Tách dòng gen 16s arn riboxom từ vi khuẩn phân hủy thuốc bảo vệ thực vật methyl parathion

32 Tạp chí khoa học v công nghệ Tập 40, số 4, 2002 Tr. 32-37 Tách dòng gen 16s arn riboxom từ vi khuẩn phân hủy thuốc bảo vệ thực vật methyl parathion Nguyễn Thị Kim Cúc, Nguyễn Thị Tuyết Mai, Phạm Việt Cờng, Lê Văn Nhơng Methyl parathion (MP) hay còn gọi l volphatox, metaphos, folidol M, matacid, bladan M l thuốc trừ sâu nhóm lân hữu cơ có phổ tác dụng rộng đối với nhiều loại côn trùng hại cây trồng. Nhng nó l một loại thuốc bảo vệ thực vật có độc tính cao đối với động vật máu nóng cũng nh các động vật thủy sinh. ở Việt Nam cũng nh nhiều nớc trên thế giới, MP đã bị cấm sử dụng từ nhiều năm nay, tuy nhiên trên thực tế, nhiều vùng ở nớc ta, MP vẫn đợc dùng. Với độc tính cao đồng thời khó bị phân hủy nên đây chính l nguồn gây ô nhiễm đất, nớc ngầm v gây ngộ độc thực phẩm cho ngời v gia súc [5]. Việc sử dụng các vi sinh vật để xử lí ô nhiễm, lm sạch môi trờng đang đợc các nh khoa học quan tâm nghiên cứu [1, 2, 3]. Việc phân lập v định loại các vi sinh vật ny l mục tiêu quan trọng khi muốn sử dụng chúng trong thực tế. Ngy nay, bên cạnh những phơng pháp định loại vi khuẩn truyền thống, các nh khoa học đã ứng dụng các kĩ thuật sinh học phân tử hiện đại cho kết quả nhanh chóng v chính xác. Trong bi ny chúng tôi trình by kết qủa việc tách dòng gen v đọc trình tự 16s ARN riboxom của chủng vi khuẩn phân hủy MP. I. Nguyên liệu v phơng pháp - Môi trờng v điều kiện nuôi cấy: Môi trờng tối thiểu theo Schlegel v cộng sự (1961). MP đợc bổ sung vo môi trờng vô trùng trớc khi nuôi cấy, đạt nồng độ cuối cùng l 1mg/ml môi tr ờng. - Vi khuẩn phân hủy MP phân lập theo phơng pháp của Chaudhry v cộng sự (1988) từ các mẫu đất khác nhau ở H Nội, đã đợc định loại sơ bộ đến chi P seudomonas. - Tách ADN tổng số theo phơng pháp của Marterson v cộng sự [4] v đợc điện di kiểm tra trên gel agaroza 0,8%. - Nhân gen 16s ARN riboxom bằng kỹ thuật PCR. Cặp mồi đợc thiết kế dựa trên trình tự gen của vùng bảo thủ mã hóa đoạn gen 16s ARN riboxom của vi khuẩn. Pf: 5- cgg ccc aga ctc cta cgg gag gca gca -3 Pr: 5- gcg tgg act acc agg gta tct aat cc - 3 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR bao gồm: 95 o : 1 phút; [94 o :1phút, 52 o : 1phút, 72 o : 1 phút 20 giây] 30 chu kỳ; 72 o :10 phút, kết thúc ở 4 o C. - Tạo dòng phân tử ADN: Sản phẩm PCR đợc gắn trực tiếp vo vector TM trong bộ TA cloning kit của hãng Invitrogen. Sau đó plasmid tái tổ hợp đợc biến nạp vo E. coli chủng TOP 10 F. - Tách plasmid v các kỹ thuật ADN tái tổ hợp đợc tiến hnh theo Sambrook v cộng sự [7]. 33 - Xác định trình tự ADN theo phơng pháp của Sanger [8] có sử dụng đoạn mồi đã gắn huỳnh quang của bộ hóa chất chuẩn (hãng Amersham Pharmacia Biotech), sau đó sản phẩm PCR đã gắn huỳnh quang đợc phân tích trên máy xác định trình tự ADN tự động v đợc xử lí bằng chơng trình P/C GENE. - Lập cây phân loại: Sử dụng chơng trình computer CLUSTAL W Ver 1.74 của Thompson v cộng sự [8]. Các trình tự tham khảo dùng trong nghiên cứu cây phát sinh chủng loại lấy từ dữ liệu của DDBJ EMBL, Gene bank. Cây phân loại dựng theo Kimura v sử dụng phơng pháp của Saitou v Nei [6]. II. Kết quả v thảo luận 1. Tách ADN tổng số v nhân dòng gen 16s ARNr Từ các mẫu đất thu đợc, 17 chủng vi khuẩn phân hủy MP đã đợc phân lập, tuyển chọn v đã tách ADN tổng số của một số chủng. Từ 1,5 ml dịch vi khuẩn nuôi cấy qua đêm, bằng phơng pháp tách chiết đã mô tả ở trên, thu đợc 1,08 g / l ADN tổng số. Để kiểm tra mức độ nhiễm của protein trong ADN nhận đợc, chúng tôi đã đo quang phổ của ADN dới bớc sóng 280 nm v 260 nm trên máy quang phổ Hewlett Packard. Kết quả cho thấy tỉ số A260 / A280 = 1,86, nh vậy sản phẩm ADN đảm bảo độ tinh khiết cần thiết. Ngoi ra, ARN đợc loại khỏi ADN bằng ARN-aza. Kết quả diện di kiểm tra trên gel agarose cho một băng ADN duy nhất không bị lẫn ARN (ảnh 1). Chủng vi khuẩn 731 có hoạt tính phân hủy MP cao, vì vậy đã đợc chọn để tách gen 16s ARNr phục vụ cho mục đích định loại chủng ny đến loi. ảnh 1. Điện di đồ ADN tổng số của các chủng vi khuẩn phân hủy MP Đoạn gen 16s ARN riboxom của chủng 731 đã đợc nhân bằng PCR với cặp mồi trên. Kết quả điện di cho thấy đoạn gen đợc nhân lên khá đặc hiệu có kích thớc khoảng 0,5 kb đúng theo tính toán lí thuyết (ảnh 2). 34 ảnh 2. Điện di đồ sản phẩm PCR của chủng 731 1. Marker 1 kb; 2, 3. Sản phẩm PCR của chủng 731 (4 l v 8 l). 2. Tách dòng gen 16s ARNr ảnh 3. Điện di đồ sản phẩm tách plasmid từ các khuẩn lạc trắng 1. Marker 1 kb; 9. Plasmid của khuẩn lạc xanh (không có sản phẩm tái tổ hợp); 2 - 8 v 10 - 17. Các khuẩn lạc trắng Sản phẩm PCR đã đợc gắn vo vector TM sau đó biến nạp vo tế bo khả biến E. coli chủng TOP 10 F. Sau khi biến nạp, vi khuẩn đợc cấy trải trên môi trờng chọn lọc có ampilixilin, IPTG v bổ sung chất chỉ thị mu l X-gal. Sau 24 giờ, các khuẩn lạc có mu trắng phát triển trên môi trờng chọn lọc l bằng chứng đầu tiên chứng tỏ tế bo có mang plasmid tái tổ hợp đợc cấy chuyển sang môi trờng LB nhân sinh khối. Để khẳng định sản phẩm PCR mong muốn đã đợc gắn vo vectơ TM, plasmid từ 16 khuẩn lạc mầu trắng đã đợc tách chiết v kiểm tra trên gel agaroza 0,8% (ảnh 3). Kết quả chỉ có tế bo của bốn khuẩn lạc ở giếng 2, 6, 8, 13 mang plasmid tái tổ hợp. 1 2 3 2036 bp 1636 bp 1018 bp 506 bp 4072 bp 3054 bp 2036 bp 35 Để chọn đợc đoạn gắn có độ di gần 500 bp, enzim giới hạn EcoRI đã đợc sử dụng để cắt sản phẩm PCR ra khỏi plasmid vectơ TM v điện di trên gel agaroza. ảnh 4 cho thấy 3 trong 4 khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp có đoạn gen xấp xỉ 500 bp, khuẩn lạc số 10 có đoạn gen lớn hơn kích thớc đoạn gen đợc thiết kế theo lí thuyết. ảnh 4. Điện di đồ sản phẩm cắt các plasmid tái tổ hợp 1. Marker 1kb; 2 - 5. Sản phẩm cắt bằng EcoRI của các khuẩn lạc số 3, 8, 10, 16; 6: Sản phẩm PCR chủng 731. Kết quả ny một lần nữa khẳng định đoạn gen 16s ARN riboxom đã đợc gắn vo vector. 3. Đọc trình tự đoạn gen 16s ARNr v lập cây phả hệ Plasmid tái tổ hợp đã đựoc sử dụng để đọc trình tự đoạn gen gắn vo. Kết quả nhận đợc trình tự của đoạn gen 16s ARN riboxom có 482 cặp bazơ (hình 1). CGGCCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTCGGGAATATTGGACA 45 ATGGGCGAAAGCTTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGT 90 CTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGC 135 TAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCT 180 AACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTA 225 ATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGT 270 TGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGGACTGCATCCAAAAC 315 TGGCGAGCTAGAGTACGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAG 360 CGGTGAAATGCGTAGATATAGGGAGGCACACCAGTGGCGAAGGCG 405 ACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAG 450 CAAACAGGATTAGATACCCGGGTAGTCCACGC 482 Hình 1. Trình tự nucleotit của đoạn gen 16s