Nghiên Cứu Tách Chiết Thrombin Từ Phổi Bò Ứng Dụng Làm Nguyên Liệu Tạo Băng Gạc Cầm Máu Hanh

Luận văn Tốt nghiệp khóa K17 – 2015 Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LÊ THỊ VUI NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT THROMBIN TỪ PHỔI BÕ ỨNG DỤNG LÀM NGUYÊN LIỆU TẠO BĂNG GẠC CẦM MÁU NHANH VẾT THƢƠNG (Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2015 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui Luận văn Tốt nghiệp khóa K17 – 2015 Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LÊ THỊ VUI NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT THROMBIN TỪ PHỔI BÕ ỨNG DỤNG LÀM NGUYÊN LIỆU TẠO BĂNG GẠC CẦM MÁU NHANH VẾT THƢƠNG Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC HƢỚNG DẪN KHOA HỌC : TS LÊ MINH TRÍ VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ QUÂN SỰ VIỆT NAM e Hà Nội - 2015 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui Luận văn Tốt nghiệp khóa K17 – 2015 Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật MỤC LỤC MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU 11 Lý chọn đề tài 11 Mục tiêu nghiên cứu 12 Nội dung nghiên cứu 12 Những điểm đề tài Error! Bookmark not defined 4.1 Trên giới Error! Bookmark not defined 4.2 Trong nước Error! Bookmark not defined CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 13 1.1 CƠ CHẾ CẦM MÁU VÀ CÁC PHƢƠNG PHÁP CẦM MÁU 13 1.1.1 Cơ chế cầm máu 13 1.1.2 Các yếu tố đông máu 13 1.1.3 Các giai đoạn cầm máu 14 1.1.3.1 Co mạch chỗ 14 1.1.3.2 Tạo nút tiểu cầu 14 1.1.3.3 Tạo cục máu đông 15 1.1.3.4 Co cục máu đông tan cục máu đông 18 1.1.4 Các phƣơng pháp cầm máu 19 1.1.4.1 Cầm máu thảo dược 19 1.1.4.2 Cầm máu phương pháp vật lý 19 1.1.4.3 Cầm máu số chất hóa học 20 1.2 THROMBIN 20 1.2.1 Khái quát chung thrombin 20 1.2.1.1 Cấu chúc chức 20 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui Luận văn Tốt nghiệp khóa K17 – 2015 Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật 1.2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động thrombin 22 1.2.1.4 Ứng dụng thrombin 23 1.2.2 Prothrombin 24 1.2.2.1 Thành phần prothrombin 24 1.2.2.2 Thời gian prothrombin 25 1.2.2.3 Kích hoạt prothrombin 25 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 27 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị 30 2.1.1 Vật liệu 30 2.1.2 Hóa chất 31 2.1.3 Dung dịch đệm 31 2.1.4 Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm 32 2.1.4.1 Dụng cụ 32 2.1.4.2 Thiết bị 32 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 33 2.2.1 Khảo sát hàm lƣợng thrombin phổi bò 33 2.2.1.1 Tách chiết thrombin từ mẫu phởi bị 33 2.2.1.3 Khảo sát thrombin mẫu phổi 33 2.2.1.4 Khảo sát hoạt tính thrombin 33 2.2.2 Tối ƣu hóa quy trình tách chiết thrombin từ phổi bò 33 2.2.2.1 Tách thrombin nồng độ ethanol khác 33 2.2.2.2 Tách thrombin nồng độ aceton khác 35 2.2.2.3 Tách chiết thrombin ngưỡng nhiệt độ khác 36 2.2.2.4 Tách chiết thrombin độ pH khác 38 2.2.2.5 Tách chiết thrombin với ngưỡng thời gian ngâm tách mẫu khác 40 2.2.2.6 Tối ưu hóa quy trình tách chiết thrombin từ phởi bò 43 2.2.3 Nghiên cứu bổ sung chất an định (bền) cấu trúc thrombin tannic acid điều kiện môi trƣờng thƣờng 43 2.2.9.1 Đánh giá khả chuyển hóa fibrinogen của thrombin 43 2.2.9.2 Ảnh hưởng chất an định 43 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui Luận văn Tốt nghiệp khóa K17 – 2015 Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật 3.1 Khảo sát hoạt tính thrombin số mẫu phổi bị đƣợc thu thập vùng khác 44 3.2 Tối ƣu hóa quy trình tách chiết thrombin từ phổi bò 46 3.2.1 Tách thrombin nồng độ ethanol khác 46 3.2.2.Tách prothrombin nồng độ acetone khác 49 3.2.3 Tách thrombin điều kiện nhiệt độ khác 49 3.2.4 Tách thrombin cách ngƣỡng pH khác 53 3.2.5 Tách thrombin với ngƣỡng thời gian ngâm tách mẫu khác 54 3.3 Tối ƣu hóa quy trình tách chiết thrombin từ phổi bị 56 3.4 Kết nghiên cứu bổ sung chất an định (bền) cấu trúc thrombin tannic acid điều kiện môi trƣờng thƣờng 59 3.4.1 Đánh giá ảnh hƣởng chất an định acid tannic thrombin 59 3.4.2 Ảnh hƣởng chất an định thrombin 59 3.4.3 Ảnh hƣởng chất an định thrombin bổ sung 0,05% tannic acid 62 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66 Kết luận 66 Kiến nghị 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 I Tài liệu Tiếng Việt 67 II Tài liệu Tiếng Anh 68 PHỤ LỤC 73 PHỤ LỤC 1: Quy trình cơng nghệ gắn thrombin lên băng gạc phƣơng pháp khác (phun, tẩm) 73 PHỤ LỤC 2: Một số hình ảnh thử nghiệm cầm máu thỏ băng gạc tẩm thrombin 75 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui Luận văn Tốt nghiệp khóa K17 – 2015 Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi đƣợc hƣớng dẫn khoa học Ts Lê Minh Trí Các nội dung nghiên cứu, kết quả, số liệu công bố đề tài trung thực đảm bảo độ tin cậy Những số liệu bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá đƣợc tác giả thu thập từ ng̀n khác có ghi rõ phần tài liệu tham khảo Ngồi ra, luận văn cịn sử dụng số nhận xét, đánh giá nhƣ số liệu tác giả khác, quan tổ chức khác có trích dẫn thích ng̀n gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Tác giả Lê Thị Vui Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui Luận văn Tốt nghiệp khóa K17 – 2015 Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Lê Minh Trí – Phịng Hóa sinh - Viê ̣n Hóa học - Vật liê ̣u, Viện KH & CN Quân Việt Nam - người trực tiếp hướng dẫn tơi thực nghiên cứu mình, đem lại cho tơi kiến thức bở trợ, vơ có ích thời gian thực nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ toàn thể cán - nhân viên Phịng Cơng nghệ Enzyme – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm khoa học cơng nghệ Việt nam nhiệt tình hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi để thực nghiên cứu Cũng xin gửi lời cám ơn chân thành tới Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau đại học, Đại học Thái Nguyên, Ban Chủ nhiệm Viện Hoá học – Vật liệu, Viện KH & CN Quân Việt Nam tạo điều kiện cho tơi q trình học tập nghiên cứu Cơng trình hỗ trợ từ nhiệm vụ cấp Bộ Quốc phịng « Nghiên cứu chế tạo băng gạc cầm máu nhanh vết thương từ thrombin tannic acid » Cuối tơi xin gửi lời cám ơn đến gia đình, bạn bè, người bên tôi, động viên khuyến khích tơi q trình thực đề tài nghiên cứu Hà Nội, ngày 18 tháng 11 năm 2015 Lê Thị Vui Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui Luận văn Tốt nghiệp khóa K17 – 2015 Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng 1.1 Các yếu tố đơng máu 2.1 Hóa chất sử dụng 2.2 Các dung dịch đệm 2.3 Các thiết bị đƣợc sử dụng 3.1 Ảnh hƣởng nồng độ ethanol q trình tách tới hoạt tính thrombin 3.2 Ảnh hƣởng nờng độ acetone q trình tách tới hoạt tính thrombin 3.