Sự phát triển về vi sinh vật học nói chung, và vi sinh vật công nghiệp nói riêng, với bước ngoặc lịch sử là phát minh vĩ đại về chất kháng sinh của Alexander Fleming (1928) đã mở ra kỷ nguyên mới trong y học: khai sinh ra ngành công nghệ sản xuất chất kháng sinh và ứng dụng thuốc kháng sinh vào điều trị cho con người. Thuật ngữ chất kháng sinh lần đầu tiên được Pasteur và Joubert (1877) sử dụng để mô tả hiện tượng kìm hãm khả năng gây bệnh của vi khuẩn Bacillus anthracis trên động vật nhiễm bệnh nếu tiêm vào các động vật này một số loại vi khuẩn hiếu khí lành tính khác.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA CƠNG NGHỆ HĨA HỌC Tiểu luận mơn học Cơng nghệ lên men Đề tài :Nghiên cứu quy trình sản xuất Penicillin GVHD : Cô Nguyễn Thúy Hương LỚP :HC07BSH SVTH : Phần II : Nội dung I.TỔNG QUAN VỀ CHẤT KHÁNG SINH : Sự phát triển vi sinh vật học nói chung, vi sinh vật cơng nghiệp nói riêng, với bước ngoặc lịch sử phát minh vĩ đại chất kháng sinh Alexander Fleming (1928) mở kỷ nguyên y học: khai sinh ngành công nghệ sản xuất chất kháng sinh ứng dụng thuốc kháng sinh vào điều trị cho người Thuật ngữ "chất kháng sinh" lần Pasteur Joubert (1877) sử dụng để mô tả tượng kìm hãm khả gây bệnh vi khuẩn Bacillus anthracis động vật nhiễm bệnh tiêm vào động vật số loại vi khuẩn hiếu khí lành tính khác Nicolle (1907) người phát hoạt tính kháng khuẩn Bacillus subtilis có liên quan đến q trình hình thành bào tử loại trực khuẩn Gratia đồng nghiệp (1925) tách từ nấm mốc chế phẩm sử dụng để điều trị hiệu bệnh truyền nhiễm da cầu khuẩn Mặc dù vậy, tới năm 1929 thuật ngữ " Chất kháng sinh" Alexander Fleming mô tả cách đầy đủ thức báo cáo chi tiết penicillin Thập kỷ 40 50 kỷ XX ghi nhận bước tiến vượt bậc ngành công nghệ sản xuất kháng sinh non trẻ, với hàng loạt kiện : -Khám phá hàng loạt chất kháng sinh, thí dụ Griseofulvin (1939), gramicidin S (1942) , Streptomycin (1943), bacitracin (1945), cloramphenicol polymicin (1947), clotetracyclin Cephalosporin (1948), neomycin (1949), oxytetracyclin nystatin (1950), erythromycin (1952), cycloserin (1954), amphotericin B Vancomycin (1956), metronidazol, kanamycin rifamycin (1957) -Áp dụng phối hợp kỹ thuật tuyển chọn tạo giống tiên tiến (đặc biệt kỹ thuật gây đột biến, kỹ thuật dung hợp tế bào, kỹ thuật tái tổ hợp gen ) tạo biến chủng công nghiệp có lực "siêu tổng hợp" chất kháng sinh cao gấp hàng vạn lần chủng ban đầu -Triển khai thành cơng cơng nghệ lên men chìm quy mô sản xuất công nghiệp để sản xuất Penicillin G (1942) việc hồn thiện cơng nghệ lên men sản phẩm khác -Việc phát hiện, tinh chế sử dụng axit - aminopenicillanic (6-APA, 1959) làm nguyên liệu để sản xuất chất kháng sinh penicilin bán tổng hợp cho phép tạo hàng loạt dẫn xuất penicilin số kháng sinh β - lactam bán tổng hợp khác 1.Khái niêm chất kháng sinh: Kháng sinh chất có nguồn gốc vi sinh vật, bán tổng hợp hay tổng hợp Với liều điều trị kháng sinh có tác dụng kìm hãm tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh nồng độ thấp Một số kháng sinh có tác dụng ngăn cản phát triển tế bào ung thư So với thuốc sát khuẩn, thuốc kháng sinh độc với thể kháng sinh có khả ức chế chọn lọc số khâu trình phát triển vi khuẩn gây bệnh Tuy nhiên kháng sinh chất vô hại thể, số kháng sinh gây độc với gan thận , hệ thống tạo máu gây rối loạn tiêu hóa… Cơ chế tác dụng: Cơ chế tác dụng lên vi sinh vật gây bệnh ( hay đối tượng gây bệnh khác - gọi tắt mầm bệnh) chất kháng sinh thường mang đặc điểm riêng, tùy thuộc vào chất kháng sinh đó; đó, kiểu tác động thường gặp làm rối loạn cấu trúc thành tế bào, rối loạn chức điều tiết trình vận chuyển vật chất màng tế bào chất, làm rối