đến trang chủ EBI : https://www.ebi.ac.uk/ - CSDL thứ ba Cơ sở liệu thuộc Viện Gen Quốc Gia Nhật Bản ( National Institute of Genetics , Japan tên viết tắt NIG) + Đường link dẫn đến trang chủ NIG : https://www.nig.ac.jp/nig/ III Thực hành III.Quy trình thực hành xây dựng phương án tách dịng gen kháng sâu Cry1Ab từ chủng Bacillus Thuringiensis - Để giảm thiểu tác hại ăn phải thực phẩm tồn dư lượng thuốc bảo vật thực vật em mong muốn chuyển gen kháng sâu vào thực vật để vừa có khả kháng lại số loài sâu bọ ma chất lượng đảm bảo - Trong năm gần thuốc trừ sâu vi sinh Bacillus thuringiensis gọi tắt (Bt) ứng dụng an tồn có hiệu để thay dần thuốc trừ sâu hoá học - Bacillus Thuringiensis vi khuẩn gram dương, mang gen cry sinh tổng hợp bào tử protein tinh thể độc tố có hiệu diệt nhiều lồi trùng thuộc cánh vảy, cánh cứng hai cánh Bước 1: Truy cập vào sở liệu trực tuyến NCBI + All Database chọn Nucleotide , nhập từ tìm kiếm Cry1Ab để tìm chủng có gen Cry1Ab gần gũi có nhiều điểm tương đồng với chủng Bacillus Thuringinesis ta muốn tìm hiểu - Chọn Bacteria( vi khuẩn ) lên kết - Các kết trả chủng Bacillus Thuringinesis khác thời gian lấy mẫu thí nghiệm, nguồn gốc chủng tác giả nghiên cứu Lựa chọn trình tự cấu trúc tương đồng cao với đối tượng nghiên cứu để làm khuôn ảo Ta lựa chọn chủng gần gũi với đối tượng nghiên cứu so sánh với để xem đoạn khơng bị đột biến khả cao đoạn bảo thủ - Bacillus thuringiensis strain FB cry1Ab gene - Bacillus thuringiensis Cry1Ab gene - Bacillus thuringinesis strain LS-R_30 Cry1Ab gene Bước 2: Sử dụng chương trình Clustal Omega để tìm kiếm vùng có cấu trúc đặc biệt, mức độ tương đồng, phân ly trình tự nêu Tìm kiếm vùng bảo thủ để chuẩn bị thiết kế mồi Truy cập vào chương trình Clustal Omega theo đường link https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ + Ở phần Enter or paste a set of chọn DNA + Sau copy trình tự Nu ba chủng chọn dạng ngôn ngữ FASTA vào sequences in any supported formt  Chọn Submit ta thu kết hình: Vì chủng Bacillus thuringinesis nên độ tương đồng chúng cao vùng phân ly Vùng có dấu* bên vùng bảo thủ Chọn trình tự Nu gần gũi với đối tượng nghiên cứu để làm khuôn ảo Ở ta dựa vào thời gian thực thí nghiệm, nguồn gốc chủng tương đồng lựa chọn trình tự AY847289.1 Bước 3: Thiết kế mồi primer - Truy cập vào chương trình Primer Blast để thực thiết kế mồi Nhập trình tự Nu gần gũi với đối tượng nghiên cứu vào ô Enter Accession - Phạm vi mồi : + chọn vùng bảo thủ đầu để làm mồi xuôi (từ Nu đến Nu thứ 667 + chọn vùng bảo thủ cuối để làm mồi ngược ( từ Nu thứ 