ARN riboxom 5090 bp. 4027 bp 3054 bp 2036 bp. 1636 bp. 1018 bp. 506 bp 36 Khi so sánh trình tự đoạn gen trên với trình tự gen 16s ARNr của các tác giả khác trên thế giới đã công bố, kết quả nhận đợc cho thấy sự tơng đồng về nucleotit của đoạn gen thiết kế so với gen 16s ARNr của chủng Pseudomonas putida trên 98%. Chơng trình CLUSTAL W Ver 1.74 đã đợc sử dụng để xác định cây phát sinh chủng loại của chủng 731. Kết quả nhận đợc trên hình 2. Hình 2. Cây phát sinh chủng loại của chủng HN 731 Đoạn gen 16s ARNr của chủng 731 đã đợc đăng kí trong ngân hng gen có số AJ310536. Từ hình 2 ta thấy chủng 731 (HN731 hoặc VNPs16s) có quan hệ rất gần gũi với chủng PUVN, một chủng vi khuẩn khác cũng đợc phân lập tại Việt Nam v đã đợc định loại đến loi Pseudomonas putida. Từ các kết quả thu đợc có thể kết luận chủng 731 thuộc loi Pseudomonas putida. III. Kết luận - Bằng kỹ thuật PCR đã nhân đợc đoạn gen 16s ARN riboxom của chủng 731. - Trình tự đoạn gen ny đợc giải, gồm 482 cặp bazơ v đăng ký trong ngân hng gen quốc tế. - Với cây phả hệ phát sinh chủng loại của chủng HN 731 từ đó định loại tới loi của nó tong tự Pseudomonas putida. AEER AEAUS AEFR AEFRG AEUR AEJP AEUN PUFRG FUJP PUSWI PUUSA PUVN VNPD168 AEUSA FUITA Denrogram of the alignm ent AEER 37 Ti liệu tham khảo 1. Alvey S. and D. E. Croley - Survival and activity of an Atrazine - Mineralizing bacterial consortium in Rhizosphere soils, Environ. Sci. Technol. 30 (1996) 1596-1603. 2. Korpaditskul R., A. Katayama, and Kuwatsuka - Chemical and microbial degradation of atrazine in Japanese and Thai soils, J. pest. Sci. 18 (1993) 77-83. 3. Korpaditskul R., A. Katayama, and Kuwatsuka - Degraadation of Atrazine by soil bacteria in the stationary plase, J. pest. Sci. 18 (1993) 293-298. 4. Masterson P. V., R. K. Prakash, A. G. Atherby - Conservation of symbiotic nitrogen fixation gene sequences in Rhizobium japonicum and Bradyrhizobium japonicum. J. Bacteriol. 163 (1985) 21. 5. Ramanathan M. P, D. Lalithakumari - Complete mineralization of Methyl parathion by Pseudomonas sp. A3. Appl. Biochem. Biotechnol. 80 (1) (1999) 12. 6. Saitou N. and Nei. M. - The neighbour - joining method for reconstructing phylogenetic tree. Mol. Biol. Evol. 4 (1987) 406- 425. 7. Sambrook, Fritsch, Maniatis - Molecular cloning: A laboratory manual. Cold spring Harbor Laboratory, 1989. 8. Sanger F., Nicklen S., Coulson A. R. - DNA Sequencing with chaiin-terminating inhibitors Proc. Natl Acad. Sci. USA, 74 (12) (1977) 5463-5467. 9. Thompson. J. D., Higgins. D. G., and Gibson. T. J. - CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position - specific gap penalties & weight matrix choice. Nucl. acids Res. 22 (1994) 4673-4680. Summary Cloning and sequencing of the gene 16s ribosome RNA from Methyl parathion- degrading bacteria Bacteria were isolated from soil samples of Hanoi. Isolate 731 with high MP - degrading activity was chosen for further experiments. Extracted total genomic DNA of strain 731 was used as template for PCR reaction to amplify 16s rRNA gene fragment. The PCR product of 0.5 kb was cloned into TM vector and 3 DNA clones with desired insert were selected. The partial 16s rRNA of strain 731 was sequenced and dendrogram of its phylogeny was constructed. From received results, this strain was identified to species Pseudomonas putida. Địa chỉ: Nhận bi ngy 13 tháng 11 năm 2001 Viện Công nghệ sinh học, Trung tâm KHTN v CNQG.