loạn hay kiềm toả trình sinh tổng hợp protein, rối loạn trình tái ADN, tương tác đặc hiệu với giai đoạn định chuyển hóa trao đổi chất (hình 1) Hình Vị trí tác dụng số chất kháng sinh Đơn vị kháng sinh: Năng lực tích tụ kháng sinh chủng hay nồng độ chất kháng sinh thường biểu thị đơn vị : mg/ml, μg/ml, hay đơn vị kháng sinh UI/ml (hay UI/g, International Unit) Đơn vị kháng sinh định nghĩa lượng kháng sinh tối thiểu pha thể tích quy ước dung dịch có khả ức chế hồn toàn phát triển chủng vi sinh vật kiểm định chọn ; thí dụ, với penicillin số miligam penicillin pha vào 50 ml môi trường sử dụng Staphylococcus aureus 209P làm chủng kiểm định Hoạt tính kháng sinh đặc hiệu: Hoạt tính kháng sinh đặc hiệu đặc tính cho thấy lực kìm hãm hay tiêu diệt cách chọn lọc chủng vi sinh gây bệnh, không gây hiệu ứng phụ ngưỡng cho phép người bệnh điều trị Đặc tính biểu thị qua hai giá trị: Nồng độ kìm hãm tối thiểu (Minimun Inhibitory Concentration - Viết tắt MIC) nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (Minimun Bactericidal Concentration - Viết tắt MBC), xác định đối tượng vi sinh vật gây bệnh kiểm định lựa chọn tương ứng cho chất kháng sinh 5.Hiện tượng kháng thuốc : 5.1 Hiện tượng kháng thuốc: Hiện tượng mầm bệnh cịn sống sót sau điều trị kháng sinh gọi tượng kháng thuốc (trên phương diện kiểm nghiệm, vi sinh vật gây bệnh coi kháng thuốc nồng độ MIC chất kháng sinh kiểm nghiệm in vitro đối tượng cao nồng độ điều trị tối đa cho phép bệnh nhân 5.2 Nguyên nhân tượng kháng thuốc: - Việc sử dụng loại kháng sinh kéo dài lạm dụng thuốc kháng sinh (tuỳ tiện sử dụng thuốc không liều lượng, không định không đủ thời gian cần thiết) vơ tình tạo ưu phát triển cạnh tranh cho chủng vi sinh vật có khả kháng thuốc - Xu sử dụng tuỳ tiện chất kháng sinh chăn nuôi, đặc biệt bổ sung vào chế biến thức ăn gia súc, gia cầm nuôi lấy thịt, trứng, sữa Khi đó, ngồi tác dụng có lợi dự kiến, chất kháng sinh bổ sung tạo môi trường phát triển chọn lọc cho chủng mang yếu tố kháng thuốc R động vật nuôi Khi sử dụng thịt, trứng, sữa chúng làm nguyên liệu chế biến, chủng kháng thuốc kéo theo vào sản phẩm thực phẩm Kết người tiêu dùng sử dụng thực phẩm này, mặt họ phải tiếp nhận phần dư lượng kháng sinh sản phẩm; mặt khác, nguy hiểm loại vi sinh vật kháng thuốc sản phẩm thực phẩm thuộc nhóm có ưu tồn tại, phát triển cao 5.3 Cách khắc phục : Khắc phục tượng kháng thuốc vi sinh vật gây bệnh: giải pháp trực quan đơn giản sử dụng dạng kháng sinh Tuy nhiên, việc tìm kiếm, phát sản xuất kháng sinh khối lượng công việc khổng lồ, tiêu tốn nhiều thời gian, nhân lực tiền bạc Trước hết cần triệt để tôn trọng ba nguyên tắc sử dụng thuốc kháng sinh là: -Chỉ định điều trị kháng sinh (làm kháng sinh đồ để chọn kháng sinh thích hợp để định điều trị; dùng thuốc liều, phác đồ, đủ thời gian điều trị; ý phát sớm dấu hiệu kháng thuốc); -Không lạm dụng kháng sinh chưa cần thiết (khơng lạm dụng "điều trị phịng ngừa" thuốc kháng sinh, nghiêm cấm bệnh nhân tự định điều trị thuốc kháng sinh thay bác sĩ); -Nghiêm cấm sử dụng tràn lan chất kháng sinh chăn nuôi giám sát chặt chẽ việc sử dụng kháng sinh thú y II CHẤT KHÁNG SINH PENICILLIN : 1.Lịch sử phát sản xuất Penixillin : Người phát kháng sinh A Fleming Năm 1928, nghiên cứu vi sinh vật gây bệnh , ơng tình cờ phát VSV gây bệnh bị tiêu diệt loại nắm sợi màu xanh xám , ơng trích li dịch nhỏ lên khuẩn lạc vi khuẩn gây bệnh, kết VSV bị chết Nấm tạo nên chất tiêu diệt vi sinh vật Penicillium Chất nấm tiết gọi Penicillin Một năm sau ông công bố kết nghiên cứu không quan tâm đến Đến năm 1938, Howard Florey, Ernst Chain, Norman Heatley đưa Penicillin vào sản xuất thử Vào năm 