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ q trình tách tới hoạt tính thrombin 3.4 Ảnh hƣởng pH q trình tách tới hoạt tính thrombin 3.5 Ảnh hƣởng thời gian ngâm tách mẫu q trình tách tới hoạt tính thrombin 3.6 Ảnh hƣởng số yếu tố tới hoạt tí nh thrombin 3.7 Đánh giá chất an định đến thrombin 3.8 Đánh giá chất an định đến thrombin bổ sung 0,05% tannic acid Trang Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui Luận văn Tốt nghiệp khóa K17 – 2015 Viện Sinh thái Tài ngun Sinh vật DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình 1.1 Minh hoạ đơng máu nội sinh ngoại sinh 1.2 Cấu trúc thrombin ngƣời 1.3 Cấu trúc không gian prothrombin 1.4 Cơ chế hoa ̣t đô ̣ng thrombin 1.5 Thành phần prothrombin 1.6 Sơ đồ về sƣ̣ hoa ̣t đô ̣ng của prothrombin 2.1 Các mẫu phổi thu thập 3.1 Điện di đồ SDS-PAGE 3.2 Khảo sát hoạt tính thrombin mẫu phổi bò khác 3.3 SDS-PAGE protein tách từ mẫu phổi bò sử dụng ethanol 3.4 SDS-PAGE protein tách tƣ̀ mẫu phổ i bò sƣ̉ du ̣ng acetone 3.5 SDS-PAGE protein tách tƣ̀ mẫu phổ i bò nhiệt độ khác 3.6 SDS-PAGE protein tách tƣ̀ mẫu phổ i bò ở pH khác 3.7 SDS-PAGE protein tách tƣ̀ mẫu phổ i bò ngâm mẫu 3.8 Khảo sát khả chuyển hóa fibrionogen thrombin acid tannic 3.9 Ảnh hƣởng Tween 20 thrombin thời điểm ban đầu 3.10 Ảnh hƣởng tween 80 thrombin thời điểm ban đầu 3.11 Ảnh hƣởng triton x100 thrombin thời điểm ban đầu 3.12 Ảnh hƣởng SDS thrombin thời điểm ban đầu 3.13 Ảnh hƣởng PEG 4000 thrombin Trang Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui Luận văn Tốt nghiệp khóa K17 – 2015 Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật 3.14 Ảnh hƣởng tween 20 thrombin bổ sung 0,05% acid tannic thời điểm ban đầu 3.15 Ảnh hƣởng tween 80 thrombin bổ sung 0,05% acid tannic thời điểm ban đầu 3.16 Ảnh hƣởng triton x100 thrombin bổ sung 0,05% acid tannic thời điểm ban đầu 3.17 Ảnh hƣởng PEG 4000 thrombin bổ sung 0,05% acid tannic thời điểm ban đầu 3.18 Ảnh hƣởng SDS thrombin bổ sung 0,05% acid tannic thời điểm ban đầu Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 10 Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui Luận văn Tốt nghiệp khóa K17 – 2015 A Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật B Hình 3.14 Ảnh hưởng tween 20 thrombin bổ sung 0,05% acid tannic thời điểm ban đầu (A), sau (B) sau 24 (C) (ĐC(-): không C thrombin; ĐC(+): có thrombin) Ảnh hưởng chất Tween 80 A B Hình 3.15 Ảnh hưởng tween 80 thrombin bổ sung 0,05% acid tannic thời điểm ban đầu (A), sau (B) C sau 24 (C) (ĐC(-): khơng thrombin; ĐC(+): có thrombin) Ảnh hưởng chất Trixton X100 A B Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 64 Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui Luận văn Tốt nghiệp khóa K17 – 2015 Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật Hình 3.16 Ảnh hưởng triton x100 thrombin bổ sung 0,05% acid tannic thời điểm ban đầu (A), sau (B) sau 24 (C) (ĐC(-): khơng C thrombin; ĐC(+): có thrombin) Ảnh hưởng chất PEG 4000 A B Hình 3.17 Ảnh hưởng PEG 4000 thrombin bổ sung 0,05% acid tannic thời điểm ban đầu (A), sau C (B) sau 24 (C) ĐC(-): không thrombin; ĐC(+): có thrombin Ảnh hưởng chất SDS A B Hình 3.18 Ảnh hưởng SDS thrombin bở sung 0,05% acid tannic thời điểm ban đầu (A), sau (B) sau 24 (C) (ĐC(-): khơng thrombin; ĐC(+): có thrombin) Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 65 Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui Luận văn Tốt nghiệp khóa K17 – 2015 Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã tách đƣợc thrombin từ phổi bò với trọng lƣợng phân tử 37 kDa Đã xác định đƣợc điều kiện tối ƣu để tách chiết thrombin