Ngμy nay, bên cạnh những phương pháp định loại vi khuẩn truyền thống, các nhμ khoa học đã ứng dụng các kĩ thuật sinh học phân tử hiện đại cho kết quả nhanh chóng vμ chính xác.. - Vi khuẩ
Trang 132
Tạp chí khoa học vμ công nghệ Tập 40, số 4, 2002 Tr 32-37
Tách dòng gen 16s arn riboxom từ vi khuẩn phân hủy
thuốc bảo vệ thực vật methyl parathion
Nguyễn Thị Kim Cúc, Nguyễn Thị Tuyết Mai, Phạm Việt Cường, Lê Văn Nhương
Methyl parathion (MP) hay còn gọi lμ volphatox, metaphos, folidol M, matacid, bladan M
lμ thuốc trừ sâu nhóm lân hữu cơ có phổ tác dụng rộng đối với nhiều loại côn trùng hại cây trồng Nhưng nó lμ một loại thuốc bảo vệ thực vật có độc tính cao đối với động vật máu nóng cũng như các động vật thủy sinh ở Việt Nam cũng như nhiều nước trên thế giới, MP đã bị cấm sử dụng từ nhiều năm nay, tuy nhiên trên thực tế, nhiều vùng ở nước ta, MP vẫn được dùng Với độc tính cao đồng thời khó bị phân hủy nên đây chính lμ nguồn gây ô nhiễm đất, nước ngầm vμ gây ngộ
độc thực phẩm cho người vμ gia súc [5]
Việc sử dụng các vi sinh vật để xử lí ô nhiễm, lμm sạch môi trường đang được các nhμ khoa học quan tâm nghiên cứu [1, 2, 3] Việc phân lập vμ định loại các vi sinh vật nμy lμ mục tiêu quan trọng khi muốn sử dụng chúng trong thực tế Ngμy nay, bên cạnh những phương pháp định loại vi khuẩn truyền thống, các nhμ khoa học đã ứng dụng các kĩ thuật sinh học phân tử hiện đại cho kết quả nhanh chóng vμ chính xác Trong bμi nμy chúng tôi trình bμy kết qủa việc tách dòng gen vμ đọc trình tự 16s ARN riboxom của chủng vi khuẩn phân hủy MP
I Nguyên liệu vμ phương pháp
- Môi trường vμ điều kiện nuôi cấy: Môi trường tối thiểu theo Schlegel vμ cộng sự (1961)
MP được bổ sung vμo môi trường vô trùng trước khi nuôi cấy, đạt nồng độ cuối cùng lμ 1mg/ml môi trường
- Vi khuẩn phân hủy MP phân lập theo phương pháp của Chaudhry vμ cộng sự (1988) từ các
mẫu đất khác nhau ở Hμ Nội, đã được định loại sơ bộ đến chi P seudomonas
- Tách ADN tổng số theo phương pháp của Marterson vμ cộng sự [4] vμ được điện di kiểm tra trên gel agaroza 0,8%
- Nhân gen 16s ARN riboxom bằng kỹ thuật PCR Cặp mồi được thiết kế dựa trên trình tự gen của vùng bảo thủ mã hóa đoạn gen 16s ARN riboxom của vi khuẩn
Pf: 5’- cgg ccc aga ctc cta cgg gag gca gca -3’
Pr: 5’- gcg tgg act acc agg gta tct aat cc - 3’
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR bao gồm: 95o: 1 phút; [94o:1phút, 52o: 1phút, 72o: 1 phút
20 giây] 30 chu kỳ; 72o:10 phút, kết thúc ở 4oC
- Tạo dòng phân tử ADN: Sản phẩm PCR được gắn trực tiếp vμo vector TM trong bộ TA
cloning kit của hãng Invitrogen Sau đó plasmid tái tổ hợp được biến nạp vμo E coli chủng TOP
10 F
- Tách plasmid vμ các kỹ thuật ADN tái tổ hợp được tiến hμnh theo Sambrook vμ cộng sự [7]
Trang 2- Xác định trình tự ADN theo phương pháp của Sanger [8] có sử dụng đoạn mồi đã gắn huỳnh quang của bộ hóa chất chuẩn (hãng Amersham Pharmacia Biotech), sau đó sản phẩm PCR
đã gắn huỳnh quang được phân tích trên máy xác định trình tự ADN tự động vμ được xử lí bằng chương trình P/C GENE
- Lập cây phân loại: Sử dụng chương trình computer CLUSTAL W Ver 1.74 của Thompson
vμ cộng sự [8] Các trình tự tham khảo dùng trong nghiên cứu cây phát sinh chủng loại lấy từ dữ liệu của DDBJ EMBL, Gene bank Cây phân loại dựng theo Kimura vμ sử dụng phương pháp của Saitou vμ Nei [6]
II Kết quả vμ thảo luận
1 Tách ADN tổng số vμ nhân dòng gen 16s ARNr
Từ các mẫu đất thu được, 17 chủng vi khuẩn phân hủy MP đã được phân lập, tuyển chọn vμ