1940, Dorothy Hodkin xác định cấu trúc phân tử Penicillin 1942: Mary Hunt tuyển chọn chủng cơng nghiệp Penicillium chrysogenum NRRL 1951 (1943) sau biến chủng P chrysogenum Wis Q - 176 (chủng xem chủng gốc hầu hết chủng công nghiệp sử dụng tồn giới) thành cơng việc điều chỉnh đường hướng trình lên men để lên men sản xuất penicillin G (bằng sử dụng tiền chất Phenylacetic, 1944) Năm 1959, nhà khoa học Anh Mĩ tách axit 6-aminopenicillanic Đây nguyên liệu để sản xuất hàng loạt chế phẩm penicillin bán tổng hợp khác Ngày giới sản xuất 500 chế phẩm penicillin ( lên men trực tiếp hai sản phẩm penicillin V penicillin G) tiếp tục triển khai để sản xuất chế phẩm penicillin bán tổng hợp khác Tình hình sản xuất penicillin giới : Thuốc kháng sinh chiếm khoang 30% thị phần dược phẩm giới Các tập đoàn dược phẩm Mỹ, Anh, Nhật Bản , Italia, Hà Lan, Ấn Độ…chiếm vị trí hang đầu lĩnh vực Ví dụ : Cơng ty DSM có trụ sở thành phố Delf (Hà Lan) sản lượng hàng năm 15000 Penicillin chiếm 30% sản lượng loại thuốc giới -Lịch sử tuyển chọn chủng công nghiệp P chrysogenum Vào năm đầu, việc nghiên cứu sản xuất penicillin thường sử dụng chủng có hoạt lực cao thuộc loài P notatum P baculatum Nhưng từ trường đại học Wisconsin (Mỹ) phân lập chủng P.chrysogenum có hoạt tính cao chủng thay từ khoảng sau năm 50 kỷ XX đến tất công ty sản xuất penicillin giới sử dụng biến chủng P.chrysogenum công nghiệp Việc tuyển chọn chủng công nghiệp để lên men sản xuất penicillin nguyên tắc trải qua sáu giai đoạn bản, giải pháp kỹ thuật áp dụng hiệu để thu nhận biến chủng "siêu tổng hợp" penicillin lại kỹ thuật gây đột biến thường như: xử lý tia Rơn - ghen, xử lý tia cực tím tạo đột biến hố chất, thí dụ Metylbis – amin(metyl -2-β-clo- etylamin), N-mustar (tris - βclo- etylamin), Sarcrolyzin, HNO2, Dimetylsulfat, 1,2,3,4 -diepoxybutan 3.Tính chất hóa lý penixillin : Tính chất vật lý: Các penicillin dạng muối dạng acid bột trắng không mùi tinh khiết Phổ UV: đa số nhóm R acyl hóa 6-APA vịng thơm nên cho phổ hấp thu vùng UV ứng dụng Phổ IR: vùng 1600 – 1800 cm-1 có đỉnh đặc trưng nhóm sau : -Nhóm lactam 1760 1730 cm-1 -Chức carboxyl khoảng 1600 cm-1 -Nhóm chức amid ngoại vịng 1700 1650 cm-1 Bình thường penicillin có trọng lượng phân tử 313 đến 334 g / mol ( penicillin G) Penicillin với nhóm phân tử đính kèm thêm có khối lượng phân tử khoảng 500 g / mol Ví dụ, cloxacillin có khối lượng mol 476 g / mol dicloxacillin có khối lượng mol 492 g / mol Tính chất hóa học: Các penicillin có khả tạo muối natri kali tan nước, muối kim loại nặng ( vi dụ muối Cu2+) khơng tan kích thích phân hủy Các penicillin có khả tạo muối với amin: -Tạo penicillin thủy giải chậm ( tác động trễ) procain penicillin ( tác động kéo dài từ 24 – 48h), benethamin penicillin ( tác động kéo dài thừ – ngày), benzathin penicillin ( tác động kéo dài – tuần) -Một số có tính base ví dụ aminosid, alkaloid trộn chung với penicillin ống tiêm gây kết tủa -Các penicillin có khả tạo este, tiền chất có khả phóng thích kháng sinh invivo Tính khơng bền vịng beta lactam: Sự phân hủy môi trường kiềm: pH = có tần cơng ion OH- carbonyl lactam gây mở vòng theo qui luật chung, cuối có tạo thành acid penicilloic, decarboxyl xảy để tạo acid peniloic Nếu mơi trường có diện muối kim loại nặng ( Zn2+, Cd2+, Pb2+ Hg2+) làm cho acid peniciloic bị phân hủy thành carbinolamin không bền, chất tiếp tục bị phân hủy tạo D-penicillamin acid penaldic.Acid penaloic đền lượt bị decarboxyl hóa để trở thành penicillo-aldehyd Sự alcol phân amino phân: vòng beta lactam nhạy với số tác nhân nhân khác với xúc tác ion kim loại nặng: Cu2+, Zn2+, Sn2+ Sự phân hủy môi trường acid: diện ion H+, tần