từ phổi bò pH 8,5 , thời gian ngâm tách mẫu 12 đến 24 giờ, nhiệt độ oC đến 8oC, nồng độ aceton 50%, nờng độ ethanol 20%, dùng Tween 20 PEG 4000 nồng độ từ 0,1% đến 1% nhƣ chất an định thrombin Đã thử nghiệm khả cầm máu thrombin tách chiết đƣợc theo hai cách : tẩm vào băng gạc phun trực tiếp thrombin vào vết thƣơng Thời gian cầm máu băng gạc đến 10 giây, theo phƣơng pháp phun – giây Kiến nghị - Tiếp tục nghiên xây dựng phƣơng pháp chế tạo băng gạc cầm máu từ nguyên liệu thrombin - Hồn thiện quy trình đánh giá độ an tồn băng gạc đƣợc gắn thrombin - Xây dựng quy trình bảo quản băng gạc đƣợc gắn thrombin Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 66 Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui Luận văn Tốt nghiệp khóa K17 – 2015 Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu Tiếng Việt Nguyễn Hữu Chấn, Nguyễn Thị Hà, Nguyễn Nghiêm Luật, Hồng Bích Ngọc, Vũ Thị Phƣơng 2001 Hoá sinh Nxb Y học - Hà Nội Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng 1999 Hoá sinh học Nxb Giáo dục Hà Nội Trịnh Bình Dy2006 “Sinh lý học cầm máu đông máu” Sinh lý học tập 1, NXB Y học Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Đình Hun 1998 Giáo trình sinh hố đại Nxb Giáo dục - Hà Nội Nguyễn Tiến Thắng 2003 Công nghệ enzyme protein Viện Sinh học Nhiệt Đới Tp Hờ Chí Minh Lê Ngọc Tú, Lê Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thăng, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lƣu Duẫn, Lê Dỗn Diên 2002 Hố sinh công nghiệp Nxb Khoa học & Kỹ thuật - Hà Nội Nguyễn Đức Lƣợng 2004 Công nghệ enzyme, , NXB Đại học Quốc gia Thành Phố Hờ Chí Minh Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy Nguyễn Xuân Sâm 2004 Công nghệ enzyme NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Văn Uyển Nguyễn Tiến Thắng 1999 Những kiến thức công nghệ sinh học NXB Giáo dục, Hà Nội Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 67 Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui Luận văn Tốt nghiệp khóa K17 – 2015 II Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật Tài liệu Tiếng Anh Aizawa P et al., (2008) Large-scale preparation of thrombin from human plasma In Elsevier, pp 560-567 Arni RK et al., (1993) Structures of the noncovalent complexes of human and bovine prothrombin fragment with human PPACK-thrombin In ACS Publications, pp 4727-4737 Ajtai K., Szilagyi L 1985 Biokémiai gyakorlatok.Tankonyv Jankonyv Kiado, Budapest Bains W 2003 Biotechnology from A to Z Oxford University Press Inc New York, USA Bick RL, Murano G (1994) Physiology of hemostasis In, p 677 Bouchard BA et al., (1997) Effector cell protease receptor-1, a platelet activation-dependent membrane protein, regulates prothrombinase-catalyzed thrombin generation In ASBMB, pp 9244-9251 Bourin M-C, Lindahl U (1993) Glycosaminoglycans and the regulation of blood coagulation In Portland Press Ltd, p 313 Brummel KE et al., (1999) An integrated study of fibrinogen during blood coagulation In ASBMB, pp 22862-22870 Butenas S et al., (1997) Evaluation of the initiation phase of blood coagulation using ultrasensitive assays for serine proteases In ASBMB, pp 21527-21533 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 68 Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui Luận văn Tốt nghiệp khóa K17 – 2015 10 Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật Camera M et al., (1999) Cooperation between VEGF and TNF-α is necessary