2847 đến Nu thứ 3447) - Kích thước sản phẩm PCR từ 70- 3400 Bỏ chọn : Enable search for primer pairs specific to the intended PCR template Xong chạy Get Primer Ta thu kết hình: Chương trình Primer Blast trả cho ta 10 cặp mồi xuôi mồi ngược Sau ta dùng phần mềm BLAST để kiểm tra độ đặc hiệu mồi ảo xuôi ngược vừa thiết kế : + Mong muốn cặp mồi ta vừa thiết kế tạo sản phẩm PCR với kích thước mong muốn + Mồi nhân gen mục tiêu hay cịn nhân gen tương đồng thuộc lồi nữa???  Các bước sử dụng BLAST Bước 1: chép lại trình tự mồi xi, mồi ngược Bước 2: vào chương trình BLAST NCBI Bước 3: nhập trình tự vào ô mục Enter accec theo cú pháp Enter Query Sequence nhập Bacillus thuringeinsis Thử mồi 1: ATTTGTTCCCGGTGCTGGAT GTACGCTGTGACACGAAGGA -ở Databast chọn other , Nucleotide collection -ở mục Organism chọn Bacillus/Clostridium group (taxid:1239) -Mục optimize chọn Somewhat similer sequence Bước 4: nhấp dấu + bên trái Algurithm paraments  xuất thông số nâng cao - Max target 5000 - Expect thushold  1000 - Word size =7  Blast chạy Ta kết Kết Thử kiểm tra đoạn mồi để tìm đoạn mồi phù hợp để tiến hành chạy PCR ảo Ở ta lựa chọn đoạn mồi Bước 5: Chạy PCR ảo phần mềm SMS Truy cập SMS theo đường link https://www.bioinformatics.org/sms2/pcr_products.html?fbclid=IwAR2UHzluNt0 O-mO87Lzs1E_i-sww1FWSPTYHHf5DyxB7J6H6crX3M0RjiDs - Nhập trình tự gen gần với lồi ta nghiên cứu dạng ngôn ngữ FASTA ( AY847289.1 ) - Sử dụng cặp mồi thứ : Mồi xuôi : ATTTGTTCCCGGTGCTGGAT Mồi ngược : GTACGCTGTGACACGAAGGA Cặp mồi thỏa mãn yêu cầu độ dài mồi từ 15-30 tối ưu từ 1822 Mật độ GC ảnh hưởng đến Tm( nhiệt độ nóng chảy mồi) Tại Tm từ 5065°C có đến 50% sợi đơi AND phân tách tạo sợi đơn Trên 65°C mồi gắn không xác Nhiệt độ mồi chênh lệch 2°C, nhiệt độ chênh 5°C không tạo sản phẩm  Chọn Submit để tiến hành chạy PCR ảo Thu kết sản phẩm PCR có kích thước 2884 bp với trình tự Nu: >2884 bp product from linear template AY847289.1 Bacillus thuringiensis Cry1Ab (cry1Ab) gene, complete cds, base 147 to base 3030 (T7 - T3) ATTTGTTCCCGGTGCTGGATTTGTGTTAGGACTAGTTGATATAATATGGGGAATT TTTGGTCCCTCTCAATGGGACGCATTTCTTGTACAAATTGAACAGTTAATTAACC AAAGAATAGAAGAATTCGCTAGGAACCAAGCCATTTCTAGATTAGAAGGACTAAG CAATCTTTATCAAATTTACGCAGAATCTTTTAGAGAGTGGGAAGCAGATCCTACT AATCCAGCATTAAGAGAAGAGATGCGTATTCAATTCAATGACATGAACAGTGCCC TTACAACCGCTATTCCTCTTTTTGCAGTTCAAAATTATCAAGTTCCTCTTTTATC AGTATATGTTCAAGCTGCAAATTTACATTTATCAGTTTTGAGAGATGTTTCAGTG TTTGGACAAAGGTGGGGATTTGATGCCGCGACTATCAATAGTCGTTATAATGATT TAACTAGGCTTATTGGCAACTATACAGATCATGCTGTACGCTGGTACAATACGGG ATTAGAGCGTGTATGGGGACCGGATTCTAGAGATTGGATAAGATATAATCAATTT