công điện tử nguyện tử S, kích thích mở vòng lactam vòng thiazolidin, tái xếp để tạo thành cấu trúc oxazolic cua acid penicillenic Cuối cùng, mơi trường q acid tạo thành acid penillic Ngồi vịng lactam bị mở lactamase tiết từ vi khuẩn Phân loại Penixillin : - Đặc diểm chung : Penixillin dẩn xuất 6-aminopenixilamic gồm vòng thiazolidin vịng beta-lactam -Cơng thức chung penixillin : - - Khi thay H kim loại kiềm kiềm thổ penixillin dễ tan nước (như Na, K, Ca …) - Vòng beta-lactam yếu tố định hoạt tính kháng sinh - Khi thay R gốc khác penixillin có tác dụng khác Dựa vào nguồn gốc xếp penixillin vào nhóm : -Penixillin nhóm I :gồm penixillin tự nhiên chiết xuất từ môi trường nuôi cấy nấm penixillium notatum P chrysogenum penixillin G penixillin V Các penixillin hấp thu nhanh thải trừ khỏi thể nhanh nên thời gian tác dụng ngắn Muốn kéo dài tác dụng phải dung dẫn xuất chúng procain benzyl penixillin (kéo dài 24 h) benzathin benzyl penixillin ( kéo dài tuần ) Các penixillin chậm dung để tim bắp khơng tiêm tỉnh mạch -Penixillin nhóm II : Gồm dẫn xuất penixillin bán tổng hợp có phổ kháng khuẩn hẹp Penixillin G có khả kháng penixilinase dùng để chữa bệnh nhiễm khuẩn tụ cầu kháng penixillin nhóm I methycylin, cloxaxilin - Penixilin nhóm III : Gồm penixillin bán tổng hợp phổ rộng, không kháng penixilase nhung kháng vi khuẩn Gram(-) mà penixillin nhóm II tác dụng bền vững mơi trường dịch vị nên dung để uống ampixillin, amoxycilin Để làm môi trường nhân giống, người ta làm Chỉ có điểm khác sau làm ẩm môi trường đến độ ẩm định, người ta phân phối chúng vào dụng cụ thủy tinh (chai thủy tinh hay bình tam giác) với khối lượng 1/5 hay 1/6 dung tích dụng cụ, đậy kín nút trùng 121oC(0.5 at) 30 phút để nguội cấy giống c) Quá trình nhân giống: giống có ống nghiệm Trong nhà máy, lần cấy truyền giống, người ta thường cấy làm ống Một ống dùng để kiểm tra trước sản xuất, dùng để sản xuất dùng để bảo quản Song song đó, người ta chuẩn bị bình tam giác dung tích 200-250ml chuẩn bị 50g môi trường Môi trường trùng làm nguội đến 30oC Đổ 10ml trùng làm nguội vào ống giống, dùng que thủy tinh đánh cho bào tử hòa trộn vào nước Bằng biện pháp vô trùng (thực tủ cấy vơ trùng) chuyển tồn vào bình tam giác trên, lắc cho thật chuyển chúng sang tủ ấm30-37oc Nuôi điều kiện bào tử nấm xuất phát triển khắp môi trường Ta gọi trình thực trình nhân giống cấp 1.Cứ tiếp tục thực ta có giống cấp 2, cấp đủ 5-10% giống cho sản xuất Cứ cấp độ nhân giống từ cấp sang cấp khác, khối lượng môi trường tăng từ 10-15 lần Trong trường hợp vượt ký người ta nuôi khay d)Q trình lên men: mơi trường khử trùng làm nguội đến 30oC, tiến hành trộn giống với tỉ lệ 5-10% Các khay xếp chồng lên giá đỡ với khoảng cách định để thống khí thống nhiệt Nấm penicillium q trình phát triển thường tạo nhiệt nấm Aspergillus Tuy nhiên, để tăng cường khả phát triển sinh tổng hợp, người ta thường thổi khí quạt gió có lắp hệ thống làm Q trình lên men kéo dài 6-7 ngày 24-28oC Trong lên men bề mặt, người ta sử dụng môi trường lỏng Môi trường lỏng dùng nuôi cấy bề mặt thu nhận penicillin bao gồm: Cao ngô (bắp) KH2PO4 C6H5CH2COOH 50g 0.5g 0.2g Lactose MgSO4 ZnSO4 30g 0.25g 0.044g NaNO3 3g Nước 1000ml Dung dịch lên men khử trùng 121oC (0.5 at) 30 phút, phân khối vào khay giống khay nuôi cấy bề mặt với môi trường bán rắn Ở đáy khay không đục lỗ phải chứa mơi trường lỏng Chiều cao dung dịch môi trường khay 3-4 cm Người ta tiến hành lên men khoảng thời gian 6-7 ngày nhiệt độ lên men 24-28oC Váng nấm sợi giữ lại sau rút hết dịch lên men, tiếp tục sử dụng cho lần lên men Ở lần lên mentiếp theo người ta đổ thêm dịch lên men vào Các thí nghiệm cho thấy nên sử