for exposure of active tissue factor on the surface of human endothelial cells In Am Heart Assoc, pp 531-537 11 Camire RM et al., (1995) The mechanism of inactivation of human platelet factor Va from normal and activated protein C-resistant individuals In ASBMB, pp 20794-20800 12 Duckers C et al., (2009) Advances in understanding the bleeding diathesis in factor V deficiency In Wiley Online Library, pp 17-26 13 Eichinger S et al., (1995) Determinants of plasma factor VIIa levels in humans In American Society of Hematology, pp 3021-3025 14 Esmon CT et al., (1974) The conversion of prothrombin to thrombin V the activation of prothrombin by factor Xa in the present of phospholipid In ASBMB, pp 7798-7807 15 Fager AM et al., (2010) Properties of procoagulant platelets: defining and characterizing the subpopulation binding a functional prothrombinase Arterioscler Thromb Vasc Biol 30:2400-2407 16 Franza BR et al., (1975) Activation of human prothrombin by a procoagulant fraction from the venom of Echis carinatus Identification of a high molecular weight intermediate with thrombin activity In ASBMB, pp 70577068 17 Furie B, Furie BC (2005) Thrombus formation in vivo In Am Soc Clin Investig, pp 3355-3362 18 Gailani D, Broze GJ (1991) Factor XI activation in a revised model of blood coagulation In American Association for the Advancement of Science, pp 909-912 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 69 Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui Luận văn Tốt nghiệp khóa K17 – 2015 19 Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật Gentry PA (2004) Comparative aspects of blood coagulation In Elsevier, pp 238-251 20 Goldsack NR et al., (1998) Molecules in focus Thrombin In Elsevier, pp 641-646 21 Greenhalgh DG et al., (2009) Recombinant thrombin: safety and immunogenicity in burn wound excision and grafting In LWW, pp 371-379 22 Heldebrant CM et al., (1973) The activation of prothrombin II Partial reactions, physical and chemical characterization of the intermediates of activation In ASBMB, pp 7149-7163 23 Hugel Bnd et al., (1999) Elevated levels of circulating procoagulant microparticles in patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria and aplastic anemia In American Society of Hematology, pp 3451-3456 24 Krishnaswamy S et al., (1987) Activation of human prothrombin by human prothrombinase Influence of factor Va on the reaction mechanism In ASBMB, pp 3291-3299 25 Kerese I 1984 Methods of Protein analysis Akademiai Kiado, Budapes Stryer l., 1981 Biochmistry W H Freeman and company, San francisco 26 27 Lee JM 2000 Biochemical Engineering Prentice Hall Inc USA Ratledge C and Kristiansen B 2002 Basic Biotechnology Cambridge University Press, UK 28 29 Lawson JH, Mann KG (1991) Cooperative activation of human factor IX by the human extrinsic pathway of blood coagulation In ASBMB, pp 1131711327 30 Mann KG et al., (1992) Surface-dependent hemostasis In: Seminars in hematology, pp 213-226 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 70 Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui Luận văn Tốt nghiệp khóa K17 – 2015 31 Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật Mann KG et al., (1990) Surface-dependent reactions of the vitamin K- dependent enzyme complexes Blood 76:1-16 32 Markland FS, Damus PS (1971) Purification and properties of a thrombin- like enzyme from the venom of