đã tách ADN tổng số của một số chủng
Từ 1,5 ml dịch vi khuẩn nuôi cấy qua đêm, bằng phương pháp tách chiết đã mô tả ở trên, thu được 1,08 g / l ADN tổng số Để kiểm tra mức độ nhiễm của protein trong ADN nhận
được, chúng tôi đã đo quang phổ của ADN dưới bước sóng 280 nm vμ 260 nm trên máy quang phổ Hewlett Packard Kết quả cho thấy tỉ số A260 / A280 = 1,86, như vậy sản phẩm ADN đảm bảo độ tinh khiết cần thiết Ngoμi ra, ARN được loại khỏi ADN bằng ARN-aza Kết quả diện di kiểm tra trên gel agarose cho một băng ADN duy nhất không bị lẫn ARN (ảnh 1)
Chủng vi khuẩn 731 có hoạt tính phân hủy MP cao, vì vậy đã được chọn để tách gen 16s ARNr phục vụ cho mục đích định loại chủng nμy đến loμi
ảnh 1 Điện di đồ ADN tổng số của các chủng vi khuẩn phân hủy MP
Đoạn gen 16s ARN riboxom của chủng 731 đã được nhân bằng PCR với cặp mồi trên Kết quả điện di cho thấy đoạn gen được nhân lên khá đặc hiệu có kích thước khoảng 0,5 kb đúng theo tính toán lí thuyết (ảnh 2)
Trang 334
ảnh 2 Điện di đồ sản phẩm PCR của chủng 731
1 Marker 1 kb; 2, 3 Sản phẩm PCR của chủng 731 (4 l vμ 8 l)
2 Tách dòng gen 16s ARNr
ảnh 3 Điện di đồ sản phẩm tách plasmid từ các khuẩn lạc trắng
1 Marker 1 kb; 9 Plasmid của khuẩn lạc xanh (không có sản phẩm tái tổ hợp); 2 - 8 vμ 10 - 17 Các khuẩn
lạc trắng
Sản phẩm PCR đã được gắn vμo vector TM sau đó biến nạp vμo tế bμo khả biến E coli
chủng TOP 10 F’ Sau khi biến nạp, vi khuẩn được cấy trải trên môi trường chọn lọc có ampilixilin, IPTG vμ bổ sung chất chỉ thị mμu lμ X-gal Sau 24 giờ, các khuẩn lạc có mμu trắng phát triển trên môi trường chọn lọc lμ bằng chứng đầu tiên chứng tỏ tế bμo có mang plasmid tái
tổ hợp được cấy chuyển sang môi trường LB nhân sinh khối Để khẳng định sản phẩm PCR mong muốn đã được gắn vμo vectơ TM, plasmid từ 16 khuẩn lạc mầu trắng đã được tách chiết vμ kiểm tra trên gel agaroza 0,8% (ảnh 3) Kết quả chỉ có tế bμo của bốn khuẩn lạc ở giếng 2, 6, 8,
13 mang plasmid tái tổ hợp
1 2 3
2036 bp
1636 bp
1018 bp
506 bp
4072 bp
3054 bp
2036 bp
Trang 4Để chọn được đoạn gắn có độ dμi gần 500 bp, enzim giới hạn EcoRI đã được sử dụng để cắt
sản phẩm PCR ra khỏi plasmid vectơ TM vμ điện di trên gel agaroza ảnh 4 cho thấy 3 trong 4 khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp có đoạn gen xấp xỉ 500 bp, khuẩn lạc số 10 có đoạn gen lớn hơn kích thước đoạn gen được thiết kế theo lí thuyết
ảnh 4 Điện di đồ sản phẩm cắt các plasmid tái tổ hợp
1 Marker 1kb; 2 - 5 Sản phẩm cắt bằng EcoRI của các khuẩn lạc số 3, 8, 10, 16;
6: Sản phẩm PCR chủng 731
Kết quả nμy một lần nữa khẳng định đoạn gen 16s ARN riboxom đã được gắn vμo vector
3 Đọc trình tự đoạn gen 16s ARNr vμ lập cây phả hệ
Plasmid tái tổ hợp đã đựoc sử dụng để đọc trình tự đoạn gen gắn vμo Kết quả nhận được trình tự của đoạn gen 16s ARN riboxom có 482 cặp bazơ (hình 1)
CGGCCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTCGGGAATATTGGACA 45 ATGGGCGAAAGCTTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGT 90 CTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGC 135 TAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCT 180 AACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTA 225 ATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGT 270 TGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGGACTGCATCCAAAAC 315 TGGCGAGCTAGAGTACGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAG 360 CGGTGAAATGCGTAGATATAGGGAGGCACACCAGTGGCGAAGGCG 405 ACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAG 450 CAAACAGGATTAGATACCCGGGTAGTCCACGC 482