dụng lại 3-4 lần, lần sau hiệu suất thu nhận kháng sinh giảm dần Khu vực lên men sản xuất penicillin 3.2 Kỹ thuật lên men chìm: Kỹ thuật len men chìm kỹ thuật áp dụng hầu hết cở sản xuất penicillin công nghiệp hiên thường vận hành theo phương pháp lên men bán liên tục, gồm phương án lên men gián đoạn theo mẻ có bổ sung liên tục (hay bán liên tục) hay vài cấu tử kết hợp với phương án tuần hoàn lại phần hệ sợi mẻ lên men trước (hoặc khơng) 3.2.1 Q trình nhân giống : Trong q trình lên men chìm người ta nhân giống mơi trường lỏng Mục đích q trình nhân giống thu nhận số lượng tế bào cao ( thường tính tổng lượng tế bào/ml) Quá trình nhân giống bắt đầu việc chuyển giống từ ống nghiệm sang bình tam giác chứa sẵn mơi trường nhân giống Người ta thường nhân giống vào bình lên men dung tích từ lít hàng ngàn lít Nhiệt độ trình nhân giống trì khoảng 26 ± 1oC thời gian nhân giống cấp độ khoảng 72 Người ta thường nhân giống penicillium mơi trường có thành phần sau: Cao ngô 2% Glucose2% lactose 0.5% Nitrat amon 0.125% Sunfat magiê0.025 sunfat natri 0.05% CaCO3 0.5% Kaliphotphat monoboric 0.2% Trong công nghiệp sản xuất kháng sinh nay, thường dùng chủng biến đổi gen Công nghệ biến đổi gen tạo chủng siêu tổng hợp kháng sinh Theo Talaro (1993), từ chủng penicillin chrysogenum có khả sinh tổng hợp 6mg/l, người ta có chủng biến đổi gen từ chủng gốc có khả sinh tổng hợp 85000ng/l penicillin 3.2.2 Quá trình lên men : Quá trình lên men mơi trường lỏng phương pháp lên men chìm để sản xuất penicillin vận hành theo phương pháp lên men hai pha: - Pha thứ nuôi thu sinh khối khoảng – ngày Trong pha hệ sợi phát triển mạnh chất dinh dưỡng dễ đồng hóa tế bào hấp thụ mạnh, tốc độ sinh sản nấm xảy nhanh, tạo thành penicillin bắt đầu - Pha thứ hai lên mên thu sản phẩm Ở pha hệ sợi phát triển chậm lại, pH tăng dần đạt đến giá trị khoảng – 7,5 Trong pha penicillin tạo thành với mức độ cực đại 23 Trong hầu hết trường hợp, lên men, người ta thay phần lớn (hoặc hoàn toàn) đường lactose đường glucose Lượng glucose bổ sung liên tục hay bán liên tục phải giám sát chặt chẽ nồng độ glucose suốt trình vận hành pha để trì nồng độ glucose ln mức thích hợp nhằm vừa giữ khối lượng hệ sợi ổn định, vừa đảm bảo sinh tổng hợp nhiều penicillin Trong thực tiễn, để tránh xảy thiếu hụt thời glucose , người ta kết hợp bổ sung lượng nhỏ đường lactose (khi đó, chưa bổ sung kịp glucose nấm mốc tự điều chỉnh để sử dụng đường lactose nên khơng xảy tượng tự phân hệ sợi) Ngồi nguồn nitơ nước chiết ngô, người ta thường sử dụng phối hợp (NH4)2SO4 để vừa cung cấp thức ăn N S, vừa sử dụng để điều chỉnh pH trình lên men (pH dịch len men ban đầu thường điều chỉnh khoảng pH = 6,5 – 6,8 dung dịch NaOH H3PO4); nồng độ NH4 + thường khống chế khoảng 0,3 – 0,4 kg/m3 dịch lên men Chất phá bọt thường sử dụng loại dầu béo như: mỡ lợn, dầu đậu tương, dầu vừng, dầu cám…Tiền chất tạo nhánh phenylacetic lên men sản xuất penicillin G (hoặc phenooxyacetic lên men sản xuất penicillin V) bổ sung liên tục (hoặc bổ sung gián đoạn làm nhiều lần) suốt thời gian pha lên men penicillin, để trì nồng độ khoảng 0,1 – 1,0 kg/m3 dịch (nếu nấm mốc tổng hợp đồng thời nhiều penicillin khác, nhiều gây độc cho nấm tăng cường thúc đẩy q trình hydroxyl hóa sản phẩm penicillin) Nhiệt độ lên men pha đầu khống chế 30oC, sau sang pha sau giữ 22 – 25oC Tốc độ sục khí khuấy trộn điều chỉnh để trì nồng độ oxy hịa tan dịch khoảng 30% Trong điều kiện thời gian lên men mẻ thường kéo dài khoảng 144 – 180 Kết thúc trình lên men người ta cố gắng lọc sớm dịch lên men, làm lạnh chuyển sang cơng đoạn trích ly tinh chế thu penicillin STT Thành phần Môi trường 1 Cao ngô 2.0-2.4 - - 2.0-2.4 5.0 5.0 Khô hạt có dầu (lạc, đậu tương hứơng dương) Lactose Mơi trường Môi trường 24 2.0-3.0 1.0 Glucose hydol 1.0 1.0 1.0 Dầu thực vật 0.5-1.0 0.5-1.0 2.5-3.5 Amon nitrat 0.4 0.4 0.4 Sulfat natri 0.05 0.05 0.05 Kali photphat 0.4 0.4 0.4 Magie sulfat 0.025 0.025 0.25 10 Natri hyposunfit 0.2 0.2 0.2 11 Canxi cacbonat 0.5-1.0 0.5-1.0 0.5-1.0 12 Tiên chất 0.2-0.4 0.3-0.4 0.3-0.4 * Đặc điểm thiết bị lên men chìm: Quá trình lên men sản xuất penicillin ngày chủ yếu tiến hành thiết bị lên men chìm chế tạo nhóm thép chịu ăn mịn CT2 với khuấy trộn kiểu tuốc-bin (gồm nhiều tầng cánh khuấy), kết hợp bố trí hệ vách dẫn dịng thùng) Công suất khuấy trộn tiêu hao thiết kế khoảng 3kW/m3/h Khơng khí nén vơ khuẩn cấp vào qua hệ ống phân phối kiểu vịng xốy hay kiểu rẻ quạt đục lỗ lắp đặt sát đáy (hay phía cánh tuốc-bin) Bên thiết bị lắp đặt nhiều tầng ống trao đổi nhiệt kiểu vòng xoắn kết hợp đồng thời với trao đổi nhiệt qua thành thiết bị hai lớp vỏ, đảm bảo điều nhiệt hiệu suốt q trình lên men Dung tích thiết bị phổ biến khoảng 150 – 300m3, hệ số đổ đầy thường chọn khoảng 80%V (phụ thuộc vào kỹ thuật thiết bị phá bọt) Thiết bị nhân sản xuất giống có dung tích khoảng 10%V thiết bị len men, thiết kế tương tự thường ghép cứng với thiết bị lên men Toàn thiết bị lên men sản xuất, thiết bị nhân giống lớn hệ thống trang thiết bị phụ trợ thiết kế lắp đặt đảm bảo vệ sinh thao tác vận hành theo chế độ vô khuẩn cao (tốt nên bố trí cho có thểíap dụng chế độ trùng đồng thời cho toàn hệ thiết bị này) Các thông số kiểm tra trình lên men bao gồm: pH mơi trường, nồng độ oxy hòa tan, nhiệt độ, hàm lượng sinh khối tốc độ biến thiên lượng sinh khối, số lượng, kích thước cấu trúc pellet, nồng độ cấu tử chất, nồng độ penicillin, thành phần khí thải tiêu kiểm tra vi sinh vật Việc giám sát điều chỉnh trình lên 25 men xây dựng sở khai thác hai kiểu tương tác trực tuyến (online control) tương tác không phản hồi theo quy luật (offline control), phụ thuộc vào khả đáp ứng hệ thiết bị có Đồng thời xu hướng máy tính hóa kiểm tra giám sát trình lên men dần chiếm ưu sản xuất cơng nghiệp Hình Sơ đồ hệ lên men dùng cho sản xuất penicillin * Hiệu kinh tế chung trình lên men chìm Năng lực sinh tổng hợp tích tụ penicillin dịch lên men kết mối tương tác đồng thời hàng loạt yếu tố công nghệ như: hoạt tính sinh tổng hợp chúng, cơng nghệ lên men áp dụng, chất lượng nguyên liệu, đặc tính thiết bị lực đáp ứng yêu cầu công nghệ thiết bị, chế độ giám sát điều chỉnh thông số công nghệ, lực kỹ vận hành công nhân Với nguồn chất glucoza lên men theo phương pháp chìm, hệ số phân bổ ngun liệu dự tính khoảng 25% glucoza nấm mốc sử dụng để tổng hợp hệ sợi, 65% đường sử dụng để trì sống sót hệ sợi, cịn lại khoảng 10% nấm mốc sử dụng để tổng hợp penicillin Hệ số sử dụng thức ăn nitơ lưu huỳnh để tổng hợp penicillin tương ứng 20% 80% Nồng độ penicillin G dịch lên men năm 80 - 90 kỷ XX đạt khoảng 80.000 UI/ml (tương ứng suất khoảng 40 - 50 kg penicillin G/ m3 dịch lên men ) 3.2.3 Xử lý dịch lên men tinh chế thu penicillin tự nhiên : Có ba phương pháp thu nhận tinh chế penicillin từ mơi trường ni cấy, là: 26 • Trích ly dung mơi hữu • Hấp phụ • Trao đổi ion Trong ba phương pháp phương pháp trích ly dung mơi hữu sử dụng nhiều phương pháp dựa ưu điểm sau: • Muối penicillin dễ tan nước • Acid penicillic dễ tan dung môi hữu Công đoạn xử lý dịch lên men tinh chế thu penicillin tự nhiên tóm tắt sơ đồ hình , bao gồm cơng đoạn sau đây: Hình Sơ đồ tóm tắt cơng đoạn xử lý dịch lên men thu penicillin tự nhiên 27 Sơ đồ khối trình xử lí dịch lên men : 3.2.4 Lọc dịch lên men : Mục đích : Penicillin sản phẩm lên men ngoại bào Vì