Crotalus adamanteus (Eastern diamondback rattlesnake) In ASBMB, pp 6460-6473 33 Miletich JP et al., (1979) Deficiency of factor Xa-factor Va binding sites on the platelets of a patient with a bleeding disorder In American Society of Hematology, pp 1015-1022 34 Minnema MC et al., (1999) The role of factor XI in coagulation: a matter of revision In: Seminars in thrombosis and hemostasis New York: Stratton Intercontinental Medical Book Corporation, c1974-, pp 419-428 35 Morrissey JH et al., (1993) Quantitation of activated factor VII levels in plasma using a tissue factor mutant selectively deficient in promoting factor VII activation In American Society of Hematology, pp 734-744 36 Mosesson MW (1992) The roles of fibrinogen and fibrin in hemostasis and thrombosis In: Seminars in hematology, p 177 37 Naski MC et al., (1991) Characterization of the kinetic pathway for fibrin promotion of α-thrombin catalyzed activation of plasma factor XIII Biochemistry 30:934-941 38 Nesheim ME et al., (1979) The contribution of bovine factor V and factor Va to the activity of prothrombinase In ASBMB, pp 10952-10962 39 Osterud B et al., (1977) Factor V activity of platelets: evidence for an activated factor V molecule and for a platelet activator In American Society of Hematology, pp 819-834 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 71 Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui Luận văn Tốt nghiệp khóa K17 – 2015 Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật Rand MD et al., (1994) Platelet coagulation factor Va: the major 40 secretory platelet phosphoprotein In American Society of Hematology, pp 2180-2190 41 Rosing J et al., (1986) Formation of meizothrombin as intermediate in factor Xa-catalyzed prothrombin activation In ASBMB, pp 4224-4228 42 Seegers WH (1940) Purification of prothrombin and thrombin: chemical properties of purified preparations In ASBMB, pp 103-111 43 Seegers WH et al., (1938) The purification of thrombin In ASBMB, pp 91-95 44 Singla NK et al., (2009) A phase 3b, open-label, single-group immunogenicity and safety study of topical recombinant thrombin in surgical hemostasis In Elsevier, pp 68-74 45 Stubbs MT, Bode W (1995) The clot thickens: clues provided by thrombin structure In Elsevier, pp 23-28 46 Tanaka-Azevedo AM et al., (2010) Thrombin inhibitors from different animals In Hindawi Publishing Corporation 47 Tollefsen DM et al., (1982) Heparin cofactor II Purification and properties of a heparin-dependent inhibitor of thrombin in human plasma In ASBMB, pp 2162-2169 48 Tracy PB et al., (1985) Human prothrombinase complex assembly and function on isolated peripheral blood cell populations In ASBMB, pp 21192124 49 Wencel-Drake JD et al., (1986) Ultrastructural localization of coagulation factor V in human platelets In American Society of Hematology, pp 244-249 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 72 Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui Luận văn Tốt nghiệp khóa K17 – 2015 50 Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật Yang H-L et al., (1994) Humic acid induces expression of tissue factor by cultured endothelial cells: regulation by cytosolic calcium and protein kinase C In, pp 325-330 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: Quy trình cơng nghệ gắn thrombin lên băng gạc phƣơng pháp khác (phun, tẩm) 1.1 Đánh giá khả chuyể n hóa fibrinogen