Tính trạng về độc tố aflatoxin sản sinh từ aspergillus

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM TIN SINH HỌC Giáo viên hướng dẫn: TS Đàm Thúy Hằng Sinh viên: Lê Thị Thơ 20175203 Phan Thị Nhung 20175051 *Bài thí nghiệm -Tính trạng quan tâm, xác định gen mã hóa cho tính trạng báo khoa học -Tìm kiếm số gen mã hóa protein quan tâm ngân hang liệu -So sánh trình tư gen mã hóa cho tính trạng đó, tìm vùng bảo thủ -Thiết kế mồi -Chọn: Tính trạng độc tố aflatoxin sản sinh từ Aspergillus I Tổng quan Aflatoxin Aflatoxin gì? Aflatoxin độc tố vi nấm sản sinh tự nhiên số loài Aspergillus, loại nấm mốc, đáng ý Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus Aflatoxin độc tố tác nhân gây ung thư Sau thâm nhập vào thể, aflatoxin gan chuyển hóa thành dạng trung gian epoxit hoạt hóa thuỷ phân trở thành M1 độc Phân loại Có 13 dạng aflatoxin khác có tự nhiên Aflatoxin B1 coi dạng độc sản sinh Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus Aflatoxin G1 G2 sinh từ A parasiticus Sự có mặt Aspergillus sản phẩm thực phẩm lúc thị mức aflatoxin có hại mà biểu thị cho rủi ro đáng kể sử dụng thực phẩm Aflatoxin M1, M2 thường phát sữa bò cho ăn loại hạt bị nhiễm nấm mốc Các độc tố sản phẩm q trình chuyển hóa gan động vật Tuy nhiên, aflatoxin M1 có mặt sản phẩm lên men Aspergillus parasiticus Những dạng chuyển hóa độc tố bao gồm: a Aflatoxin B1 & B2: sinh Aspergillus flavus A parasiticus b Aflatoxin G1 & G2: sinh Aspergillus parasiticus c Aflatoxin M1: chất chuyển hóa aflatoxin B1 người động vật (trong sữa mẹ phơi nhiễm tới mức ng) d Aflatoxin M2: chất chuyển hóa aflatoxin B2 sữa bò cho ăn thức ăn nhiễm aflatoxin.[6] e Aflatoxicol (AFL) f Aflatoxin Q1 (AFQ) loại aflatoxin loại aflatoxin Đặc điểm -Tương tác với virus viêm gan B Các nghiên cứu việc đồng phơi nhiễm với virus viêm gan B (HBV) làm tăng nguy ung thư -Aflatoxin gây bệnh Độc tố aflatoxin nhiễm vào loài động vật Đối với người trưởng thành khả chống chịu tốt tiếp xúc với Đối với trẻ em dễ bị ảnh hưởng dẫn đến phát triển, tăng trưởng chậm Aflatoxicosis cơng quan gan động vật có vú gây bệnh gan chủ yếu Khi bị phơi nhiễm aflatoxin mức độ nặng gây hoại tử gan cấp tính, nặng gây xơ gan ung thư gan Những triệu chứng suy gan cấp tính như: phù, thay đổi hấp thu, thay đổi tinh thần, chảy máu, thay đổi tiêu hóa, chuyển hóa chất dinh dưỡng, mê Người bị nhiễm độc tố lâu năm có nguy cao ung thư túi mật gan Phơi nhiễm mãn tính khơng dẫn đến triệu chứng kịch tính bệnh aflatoxicosis cấp tính Aflatoxin B1 gây ức chế miễn dịch tăng lượng virus người bị nhiễm HIV Những yếu tố bị ảnh hưởng aflatoxin loài, dinh dưỡng, khả tiếp xúc đồng thời với chất độc khác, tuổi, giới tính Những điều kiện làm tăng nguy nhiễm người bao gồm: điều kiện môi trường thuận lợi cho phát triển nấm mốc thực phẩm, thiếu hệ thống kiểm soát quản lý, hạn chế thức ăn Hiện chưa có thuốc điều trị đặc hiệu cho bệnh aflatoxicosis Người bệnh điều trị triệu chứng hỗ trợ điều trị bệnh gan mức độ nghiêm trọng Sử dụng dịch truyền tĩnh mạch với dextrose, vitamin B, vitamin K hoạt động, hạn chế với hàm lượng carbohydrate đầy đủ Chế độ ăn uống đầy đủ loại rau apiaceous củ cải vàng, rau mùi tây, cà rốt, cần tây làm giảm nguy ung thư Cách phát nhiễm Aflatoxin người Hiện có cách xét nghiệm phát mức độ nhiễm aflatoxin người:  Tính lượng phức AFB1-guanine nước tiểu: Phương pháp dựa vào có mặt phân tử nhỏ cho thấy tồn vòng 24 Tuy nhiên phương pháp tốt mức độ AFB1-guanine thay đổi theo ngày  Tính lượng phức AFB1-albumin huyết thanh: Đây cách tính hàm lượng aflatoxin phơi nhiễm thời gian vài tuần đến vài tháng II Tìm kiếm gen mã hóa Tìm kiếm NCBI - Xác định tính trạng tìm kiếm thơng tin Gen 1: Gen2, gen tương tự => Tìm báo theo Nucleotide – tránh lựa chọn báo “ Partial” Kết >gen1 ATGGTTGACCATATCTCCCCCCGGGCATCTCCCGGACCGATCCGTTCCTCCCAGACTCGCCGCGCCCGAA AGCTCCGGGATAGCTGTACGAGTTGTGCCAGCTCAAAAGTGCGATGCACCAAGGAGAAACCGGCCTGTGC TCGGTGTATCGAACGTGGTCTTGCCTGTCAATACATGGTCTCCAAGCGGATGGGCCGCAATCCGCGCGCT CCCAGTCCCCTTGATTCAACTCGGCGACCATCAGAGAGTCTTCCTTCAGCCAGGTCGGAACAGGGACTTC CGGCGCATAACACGTACTCAACGCCTCATGCTCATACGCAGGCCCACACTCATGCTCATTCTCATCCGCA ACCGCATCCACAATCTCATCCTCAATCGAATCAACCACCACACGCTCTGCCCACCCCCAATGGTAGCAGT AGCGTCTCCGCCATCTTTTCTCATCAGAGTCCGCCGCCACCCGTGGAGACCCAGGGCCTTGGAGGAGATC TGGCTGGTCAGGAGCAAAGCACCCTGTCTTCCCTAACAGTCGATTCGGAATTCGGGGGCTCTTTGCAGTC AATGGAACACGGAAACCATGTCGATTTCTTGGCCGAGTCGACGGGGAGTCTTTTCGACGCGTTTTTGGAA GTAGGGACCCCCATGATCGACCCGTTCCTCGAGTCGGCCCCACTACCACCGTTTCAGGCGCGCTATTGCT GCTTTTCGCTAGCACTACAAACACTGACCCACCTCTTCCCCCACGCCCCGCTGGGCTGTCAACTACGGCT GACGGACGGTGAGGACAGTTCGTGCAACCTGATGACGACTGATATGGTCATCTCGGGGAACAAGAGGGCT ACCGATGCGGTCCGGAAGATCCTCGGGTGTTCGTGCGCGCAGGATGGCTACTTGCTGAGCATGGTCGTCC TTATCGTTCTCAAGGTGCTGGCATGGTATGCTGCGGCAGCAGGCACCCAGTGTACCTCAACGGCGGCGGG TGGAGAAACCAACAGTGGCAGCTGTAGCAACAGTCCCGCCACCGTGTCCAGTGGCTGTCTGACGGAAGAG CGCGTGCTGCACCTCCCTAGTATGATGGGCGAGGATTGTGTGGATGAGGAAGACCAGCCGCGAGTGGCGG CACAGCTTGTTCTGAGTGAACTGCACCGAGTCCAGTCGCTGGTGAACCTATTGGCCAAGCGCCTGCAAGA AGGTGGAGACGATGCAGCAGGGATACCGGCGCACCATCCAGCGTCCCCTTTCTCACTACTCGGGTTTAGT GGCCTCGAAGCAAATCTCGCCACCGCTTGGCGCCGTGTCCTCCGACATTATTGA >gen2 ATGGTTGACCATATTTCCCCCCGGGCATCTCCCGGGCCGATGCGTTCCTCCCAGACTCGCCGCGCTCGAA AGCTCCGGGATAGCTGTACGAGTTGTGCCAGTTCAAAAGTGCGATGCACCAAGGAGAAACCGGCCTGTGC TCGGTGTATCGAACGTGGTCTTGCCTGTCAATACATGGTCTCCAAGCGGATGGGCCGCAATCCGCGCGCT CCCAGTCCCCTTGATTCAACTCGGCGACCATCAGAGAGTCTTCCTTCAGCCGGATCGGAACAGGGACATC CGGCGCATAACACGTATTCAACTCCTCATGCTCATCCCCAACCGCATCCACAATCTCATCCTCAATCGAA TCAACCACCACACGCTCTGCCCACCCCCAATGGTAGCAGTGGTGTCTCCGCCATCTTTTCTCATCAGAGT CCCCCGCCACCCGTGGAGACCCAGGGCCTTGGAGGAGATTTGGCCGGTCAGGAGCAAAGCACCCTGTCTT CCCTAACAATCGATTCGGAATTTGGGGGCTCTTTGCAGTCCATGGAACACGGAAACCATGCCGATTTCTT GGCTGAGCCGACGGGAAGTCTTTTCGACGCGTTTTTGGAAGTGGGGACCCCCATGATCGACCCGTTCCTC GAGTCGGCCCCACTGCCACCGTTTCAGGCGCGCTATTGCTGCTTTTCGCTTGCACTACAAACACTGACCC ACCTCTTCCCCCACGCCCCGCTGGGCTGTCAGCTGCGGCTGACAGACGGCGAGGACAGTTCGTGCAACCT GATGACGACTGATATGGTCATCTCGGGGAACAAGAAGGCTACAGATGCGGTCCGGAAGATCCTCGGGTGT TCGTGCGCGCAGGATGGCTACTTGCTGAGCATGGTCGTCCTTATCGTTCTCAAGGTGCTGGCGTGGTATG CAGCGGCAGCAGGCACCCAGTGTACCTCGACGGCGGTGGGGGGAGAAACCAGCAGTGGCAGCTGTGGCAA CAGTCCCGGCACCGTGTCCAGTGGCTGTCTGTCGGAAGAGCGCGTGCTGCACCTACCAAGTATGGTGGGC GAGGATTGTGTGGATGAGGAAGACCACCCGCGAGTGGCGGCACAGCTCGTTCTGAGTGAACTGCACCGAG TACAGTCGCTGGTGAATCTATTGGCCAAGCGCCTGCAAGAAGGTGGAGACGATGCAGCAGGGATACCGAC GCACCATCCAGCATCCCCTATCTCACTACTCGGATTTAGCGGCCTCGAAGCAAATCTCCGCCACCGCTTG CGCGCCGTGTCCTCTGACATTATTGATTACCTGCATCGAGAATGA >gen3 ATGGTTGACCATATCTCCCCCCGGGCATCTCCCGGACCGATCCGTTCCTCCCAGACTCGCCGCGCCCGAA AGCTCCGGGATAGCTGTACGAGTTGTGCCAGCTCAAAAGTGCGATGCACCAAGGAGAAACCGGCCTGTGC TCGGTGTATCGAACGTGGTCTTGCCTGTCAATACATGGTCTCCAAGCGGATGGGCCGCAATCCGCGCGCT CCCAGTCCCCTTGATTCAACTCGGCGACCATCAGAGAGTCTTCCTTCAGCCAGGTCGGAACAGGGACTTC CGGCGCATAACACGTACTCAACGCCTCATGCTCATACCCAGGCCCACACTCATGCTCATTCTCATCCGCA ACCGCATCCACAATCTCATCCTCAATCGAATCAACCACCACACGCTCTGCCCACCCCCAATGGTAGCAGT AGCGTCTCCGCCATCTTTTCTCATCAGAGTCCGCCGCCACCCGTGGAGACCCAGGGCCTTGGAGGAGATC TGGCTGGTCAGGAGCAAAGCACCCTGTCTTCCCTAACAGTCGATTCGGAATTCGGGGGCTCTTTGCAGTC AATGGAACACGGAAACCATGCCGATTTCTTGGCCGAGTCGACGGGGAGTCTTTTCGACGCGTTTTTGGAA GTAGGGACCCCCATGATCGACCCGTTCCTCGAGTCGGCCCCACTACCACCGTTTCAGGCGCGCTATTGCT GCTTTTCGCTAGCACTACAAACACTGACCCACCTCTTCCCCCACGCCCCGCTGGGCTGTCAACTACGGCT GACGGACGGTGAGGACAGTTCGTGCAACCTGATGACGACTGATATGGTCATCTCGGGGAACAAGAGGGCT ACCGATGCGGTCCGGAAGATCCTCGGGTGTTCGTGCGCGCAGGATGGCTACTTGCTGAGCATGGTCGTCC TTATCGTTCTCAAGGTGCTGGCATGGTATGCTGCGGCAGCAGGCACCCAGTGTACCTCAACGGCGGCGGG TGGAGAAACCAACAGTGGCAGCTGTAGCAACAGTCCCGCCACCGTGTCCAGTGGCTGTCTGACGGAAGAG CGCGTGCTGCACCTCCCTAGTATGATGGGCGAGGATTGTGTGGATGAGGAAGACCAGCCGCGAGTGGCGG CACAGCTTGTTCTGAGCGAACTGCACCGAGTCCAGTCGCTGGTGAACCTATTGGCCAAGCGCCTGCAAGA AGGTGGAGACGATGCAGCAGGGATACCGGCGCACCATCCAGCGTCCCCTTTCTCACTACTCGGGTTTAGT GGCCTCGAAGCAAATCTCCGCCACCGCTTGCGCGCCGTGTCCTCCGACATTATTGATTACCTGCATCGAG AATGA Kết so sánh trình tự mã hóa protein (tìm vùng bảo thủ) Chạy so sánh đoạn gen với +Dùng Clustal Omega +Hoặc dùng Thiết kế đoạn mồi Primer Nhân gen, trình tự đoạn đầu Mồi bắt cặp, tag kéo từ đầu 3’ mồi Trình tự mồi mạch 3’-5’(mồi xuôi) giống mạch đơn ngân hàng liệu, cịn mồi ngược giống trình tự mạch bổ sung -Giúp thiết kế mồi nhanh -Yêu cầu mồi PCR • • • • • • • • Chiều dài đủ lớn 18-24bp Nhiệt độ bắt mồi mồi không chênh lệch 5℃ (nhiệt độ bắt cặp chung) Tỉ lệ GC 40-60% Do liên kết hidro 3, nhiệt độ PCR cao, q khơng bên vững mồi mạch nucleotide cuối đầu 3’ cần có G C để liên kế đầu 3’ bền vững để kéo dài tiếp tục Những nucleotide đầu 3’ phải bắt cặp xác với đoạn gen cần khuyếch đại Hạn chế khả tự liên kết mồi liên kết mồi với nhau: hạn chế đoạn lặp đoạn từ nu trùng trở lên Tránh vùng có cấu trúc bậc Đặc hiệu gen cần khuyếch đại, không đặc hiệu vùng khác genome sinh vật khác Chương trình thiết kế mồi dựa đoạn nucleotide khơng có khả tự xác định vùng bảo thủ -Thiết kế mồi Dùng primer BLAST NCBI -Điền liệu, nhập thơng số Phần trình tự đoạn gen để thiết kế mồi trình tự đoạn gen sinh vật có quan hệ gần gũi với sinh vật ta làm Thay đổi lựa chọn cho phù hợp với Aspergillus flavus -Kết =>Chương trình thiết kế đoạn mồi Trình tự mồi: Mồi xi : TGGTTGACCATATCTCCCCC Mồi ngược: TCAATAATGTCGGAGGACACG => Kết quả: Chọn liệu bơi vàng có tương đồng trình tự cao Chuyển dạng FASTA trình tự protein: >AAA57137.1 aflatoxin [Aspergillus flavus] MVDHISPRASPGPIRSSQTRRARKLRDSCTSCASSKVRCTKEKPACARCIERGLACQYMVSKRMGRNPRA PSPLDSTRRPSESLPSARSEQGLPAHNTYSTPHAHTQAHTHAHSHPQPHPQSHPQSNQPPHALPTPNGSS SVSAIFSHQSPPPPVETQGLGGDLAGQEQSTLSSLTVDSEFGGSLQSMEHGNHVDFLAESTGSLFDAFLE VGTPMIDPFLESAPLPPFQARYCCFSLALQTLTHLFPHAPLGCQLRLTDGEDSSCNLMTTDMVISGNKRA TDAVRKILGCSCAQDGYLLSMVVLIVLKVLAWYAAAAGTQCTSTAAGGETNSGSCSNSPATVSSGCLTEE RVLHLPSMMGEDCVDEEDQPRVAAQLVLSELHRVQSLVNLLAKRLQEGGDDAAGIPAHHPASPFSLLGFS GLEANLATAWRRVLRHY Kiểm tra điều kiện Protein -Để biết khối lượng phân tử điểm đẳng điện protein đó: =>Kết quả: - Vị trí protein: dùng Phobius =>Kết quả: Ngoại bào: phần axit amin từ đến 295 Xuyên màng: từ axit amin 296 đến 315 Nội bảo: từ axit amin 316 đến 437 -Dự đoán chức protein đó: =>Kết quả: Tham gia vào trình sinh tổng hợp aflatoxin Cần thiết cho biểu gen NOR1 VER1 Con đường : sinh tổng hợp aflatoxin Protein có liên quan đến trình sinh tổng hợp aflatoxin, phần trình sinh tổng hợp Mycotoxin Tất protein sinh vật biết có liên quan đến trình sinh tổng hợp aflatoxin sinh tổng hợp Mycotoxin III CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH TÁCH DÒNG GEN a Xác định gen cần tách: - Xác định tính trạng chủng vi sinh vật ta quan tâm - Xác định gen quy định tính trạng báo cáo khoa học ( NCBI ) b.Thiết kế mồi: - Consensus trình tự mã hóa protein Multalin có độ tin cậy xác sau so sánh từ trình tự lấy từ ngân hàng liệu Xác định vùng bảo thủ (mồi thiết kế nằm vùng bảo thủ này) - Thiết kế mồi: sử dụng chương trình như: Primer Blast, Primer3Plus, Primer3 c.Kiểm tra mồi: Sử dụng PCR ảo SMS => Xem xét đoạn kết sau chạy SMS xem có tương đương (kích thước, ) với trình tự ban đầu , cho vào BlastX NCBI để dự đoán kiểm tra ngược tính trạng product PCR ảo có hướng tính trạng - sản phẩm quan tâm ban đầu khơng d Phân tích cấu trúc 3D, tìm dự đốn đặc tính protein tách dịng biểu protein (khối lượng phân tử, điểm pI , vị trí màng tế bào) ( ExPASy ) e.Xây dựng phương án tách dòng gen  Tách ARN tổng số, tổng hợp cDNA khuếch đại PCR  Tạo vector tách dòng tái tổ hợp => biến nạp  Tìm lựa chọn chủng tái tổ hợp ( làm việc với nhiệt độ, pH, … điều kiện tương thích với đặc điểm chủng đặc điểm tính trạng) Tìm hiểu cấu trúc 3D protein đó: Chuỗi xoắn anpha: hình giống mũi tên Tấm phẳng beta: Thực BLAST lại với Protein Data Bank => Kết quả: E value : thấp giống cấu trúc cao =>Chọn liệu đầu tiên: Chọn FASTA : Ấn vào protein 3D structure: Cấu trúc hóa học khơng nằm cấu trúc sinh học : (4S)-2-METHYL2,4PENTANEDIOL ZINC ION: Download máy => Sử dụng phần mềm Cn3D 4.3.1 => Mở file - Vào Style => Coloring Shortcuts => Secondary Structure -Xác định tính trạng, cấu trúc Ví dụ: Chuỗi α β: Style =>Coloring Shortcuts =>Secondary Structure Vùng: Style >Coloring Shortcuts =>Domain Vùng kỵ nước: Style =>Coloring Shortcuts =>Hydrophobicity Các phân tử: Style =>Coloring Shortcuts =>Molecule Vùng bảo thủ: Style =>Coloring Shortcuts =>Sequence Conservation Nhiệt độ: Style =>Coloring Shortcuts =>Temperature IV Kết luận sau mơn học - Đã hồn thành mục đích thí nghiệm - Biết cách sử dụng trang database CNSH , đặc biệt NCBI - Xác định tính trạng phù hợp, quan tâm, giúp cho công việc nghiên cứu ... nhiên, aflatoxin M1 có mặt sản phẩm lên men Aspergillus parasiticus Những dạng chuyển hóa độc tố bao gồm: a Aflatoxin B1 & B2: sinh Aspergillus flavus A parasiticus b Aflatoxin G1 & G2: sinh Aspergillus. .. đường : sinh tổng hợp aflatoxin Protein có liên quan đến q trình sinh tổng hợp aflatoxin, phần trình sinh tổng hợp Mycotoxin Tất protein sinh vật biết có liên quan đến q trình sinh tổng hợp aflatoxin. .. dinh dưỡng, hôn mê Người bị nhiễm độc tố lâu năm có nguy cao ung thư túi mật gan Phơi nhiễm mãn tính khơng dẫn đến triệu chứng kịch tính bệnh aflatoxicosis cấp tính Aflatoxin B1 gây ức chế miễn dịch