vậy, sau kết thúc trình lên men người ta thường tiến hành lọc để giảm tổn hao phân huỷ penicillin giảm bớt khó khăn tinh chế, tạp chất tạo hệ sợi nấm tự phân Thiết bị lọc: phổ biến thiết bị lọc hút kiểu băng tải kiểu thùng quay Thông thường, người ta cần lọc lần làm lạnh dịch để chuyển sang công đoạn Chỉ trường hợp đặc biệt cần phải xử lý kết tủa phần protein lọc lại dịch lần thứ hai Hiện tượng tự phân hệ sợi nấm thường kéo theo hậu làm cho dịch khó lọc Thu hồi sinh khối nấm: Phần sinh khối nấm rửa sạch, sấy khô sử dụng để chế biến thức ăn gia súc 3.2.5 Trích ly : Penicillin thường trích ly dạng axít khỏi dịch lọc dung môi amylacetat butylacetat pH = 2,0 - 2,5, nhiệt độ - 30C Nhằm hạn chế lượng penicillin bị 28 phân huỷ, q trình trích ly thực thời gian ngắn thiết bị trích ly ngược dịng liên tục kiểu ly tâm nhiều tầng cánh Đồng thời, thời gian trích ly cần giám sát chặt chẽ thông số công nghệ như: nhiệt độ pH, độ vô khuẩn để hạn chế tổn thất phân huỷ penicillin Dịch lên men sau lọc bơm trộn đồng thời với dung dịch H2SO4 H3PO4 lỗng có bổ sung thêm chất chống tạo nhũ bơm song song với dung mơi trích ly vào thiết bị Tỉ lệ dịch lọc: dung môi thường chọn khoảng - 10V dịch lọc /1V dung môi Trong số công nghệ, nhằm cải thiện chất lượng sản phẩm, người ta áp dụng phương pháp trích ly hai lần dung mơi, với lần đầu trích ly penicillin amylacetat butylacetat; penicillin lại trích ly ngược sang dung dịch đêm pH = 7,2 - 7,5, thường dung dịch KOH lỗng dung dịch NaHCO3; sau penicillin lại trích ly sang dung mơi lần thứ 2, với lượng dung mơi hơn.(hình 7) Hình Sơ đồ cơng nghệ trích ly lần dung mơi tinh chế penicillin 3.2.6 Tẩy màu : Để tẩy màu loại bỏ số tạp chất khác, người ta thường bổ sung trực tiếp chất hấp phụ vào dung môi chứa penicillin sau trích ly, sử dụng phổ biến than hoạt tính Sau than hoạt tính tách rửa lại sử dụng thiết bị lọc hút băng tải thiết 29 bị lọc hút kiểu thùng quay Phần than sau lọc đưa chưng thu hồi dung mơi xử lý hồn ngun, phục vụ cho mẻ sau 3.2.7 Kết tinh, lọc, rửa sấy thu penicillin tự nhiên: Việc kết tinh penicillin V hay penicillin G dạng muối thực đơn giản, cách bổ sung trực tiếp vào dung môi sau tẩy màu lượng nhỏ kali acetat (hay natri acetat) người ta trích ly lại sang dung dịch KOH loãng (hay NaOH loãng), tiến hành chân khơng nhiệt độ thấp, sau bổ sung BuOH để penicillin tự kết tinh Các thông số cơng nghệ có ảnh hưởng lớn đến hiệu qủa kết tinh : nồng độ penicillin, nồng độ muối acetat, pH dung môi hay pH dung dịch cô đặc, nhiệt độ kết tinh Sau kết tinh, tinh thể penicillin lọc tách máy lọc hút thùng quay Để đảm bảo độ tinh khiết cao hơn, tiến hành hòa tan kết tinh lại penicillin Khi sản phẩm đạt độ tinh theo yêu cầu, thường độ tinh khiết không 99,5%, chúng lọc tánh tinh thể; rửa làm khô sơ dung môi kỵ nước izopropanol hay butylalcohl; hút chân không tách dung môi máy lọc băng tải sấy khơng khí nóng đến dạng sản phẩm bột muối penicillin Sản phẩm này, phần sử dụng trực tiếp để pha chế thuốc kháng sinh penicillin; lại, phần lớn sử dụng làm nguyên liệu phục vụ cho việc sản xuất sản phẩm penicillin cephalosporin bán tổng hợp khác Ngoài ra, để sản xuất sản phẩm penicillin có độ tinh khiết cao, người ta cần phải sử dụng phối hợp thêm số giải pháp công nghệ khác 3.2.8 Sản xuất penicillin bán tổng hợp từ penicillin tự nhiên: Về nguyên tắc, để tạo penicillin lên men sinh tổng hợp dùng phương pháp thay đổi mạch nhánh cách sử dụng tiền chất khác Tuy nhiên đường lên men trực tiếp người ta có khả tiến hành với penicillin G V Còn để triển khai sản suất công nghiệp, người ta sử dụng penicillin G hay V để chế tạo 6-APA nguyên liệu chủ yếu trình bán tổng hợp