Hình 1 Trình tự nucleotit của đoạn gen 16s ARN riboxom
5090 bp
4027 bp
3054 bp
2036 bp
1636 bp
1018 bp
506 bp
Trang 536
Khi so sánh trình tự đoạn gen trên với trình tự gen 16s ARNr của các tác giả khác trên thế giới đã công bố, kết quả nhận được cho thấy sự tương đồng về nucleotit của đoạn gen thiết kế so
với gen 16s ARNr của chủng Pseudomonas putida trên 98%
Chương trình CLUSTAL W Ver 1.74 đã được sử dụng để xác định cây phát sinh chủng loại của chủng 731 Kết quả nhận được trên hình 2
Hình 2 Cây phát sinh chủng loại của chủng HN 731
Đoạn gen 16s ARNr của chủng 731 đã được đăng kí trong ngân hμng gen có số AJ310536
Từ hình 2 ta thấy chủng 731 (HN731 hoặc VNPs16s) có quan hệ rất gần gũi với chủng PUVN, một chủng vi khuẩn khác cũng được phân lập tại Việt Nam vμ đã được định loại đến loμi
Pseudomonas putida Từ các kết quả thu được có thể kết luận chủng 731 thuộc loμi Pseudomonas putida
III Kết luận
- Bằng kỹ thuật PCR đã nhân được đoạn gen 16s ARN riboxom của chủng 731
- Trình tự đoạn gen nμy được giải, gồm 482 cặp bazơ vμ đăng ký trong ngân hμng gen quốc tế
- Với cây phả hệ phát sinh chủng loại của chủng HN 731 từ đó định loại tới loμi của nó
tưong tự Pseudomonas putida
AEER AEAUS AEFR
AEFRG AEUR
AEJP AEUN PUFRG FUJP
PUSWI PUUSA
PUVN VNPD168
AEUSA FUITA
Denrogram of the
alignment
AEER
Trang 6Tμi liÖu tham kh¶o
1 Alvey S and D E Croley - Survival and activity of an Atrazine - Mineralizing bacterial
consortium in Rhizosphere soils, Environ Sci Technol 30 (1996) 1596-1603
2 Korpaditskul R., A Katayama, and Kuwatsuka - Chemical and microbial degradation of
atrazine in Japanese and Thai soils, J pest Sci 18 (1993) 77-83
3 Korpaditskul R., A Katayama, and Kuwatsuka - Degraadation of Atrazine by soil bacteria in
the stationary plase, J pest Sci 18 (1993) 293-298
4 Masterson P V., R K Prakash, A G Atherby - Conservation of symbiotic nitrogen fixation
gene sequences in Rhizobium japonicum and Bradyrhizobium japonicum J Bacteriol 163
(1985) 21
5 Ramanathan M P, D Lalithakumari - Complete mineralization of Methyl parathion by
Pseudomonas sp A3 Appl Biochem Biotechnol 80 (1) (1999) 12
6 Saitou N and Nei M - The neighbour - joining method for reconstructing phylogenetic tree
Mol Biol Evol 4 (1987) 406- 425
7 Sambrook, Fritsch, Maniatis - Molecular cloning: A laboratory manual Cold spring Harbor Laboratory, 1989
8 Sanger F., Nicklen S., Coulson A R - DNA Sequencing with chaiin-terminating inhibitors
Proc Natl Acad Sci USA, 74 (12) (1977) 5463-5467
9 Thompson J D., Higgins D G., and Gibson T J - CLUSTAL W: Improving the sensitivity
of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position - specific
gap penalties & weight matrix choice Nucl acids Res 22 (1994) 4673-4680
Summary
Cloning and sequencing of the gene 16s ribosome RNA from Methyl
parathion- degrading bacteria
Bacteria were isolated from soil samples of Hanoi Isolate 731 with high MP - degrading activity was chosen for further experiments Extracted total genomic DNA of strain 731 was used as template for PCR reaction to amplify 16s rRNA gene fragment The PCR product of 0.5
kb was cloned into TM vector and 3 DNA clones with desired insert were selected The partial 16s rRNA of strain 731 was sequenced and dendrogram of it’s phylogeny was constructed From
received results, this strain was identified to species Pseudomonas putida
ViÖn C«ng nghÖ sinh häc, Trung t©m KHTN vμ CNQG