của thrombin Dịch thrombin sau tách từ mẫu đƣợc khảo sát hoạt tính có mẫu với phản ứng 20 µl fibrinogen 200 l NaCl 0,9%; sau đó bổ sung 50 l thrombin; với mẫu đố i chƣ́ng không sƣ̉ du ̣ng thrombin Quan sát thời gian chuyể n hóa fibrinogen thành fibrin 1.2 Điện di SDS-PAGE Khối lƣợng phân tử tƣơng đối protein tinh độ dịch protein đƣợc đánh giá điện di gel polyacrylamide (Laemmli, 1970) 1.3 Xác định hàm lƣợng protein Hàm lƣợng protein đƣợc xác định theo Bradford (Bradford, 1976) Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 73 Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui Luận văn Tốt nghiệp khóa K17 – 2015 Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật 1.4 Nghiên cứu điều kiện gắn thrombin lên gạc Thrombin sau tinh đƣợc kiểm tra điện di hoạt tính chuyể n hóa fibrinogen của thrombin Dịch thrombin đƣợc phun tẩm lên gạc urgon gạc có kích thƣớc 2x6 cm, 4x6 cm 10x10 cm 1.5 Kiểm tra hiệu sử dụng băng gạc gắn thrombin thỏ trắng Thỏ đƣợc gây chảy máu ỏ đùi, đƣợc phun dung dịch thrombin gắn gạc có gắn thrombin vào vết thƣơng Quan sát thời gian đông máu Mẫu đối chứng đƣợc gây chảy máu để máu đông tự nhiên Thrombin tinh Băng /gạc 200 l/băng Băng có tầm thrombin Số hóa Trung tâm Học liệugiá – ĐHTN Đánh độ ổn http://www.lrc.tnu.edu.vn định 74 Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui Luận văn Tốt nghiệp khóa K17 – 2015 Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật PHỤ LỤC 2: Một số hình ảnh thử nghiệm cầm máu thỏ băng gạc tẩm thrombin Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 75 Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui Luận văn Tốt nghiệp khóa K17 – 2015 Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật Vết thƣơng vị trí đùi thỏ, sử dụng băng tẩm thrombin (tách chiết từ phổi bò), ngƣng chảy máu sau 10 giây Khơng có tƣợng chảy máu thứ phát Vết thƣơng vị trí đùi thỏ, sử dụng băng tẩm thrombin (tách chiết từ máu), ngƣng chảy máu sau 15 giây Khơng có tƣợng chảy máu thứ phát Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 76 Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui Luận văn Tốt nghiệp khóa K17 – 2015 Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật Vết thƣơng vị trí đùi thỏ, sử dụng băng thƣờng, ngƣng chảy máu sau phút, xuất chảy máu thứ phát Vết thƣơng vị trí ngực thỏ, ngƣng chảy máu sau giây sau tiêm dịch thrombin Khơng có tƣợng chảy máu thứ phát Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 77 Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui Luận văn Tốt nghiệp khóa K17 – 2015 Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật Xác nhận ngƣời hƣớng dẫn Lê Minh Trí Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 78 Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Lê Thị Vui ... thrombin Chính ứng dụng tiềm lớn thrombin, tiến hành đề tài : ? ?Nghiên cứu tách chiết thrombin từ phổi bò ứng dụng làm nguyên liệu tạo băng gạc cầm máu nhanh vết thƣơng” Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN... Tài nguyên Sinh vật VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LÊ THỊ VUI NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT THROMBIN TỪ PHỔI BÕ ỨNG DỤNG LÀM NGUYÊN LIỆU TẠO BĂNG GẠC CẦM... chất đến trình tách chiết thrombin từ phổi bò; Nghiên cứu điều kiện tách chiết, tinh thrombin từ phổi bò Đánh giá ảnh hƣởng số chất an định lên hoạt tính thrombin Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN