Báo cáo khoa học Viện Chăn Nuôi 2006 1 Kết quả nghiên cứu tách chiết ADn trong phân bò Hoang dã tại Việt Nam * Lờ Quang Nam 1 , R.Taiana 2 Lờ Th Thuý 1 , Miguel. F 2 , V Chớ Cng 3 , J.C. Maillard 3 1 Hợp phần Di truyền - Vin Chn Nuụi; 2 CIRAD, Chuyờn gia sinh thỏi hc; 3 Giỏm c d ỏn * ti nm trong khuụn kh d ỏn FFEM Đặt vấn đề Vic thu thp mu v tỏch chit ADN gi vai trũ quyt nh u tiờn ti thnh cụng trong nghiờn cu a dng di truyn. Cụng vic ly mu mỏu, mụ hoc lụng bũ hoang dó gp nhiu tr ngi hn so vi bũ nh do tớnh cht ca nú l hong s, rt him khi nhỡn thy chỳng trong t nhiờn, nht l vi nhng n cú s lng ớt. S dng phõn lm ngun cung cp ADN l cỏch lm hp lý khi nghiờn cu di truyn bũ hoang dó nc ta. Mt s nghiờn cu gn õy v vic s dng ADN trong nhõn t bo cú ngun gc t phõn ó khng nh tớnh tin cy ca cỏch tip cn ny (Ernest et al 2000; Kohn et al. 1999; Taberlet et al. 1996, 1997; Wasser et al. 1997). Bờn cnh ú, mụt s nghiờn cu khỏc li ch ra cỏc khú khn tim n liờn quan n t l ln cỏc phn ng PCR cho kt qu khụng chớnh xỏc do hin tng mt mt alen trong kiu gen d hp (allelic drobout) hoc do cỏc alen gi (false alleles) (Huber at al. 2002, 2003; Taberlet et al. 1996, 1999; Taberlet and Luikart 1999). iu ny dn n s cn thit phi thc hin phn ng PCR nhiu ln xỏc nh kt qu ỳng. Ngc li, vic s dng phõn nh l ngun cung cp ADN ti th phc tp hn do cú nhiu ti th trong t bo (Kovach et al. 2003). Hin nay cỏc nghiờn cu ADN nhõn t bo tỏch t phõn c tp trung vo hai hng c bn: S dng cỏc phng phỏp tỏch ADN thớch hp khc phc cỏc nhc im trờn (Fernanado et al. 2003, Flagstad et al. 1999) v hng th hai l lm th no thu c kt qu chớnh xỏc nht khi phi i mt vi t l cao ca hin tng mt mt alen trong kiu gen d hp v hin tng cỏc alen gi nh ó núi trờn (Creel et al. 2003, Miller et al. 2002, Taberlet et al. 1996). Mt khú khn khỏc khi tin hnh thớ nghim trờn ADN phõn l s c ch phn ng PCR ca cỏc hp cht th cp thc vt (plant secondary compounds) cú trong thc n (Fernando 2003). Tuy nhiờn nghiờn cu ca Wehausen et al. (2004) ch ra mt iu ht sc thun li l phn ng PCR tin hnh trờn ADN c tỏch t lp phõn b mt cho kt qu tt nht. 2 Phần Nghiên cứu về Dinh dỡng và Thức ăn Vật nuôi Vit Nam cú khớ hu rt núng v m li cao, vỡ th khi bi tit ra, ADN trong phõn rt d b phỏ hu do nhit , m v tia t ngoi t mụi trng bờn ngoi. Do vy 2 vn cn t ra trong nghiờn cu ca chỳng tụi l: - Nghiờn cu k thut tỏch chit ADN trong phõn bũ rng. - Nghiờn cu thi gian ti a ca phõn trong mụi trng t nhiờn l bao nhiờu vn thu c ADN m bo cht lng sau khi tỏch. - Sau khi ly mu, thi gian v dung dch bo qun hp lý nht thu c ADN cú cht lng sau khi tỏch. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu i tng nghiờn cu Cỏc loi bũ hoang dó ti Vit Nam nh bũ rng Bengteng, bũ xỏm. Trong nghiờn cu ca chỳng tụi ch yu l bũ Bos gaurus: ( cũn gi con minh, bũ tút). ú l bũ en ln sng cỏc khu vc i nỳi n v Nam , c tỡm thy trong t nhiờn hoc di dng thun hoỏ. Chỳng cũn c gi l bũ rng Mó Lai hoc "bũ rng Bizon n ". Nhúm hoang dó v nhúm thun hoỏ ụi khi c xem l cỏc loi riờng bit, vi tờn gi Bos gaurus i vi bũ hoang, v Bos frontalis i vi bũ thun hoỏ. Danh sỏch mu c a vo phõn tớch - Phõn bũ rng c thu thp t 1/2005 n1/2006 ti ng Phỳ, Bn Nam v Bự Gia Mp tnh Bỡnh Phc; khu bo tn Nm Nựng tnh Dak Nụng; vn quc gia Yok Don v khu bo tn t nhiờn EASO tnh Dak Lak; khu Phong Nha K Bng tnh Qung Bỡnh: 37 mu. - Phõn bũ rng thu t rng Quc gia Cỏt tiờn t 11/6 n 26/6/2006: 139 mu - Phõn bũ Bos gaurus t vn thỳ TP HCM: 1 mu lấy ngy 08 -05 - 2006 - Phõn ADN tỏch t Phõn bũ mang t Phỏp: 10 mu. Phng phỏp nghiờn cu: Phng phỏp thu thp mu Mu do chuyờn gia sinh thỏi hc cu CIRAD thu thp cn c v hỡnh thỏi, tớnh cht c thự ca mu phõn v mu c bo qan trong ethanol cho n khi a v phũng thớ B¸o c¸o khoa häc ViÖn Ch¨n Nu«i 2006 3 nghiệm. Sau khi có đủ điều kiện về thiết bị, hoá chất được đưa tiến hành nghiên cứu tách chiết thu ADN ngay. * Bố trí thí nghiệm: ảnh hưởng các điều kiện bảo quản phân bò rừng đến chất lượng ADN. Ký hiệu mẫu và thời gian bảo quản mẫu Điều kiện bảo quản Không dùng chất bảo quản Bảo quản bằng dd RNA later Bảo quản bằng cồn tuyệt đối Nhiệt độ thường A RA AA Nhiệt độ 4 0 C B RB AB A: mẫu phân để ở nhiệt độ thường và không có dung dịch bảo quản RA: mẫu phân để ở nhiệt độ thường, sử dụng dung dịch RNA later AA: mẫu phân để ở nhiệt độ thường, sử dụng cồn . B: mẫu phân để ở 4 0 C, không có chất bảo quản RB: mẫu phân để ở 4 0 C, sử dụng dung dịch RNA later AB: mẫu phân để ở 4 0 C, sử dụng cồn. Thời gian bảo quản Phân được bảo quản như trên, sau các khoảng thời gian là 7, 14, 30, 53, 67, 81 ngày, phân được lấy ra để tách ADN Ký hiệu mẫu 7 ngày 14 ngày 30 ngày 53 ngày 67 ngày 81 ngày A RA AA B RB AB * Thời gian nghiên cứu: từ 4/2005 đến 8/2006 * Phương pháp tách chiết ADN và kiểm tra ADN Sử dụng bộ kít của hãng Quiagen, thay đổi các điều kiện và biện pháp thích hợp để tách được ADN từ phân. Dùng mồi Locer So, Cyt b chạy để kiểm tra chất lượng và nguồn gốc ADN thu được. 4 Phần Nghiên cứu về Dinh dỡng và Thức ăn Vật nuôi Kết quả Kt qu tỏch chit ADN trong phõn t 1 Hỡnh 2: ADN tng s mỏu 1-11, phõn 17-26 (Phỏp), phõn VCN (12-16) Kt qa cho thy trong cựng mt iu kin nh nhau, chỳng tụi ch thu c ADN trong phõn bũ ti, trong mỏu, cũn trong phõn bũ rng khụng cú kt qu. õy l 37 mu phõn c ó bo qun 6 thỏng trong ethanol. tng nng ADN thu c, chỳng tụi ó b trớ cỏc m thớ nghim khỏc nhau: tng gp ụi, hoc gp 4 lng phõn cho mi ln tỏch, nhng khi chy in di trờn gen agarose vn khụng thy ADN. iu ny cú l trc khi c bo qun, hoc do thi gian bo qun quỏ lõu, ADN trong phõn ó b phõn hu. Sau ú kim chng phng phỏp tỏch trờn bũ rng, mu phõn Bos gaurus ly ngy 8/5/ 2006 t vn thỳ Tp H Chớ Minh ó c a v v rt mng l chỳng tụi ó tỏch ADN thnh cụng: Hỡnh 3: ADN t phõn bũ Bos gaurus TP HCM Tip tc ci tin theo quy trỡnh ny, 139 mu phõn ly t Cỏt tiờn c tỏch chit ADN. Mi mu phõn c tỏch 2 ln sau ú gp li thu c ADN ti a. Kt qu chỳng tụi ó thu c 119 /139 mu (cú 20 mu khụng thy ADN), t t l 85,61%. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 B¸o c¸o khoa häc ViÖn Ch¨n Nu«i 2006 5 Hình 4: ADN từ phân bò rừng ở Cát tiên 108-131 Kết quả chạy PCR Cặp mồi Locer So nhân đoạn D-loop Cặp mồi Locer So dùng để nhân đoạn D-loop (~ 1000bp) - vùng có tỉ lệ đột biến cao nhất và không mã hóa của ADN ti thể. Cặp mồi này dùng để nhận diện ADN bò. *ADN trong phân cũ bảo quản 6 tháng: không nhân thành công d-loop. * ADN trong phân mới, được bảo quản 3 ngày: ADN từ phân Bos gaurus TP Hồ Chí Minh, đã nhân lên thành công. Hình 5: Chạy mồi Locer So trên ADN của phân Bos gaurus *ADN phân bò từ Cát Tiên: Từ các kinh nghiệm và kết quả chạy cặp mồi Locer So trên các mẫu phân cũ và phân Bos gaurus lấy từ vườn thú Tp. Hồ Chí Minh, sau thời gian điều chỉnh, chúng tôi đã sử dụng quy trình PCR tối ưu nhân vùng D-loop của ADN phân như sau: Bảng 1: Thành phần phản ứng PCR nhân đoạn d-loop Thành phần Nồng độ gốc Nồng độ phản ứng V / 15ul Taq buffer 10X 1X 1.5 MgCl 2 25mM 2mM 1.2 dNTP 2mM 0.2mM 1.5 Locer / So 10 pmoles/ul 3 pmoles/15ul pư 0.3 + 0.3 Taq polymerase 5U/ul 0.75 units/15 ul pư 0.15 H 2 O 9.05 ADN 1 6 Phần Nghiên cứu về Dinh dỡng và Thức ăn Vật nuôi Chu trỡnh nhit: Tin bin tớnh 95 0 C: 4' 35 chu k: bin tớnh 95 0 C 45"; gn mi 55 0 C 1'30"; kộo di chui 72 0 C 1'30" Kộo di b sung 72 0 C trong 1' Cp mi cytb nhõn on cytochrome b gene Kt qu nhõn d-loop khụng thnh cụng trờn cỏc mu ADN tỏch t phõn c. iu ny cú th do d-loop l vựng cú kớch thc ln (khong 1000 bp) nờn d b t góy. Do vy chỳng tụi dựng cp mi Cyt b c thit k riờng cho bũ nhõn on ADN cú kớch thc nh hn: 254 bp. Cyt b gen c xem cú mc a dng cho cỏc vn qun th, v bo th cho vic nghiờn cu sõu sc mi quan h loi. Hỡnh 10: sn phm PCR on cyt b gene Kt qu nghiờn cu v iu chnh cỏc yu t nh hng n kt qu PCR v cht lng ADN ca phõn bũ rng * nh hng ca hm lng ADN trong phn ng PCR: Chỳng tụi ó cỏc yu t khỏc c nh v thay i hm lng ADN trong phn ng PCR khỏc nhau: 1 ul v 2 ul trong th tớch phn ng PCR l 15 ul. Hỡnh 6: Nhõn d-loop Cỏt tien 9-32 1ul ADN 1ul CT 25-32 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 B¸o c¸o khoa häc ViÖn Ch¨n Nu«i 2006 7 Kết quả hình 6 và 7 minh hoạ ảnh hưởng của lượng ADN (1ul, 2ul) tới phản ứng PCR cho thấy: trong cùng 1 phản ứng PCR trên cùng mẫu như nhau (CT 25-32) th ì lượng ADN thích hợp nhất là 1ul cho mỗi phản ứng 15ul. * Ảnh hưởng của điều kiện bảo quản lên chất lượng ADN tách từ phân: Hình 8: nhân d-loop ADN phân Bos gaurus 7, 14, 30 ngày 1. A 2. RA 3. AA 4. B 5. RB 6. AB 7. A 8. RA 9. AA 10. B 11. RB 12. A 13. RA 14. AA 15. B 16. RB 17. AB 18. A 19. RA 20. AA 21. B 22. RB 23. AB 24. A 25. RA 26. AA 27. B 28. RB 29. AB 30. H 2 O 31. A 32. RA 33. AA 34. B 35. RB 36. AB 37. Lông SG Hình 7: Nhân d-loop Cát tien 25-32 2ul ADN, 33-40 1ul ADN 2ul CT25-32 Hình 9: Chạy Locer So trên ADN phân Bos gaurus 53, 67, 81 ngày A RA AA AA B RB AB 7 ngày 14 ngày 14 ngày 30 ngày 30 30 ngày 8 PhÇn Nghiªn cøu vÒ Dinh d−ìng vµ Thøc ¨n VËt nu«i Số ngày bảo quản 7 14 30 53 67 81 A 1 1, mờ 0 0 0 0 RA 1, không gọn 1, không gọn 1, không gọn 1 1 1 AA 1 1 1 0 0 0 B 1 1 1, không gọn 0 - 0 RB 1, không gọn 1, không gọn 1, không gọn 1 0 0 AB 1 1 1 0 0 0 1: Xuất hiện một băng đặc hiệu; 0: Không xuất hiện sản phẩm PCR Kết quả cho thấy: - Phân ở điều kiện thường và không có dung dịch bảo quản: ADN được tách như sau: 7 ngày : Giếng số 1 lên và số 7 không lên. 14 ngày : Giếng số 12 không lên và 18 lên mờ. 30 ngày : Giếng số 24 và 31 đều không lên. 53, 67, 81 ngày : Không mẫu nào lên Như vậy, tách phân được thu thập trong vòng 7 ngày tính từ lúc động vật bài tiết cho ADN chất lượng tốt nhất. - Phân được để ở 4 0 C không có dung dịch bảo quản ADN được tách sau: 7, 14 và 30 ngày cho sản phẩm PCR rõ nét: giếng 4, 10, 15, 21, 27, 34. 53, 81: ngày xuất hiện sản phẩm PCR. Từ hai điều kiện trên ta thấy nhiệt độ cao ảnh hưởng xấu rõ rệt tới chất lượng ADN trong phân không sử dụng chất bảo quản. - Bảo quản phân trong cồn và dung dịch RNA later: Trong vòng 30 ngày: sản phẩm PCR trong giếng số 2 (RA), 5 (RB), 8 (RA), 13 (RA), 16 (RB), 19 (RA), 22 (RB), 25 (RA), 28 (RB), 32 (RA) bẩn hơn so với các giếng 3 (AA), 6 (AB), 9 (AA), 14 (AA), 17 (AB), 20 (AA), 23 (AB), 26 (AA), 29 (AB), 33 (AA). Điều đó có nghĩa việc bảo quản phân trong cồn cho chất lượng ADN tốt hơn so với bảo quản phân trong dung dịch RNA later. Sản phẩm PCR ở mẫu 34 (B) ít hơn nhiều so với mẫu 36 (AB). Như vậy sử dụng cồn 100 0 bảo quản phân ở 4 0 C trong vòng 30 ngày là tốt nhất. Báo cáo khoa học Viện Chăn Nuôi 2006 9 RA (53, 67, 81 ngy) lờn, AA (53, 67, 81 ngy) khụng lờn, RB (53 ngy) lờn, RB (67, 81 ngy) khụng lờn, AB (53, 67, 81 ngy) khụng lờn. Do ú, bo qun phõn lõu hn 1 thỏng chỳng ta nờn s dng dung dch RNA later v phõn nhit thng. Kết luận - ó tỏch thnh cụng ADN trong phõn bũ ti. i vi phõn bũ bo qun 6 thỏng, sau khi tỏch khụng thy ADN trờn gen agarose. - Phõn c ly trong vũng 7 ngy tớnh t lỳc ng vt bi tit thu c ADN cht lng tt. -Bo qun phõn bng cn cho cht lng ADN tt hn so vi bo qun phõn bng dung dch RNA later nhng thi gian bo qun li thp hn (30 ngy so vi 81 ngy). - Dựng dung dch RNA later v bo qun nhit thng cú th gi phõn lõu hn 1 thỏng. - Cp mi Locer So, cytb cú th dựng kim tra ngun gc v cht lng ADN trong phõn bũ rng. Đề Nghị - Trong iu kin thu mu trong rng xa, khụng cú iu kin phũng thớ nghim ti u, khụng dựng hoỏ cht, thỡ thi gian bo qun phõn 4 0 C ch nờn ti a l 30 ngy, cũn nhit thng l 7 ngy l thớch hp. - S dng dung dch RNA later v nhit thng thỡ cú th bo qun phõn c n 81 ngy. - Cn nghiờn cu chun hoỏ cỏc cp mi microsatellite v mi gii tớnh trờn ADN tỏch chit t phõn bũ rng xỏc nh loi, s lng qun th, t l t l c cỏi v mc cn huyt ca bũ rng ti Cỏt Tiờn Tài liệu tham khảo Creel S, Spong G, Sands JL, Rotella J, Zeigle J, Joe L, Murphy KM, and Smith D, 2003. Population size estimation in Yellowstone wolves with error-prone noninvasive microsatellite genotypes. Mol Ecol 12:20032009. Ernest HB, Penedo MCT, May BP, Syvanen M, and Boyce WM, 2000. Molecular tracking of mountain lions in the Yosemite Valley region in California: genetic analyses using microsatellite and faecal DNA. Mol Ecol 9:433441. Fernando PT, Vidya NC, Pajapakse C, Dangolla A, and Melnick DJ, 2003. Reliable noninvasive genotyping: fantasy or reality. J Hered 94: 115123. Flagstad O, Roed K, Stacy JE, and Jakobsen KS, 1999. Reliable noninvasive genotyping based on excremental PCR of nuclear DNA purified with a magnetic bead protocol. Mol Ecol 8:879883. 