penicillin Theo cấu trúc hóa học, penicillin tự nhiên hợp chất dị vịng acid amin có tên gọi acid 6–aminopenicillanic (6-APA) Việc tìm phân tử 6-APA mở hướng để sản xuất penicilin bán tổng hợp cách gắn vào mạch nhánh khác vào phân tử 6-APA đường hóa học hay sinh học Có hai hướng acyl hóa nhóm NH2 vị trí số ester hóa nhóm –COOH vị trí số 30 Enzyme penicillinamidase đóng vai trị việc thủy phân penicillin G V tạo thành acid 6- aminopenicillanic (6-APA) acid phenyl acetic 6- APA tiền chất quan trọng sử dụng để sản xuất kháng sinh họ β-lactam hoạt động cao 6-APA sản xuất phương pháp lên men chủng penicillinum Động học trình lên men tạo 6-APA: đồng hóa hydratcarbon nhanh, pH tăng dần giai đoạn tạo 6- APA từ 7.0 -7.4 Thời gian lên men kéo dài từ 108- 120 Tuy nhiên trình cho hiệu suất thấp 6-APA tạo thành đồng thời với penicillin tự nhiên , mặc khác chi phí cho q trình tách chiết cao Vì thực tế người ta không sử dụng phương pháp Hiện sử dụng enzyme cố định phương pháp phổ biến để sản xuất 6-APA công nghiệp Sử dụng enzyme penicillin acylase để cắt mạnh nhánh penicillin G Phương pháp có nhiều ưu điểm, điều kiện phản ứng dễ dàng nên mang lại hiệu kinh tế cao Hiện số hãng dược phẩm áp dụng biện pháp này, điển hình hãng dược phẩm Snam Progetti (Italia) với sản lượng khoảng 40 tấn/ năm Phương pháp enzyme cố định để sản xuất 6-APA cho hiệu tương đối cao (9095%) áp dụng rộng rải nhiều nước, mang lại hiệu kinh tế cao Hơn 50% 6_APA giới sản xuất theo phương pháp enzyme cố định Hiện số nhà máy sản xuất penicillin cho xuất xưởng thành phẩm 6-APA 31 Các thiết bị dùng sản xuất penicillin : Thiết bị sấy chân không Thiết bị lọc sinh học 32 Thiết bị lọc than hoạt tính Thiết bị sấy Khu vực lên men sản xuất penicillin 33 Phần II – Kết luận Penicillin lọai kháng sinh dùng để điều trị viêm nhiễm người Khám phá penicillin từ phát tình cờ có ý nghĩa to lớn nhân lọai Penicillin thông thường sản xuất phương pháp lên men chìm ưa khí chiết xuất độ pH thấp từ dịch lên men sử dụng butyl axetat kerosen Do tính khơng ổn định penicillin độ pH thấp, quy trình chiết xuất cần thực nhiệt độ thấp, song có tới 10-15% sản phẩm bị thất sử dụng quy trình Ngoài suất tương đối thấp, phương pháp sản xuất truyền thống có chi phí cao, tiêu thụ nhiều lượng để thu hồi butyl axetat từ chất – quy trình địi hỏi nhiều cơng đoạn Penicillin thải nhanh người bệnh nhân có chức thận bình thường, đưa vào thể qua đường tỉnh mạch bệnh nhân bị nhiễm trùng nặng tác dụng ngược quan trọng phổ biến Penicillin dị ứng Vì kiến thức cịn hạn hẹp nên có nhiều sai sót mong bạn đóng góp ý kiến để tiểu luận hồn chỉnh 34 Phần III:Tài liệu tham khảo [1] Nguyễn Văn Cách, Công nghệ lên men chất kháng sinh, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 2005 [2] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Tỵ, Vi sinh vật học, Nhà xuất giáo dục 1997 [3] Trương Thị Mimh Hạnh, Giáo án môn học công nghệ dược phẩm , tài liệu điện tử [4] Nguyễn Đức Lượng, Vi sinh vật học công nghiệp, Nhà xuất Đại học quốc gia TP.Hồ Chí Minh [5] Hình ảnh từ internet 35 ... chủng ban đầu -Triển khai thành cơng cơng nghệ lên men chìm quy mơ sản xuất công nghiệp để sản xuất Penicillin G (1942) việc hồn thiện cơng nghệ lên men sản phẩm khác -Việc phát hiện, tinh chế... để sản xuất hàng loạt chế phẩm penicillin bán tổng hợp khác Ngày giới sản xuất 500 chế phẩm penicillin ( lên men trực tiếp hai sản phẩm penicillin V penicillin G) tiếp tục triển khai để sản xuất. .. nghệ lên men sản xuất penicillin mang nét đặc thù riêng sở sản xuất thông tin hạn chế cung cấp công khai, sáng chế thường giới hạn cơng đoạn định; khó đưa công nghệ tổng quát chung Theo công nghệ