AGAAGAGAATTAACACTAACTGTATTAGATATCGTTTCTCTATTTCCGAACTATG ATAGTAGAACGTATCCAATTCGAACAGTTTCCCAATTAACAAGAGAAATTTATAC AAACCCAGTATTAGAAAATTTTGATGGTAGTTTTCGAGGCTCGGCTCAGGGCATG AAGGAAGTATTAGGAGTCCACATTTGATGGATATACTTAACAGTATAACCATCTA TACGGATGCTCATAGAGGAGAATATTATTGGTCAGGGCATCAAATAATGGCTTCT CCTGTAGGGTTTTCGGGGCCAGAATTCACTTTTCCGCTATATGGAACTATGGGAA ATGCAGCTCCACAACAACGTATTGTTGCTCAACTAGGTCAGGGCGTGTATAGAAC ATTATCGTCCACTTTATATAGAAGACCTTTTAATATAGGGATAAATAATCAACAA CTATCTGTTCTTGACGAGACAGAATTTGCTTATGGAACCTCCTCAAATTTGCCAT CCGCTGTATACAGAAAAAGCGGAACGGTAGATTCGCTGGATGAAATACCGCCACA GAATAACAACGTGCCACCTAGGCAAGGATTTAGTCATCGATTAAGCCATGTTTCA ATGTTTCGTTCAGGCTTTAGTAATAGTAGTGTAAGTATAATAAGAGCTCCTATGT TCTCTTGGATACATCGTAGCGCTGAATTTAATAATATAATTCCTTCATCACAAAT TACACAAATACCTTTAACAAAATCTACTAATCTTGGCTCTGGAACTTCTGTCGT TAAAGGACCAGGATTTACAGGAGGAGATATTCTTCGAAGAACTTCACCTGGCCAG ATTTCAACCTTAAGAGTAAATATTACTGCACCATTATCACAAAGATATCGGGTAA GAATTCGCTACGCTTCTACCACAAATTTACAATTCCATACATCAATTGACGGAAG ACCTATTAATCAGGGGAATTTTTCAGCAACTATGAGTAGTGGGAGTAATCTACAG TCCGGAAGCTTTAGGACTGTAGGTTTTACTACTCCGTTTAACTTTTCAAATGGAT CAAGTGTATTTACGTTAAGTGCTCATGTCTTCAATTCAGGCAATGAAGTTTATAT AGATCGAATTGAATTTGTTCCGGCAGAAGTAACCTTTGAGGCAGAATATGATTTA GAAAGAGCACAAAAGGCGGTAAATGAGCTGTTTACTTCTTTCAATCAAATCGGGT TAAAAACAGATGTGACGGATTATCATATTGATCAAGTATCCAATTTAGTTGAGTG TTTATCTGATGAATTTTGTCTGGATGAAAAAAAAGAATTGTCCGAGAAAGTCAAA CATGCGAAGCGACTTAGTGATGAGCGGAATTTACTTCAAGATCCAAACTTTAGAG GGATCAATAGACAACTAGACCGTGGCTGGAGAGGAAGTACGGATATTACCATCCA AGGAGGCGATGACGTATTCAAAGAGAATTACGTTACGCTATTGGGTACCTTTGAT GAGTGCCAATTAAGAGGGTATATCGAAGATAGTCAAGACTTAGAAATCTATTTAA TTCGCTACAATGCCAAACACGAAACAGTAAATGTGCCAGGTACGGGTTCCTTATG GCCGCTTTCAGCCCCAAGTCCAATCGGAAAATGTGCCCATCATTCCCATCATTTC TCCTTGGACATTGATGTTGGATGTACAGACTTAAATGAGGACTTAGGTGTATGGG TGATATTCAAGATTAAGACGCAAGATGGCCATGCAAGACTAGGAAATCTAGAATT TCTCGAAGAGAAACCATTAGTAGGAGAAGCACTAGCTCGTGTGAAAAGAGCGGAG AAAAAATGGAGAGACAAACGTGAAAAATTGGAATGGGAAACAAATATTGTTTATA AAGAGGCAAAAGAATCTGTAGATGCTTTATTTGTAAACTCTCAATATGATAGATT ACAAGCGGATACCAACATCGCGATGATTCATCCGGCAGATAAACGCGTTCATAGC ATTCGAGAAGCTTATCTGCCTGAACTGTCTGTGATTCCGGGTGTCAATGCGGCTA TTTTTGAAGAATTAGAAGGGCGTATTTTCACTGCATTTTCCCTATATGATGCGAG GAATGTCATTAAAAATGGTGATTTTAATAATGGCTTATCCTGCTGGAACGTGAAA GGGCATGTAGATGTAGAAGAACAAAACAACCACCGTTCGGTCCTTGTTGTTCCGA ATGGGAAGCAGAAGTGTCACAAGAAGTTCGTGTCTGTCCGGGTCGTGGCTATATC CTTCGTGTCACAGCGTAC Bước 6: Dự đốn tính chất sản phẩm tách dịng , khối lượng phân tử, biểu hiên protein … -Sau sản phẩm PCR ảo ta truy cập phần mềm BLAST NCBI theo link https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi Để so sánh sản phẩm PCR ảo với ngân hàng sở liệu NCBI dựa vào tương đồng mà phán đốn tính trạng sản phẩm Kết trả kết cso độ tương đồng cao 100%, 99,69% khả cao tính trạng sản phẩm sản phẩm PCR giống với chủng mang so sánh (trong trường hợp không xảy đột biến) - Truy cập vào Expasy theo link https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam để xác định khối lượng phân tử, điểm pI - Nhập trình tự axit amin sản phẩm PCR ảo vào Ta kết : Kết trả về: MW = 237797,07 pI = 4,90  Dự đoán chức sản phẩm PCR ảo + Truy cập vào Blast theo link https://www.uniprot.org/blast/uniprot/B20200626A94466D2655679D1FD 8953E075198DA80120A1H - - Kết trả có protein có độ tương đồng cao 99,7% khả sản phẩm PCR ảo có chức giống với chủng mang so sánh *xây dựng phương án tách dòng gen ảo - tách dòng gen tập hợp kỹ thuật đưa mộtgen, doạn DNA cần thiết vào tế bào chủ, tạo điều kiện thích hợp để tế bào chủ phân chia tạo nên vô số tế bào cung mang đoạn DNA giống nhau, tạo nên dòng tế bào tổ hợp mang gen cần tách dòng - vector tách dòng DNA có kích thước nhỏ cho phép cài gắn đoạn DNA ngoại lai vào nhằm mục đích nhân đoạn DNA ngoại lai lên với số lượng lớn - loại vector tách dòng thường dùng: plasmid, Cosmid,Phage,  Các bước để xây dựng phương án tách dòng gen Lựa chọn vector tách dòng pGEM-T Easy gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng Vector tách dịng pGEM-T Easy Vị trí enzzym giới hạn chi việc cắt đoạn sản phẩm cắt: vector chứa số lượng lớn vị trí cắt enzym giới hạn trịn vùng đa chọn lọc(MCR) Vị trí MRC vector tách dòng pGEM-T Easy nằm dọc theo vị trí nhận biết enzym EcoRi,BstZI NotI cho phép enzym riêng rẽ cắt đoạn chèn Vùng lựa chọn vector pGEM-T nằm dọc theo vị trí nhận biết BstZI Một vị trí cất đơi sử dụng để giải phóng đoạn chèn từ vector hay vector khác Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn Ecoli.DH5α Kiểm tra có mặt dịng gen Cry1Ab có plasmid tái tổ hợp ... xây dựng phương án tách dòng gen kháng sâu Cry1Ab từ chủng Bacillus Thuringiensis - Để giảm thiểu tác hại ăn phải thực phẩm tồn dư lượng thuốc bảo vật thực vật em mong muốn chuyển gen kháng sâu. .. vector tách dòng thường dùng: plasmid, Cosmid,Phage,  Các bước để xây dựng phương án tách dòng gen Lựa chọn vector tách dòng pGEM-T Easy gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng Vector tách dòng. .. 99,7% khả sản phẩm PCR ảo có chức giống với chủng mang so sánh *xây dựng phương án tách dòng gen ảo - tách dòng gen tập hợp kỹ thuật đưa mộtgen, doạn DNA cần thiết vào tế bào chủ, tạo điều kiện thích