10 PhÇn Nghiªn cøu vÒ Dinh d−ìng vµ Thøc ¨n VËt nu«i Huber S, Bruns U, and Arnold W, 2002. Sex determination of red deer using polymerase chain reaction of DNA from feces. Wildl Soc Bull 30:208–212. Huber S, Bruns U, and Arnold W, 2003. Genotyping herbivore feces facilitating their further analyses. Wildl Soc Bull 31:692–697. Kohn MH, York EC, Kamradt DA, Haught G, Sauvajot RM, and Wayne RK, 1999. Estimating population size by genotyping faeces. Proc Royal Soc Lond 266B:657–663. Kovach AI, Litvaitis MK, and Litvaitis JA, 2003. Evaluation of fecal mtDNA analysis as a method to determine the geographic distribution of a rare lagomorph. Wildl Soc Bull 31:1061–1065. Miller CR, Joyce P, and Waits LP, 2002. Assessing allelic dropout and genotype reliability using maximum likelihood. Genetics 160:357–366. Taberlet P, Camarra JJ, Griffin S, Uhres E, Hanotte O, Waits LP, Dubois- Paganon C, Burke T, and Bouvet J, 1997. Noninvasive genetic tracking of the endangered Pyrenean brown bear population. Mol Ecol 6:869–876. Taberlet P, Griffin S, Goossens B, Questiau S, Manceau V, Escaravage N, Waits LP, and Bouvet J, 1996. Reliable genotyping of samples with very low DNA quantities using PCR. Nucleic Acids Res 24:3189–3194. Taberlet P and Luikart G, 1999. Non-invasive genetic sampling and individual identification. Biol J Linnean Soc 68:41–55. Taberlet P, Waits LP, and Luikart G, 1999. Noninvasive genetic sampling: look before you leap. Trends Ecol Evol 14:323–327. Wasser SK, Houston CS, Koehler GM, Cadd GG, and Fain SR, 1997. Techniques for application of faecal DNA methods to field studies of ursids. Mol Ecol 6:1091–1097. Wehausen J D, Ramey II R R, and Epps C W. Experiments in DNA extraction and PCR amplification from bighorn sheep feces: the importance of DNA extraction method. Journal of Heredity 2004:95(6):503- 509 en.wikipedia.org/wiki/Bos_gaurus www.qub.ac.uk/bb/prodohl/TroutConcert/fr_glossary.htm www.herkules.oulu.fi/isbn9514255364/html/x128.html . Báo cáo khoa học Viện Chăn Nuôi 2006 1 Kết quả nghiên cứu tách chiết ADn trong phân bò Hoang dã tại Việt Nam * Lờ Quang Nam 1 , R.Taiana 2 Lờ Th Thuý 1 , Miguel. F 2 ,. thể. Cặp mồi này dùng để nhận diện ADN bò. *ADN trong phân cũ bảo quản 6 tháng: không nhân thành công d-loop. * ADN trong phân mới, được bảo quản 3 ngày: ADN từ phân Bos gaurus TP Hồ Chí Minh,. hành nghiên cứu tách chiết thu ADN ngay. * Bố trí thí nghiệm: ảnh hưởng các điều kiện bảo quản phân bò rừng đến chất lượng ADN. Ký hiệu mẫu và thời gian bảo quản mẫu Điều kiện bảo quản Không