NGHIÊN cứu GENOTYPE của HUMAN PAPILLOMAVIRUS TRÊN một số UNG THƯ SINH dục nữ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ PHƯƠNG MAI NGHIÊN CỨU GENOTYPE CỦA HUMAN PAPILLOMAVIRUS TRÊN MỘT SỐ UNG THƯ SINH DỤC NỮ Chuyên ngành: Hóa sinh y học Mã số: 62720112 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2020 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Tạ Thành Văn Phản biện 1: PGS.TS Phạm Văn Trân Phản biện 2: PGS.TS Phan Quốc Hoàn Phản biện 3: PGS.TS Trần Như Dương Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án Tiến sỹ cấp Trường họp Trường Đại học Y Hà Nội Vào hồi ngày tháng năm 2020 Có thể tìm luận án thư viện: Thư viện Quốc gia Thư viện Trường Đại học Y Hà Nội ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư cổ tử cung (UTCTC) loại ung thư thường gặp, đứng thứ tỉ lệ mắc tử vong số bệnh ung thư phụ nữ Ung thư âm hộ (UTAH) ung thư âm đạo (UTAD) hai loại ung thư gặp, có tỉ lệ mắc tử vong 10 lần so với UTCTC Các nghiên cứu giới khoảng 90% mô UTCTC, 66% mô UTAD 60% mô UTAH nhiễm HPV Vắc xin phòng nhiễm HPV6, 11, 16, 18 ngăn cản protein L1 HPV nhận diện tế bào chủ sử dụng Việt Nam Vắc xin E6E7 HPV16 với tác dụng tăng đáp ứng tế bào miễn dịch với tổn thương CIN (Cervical Intraepithelial Neoplasia) nhiễm HPV nghiên cứu sử dụng giới Nghiên cứu trước công bố HPV52 phổ biến gái mại dâm Việt Nam Liệu vắc xin phịng nhiễm HPV thị trường Việt Nam có khả phịng nhiễm type HPV mơ UTCTC, UTAH UTAD? Hơn nữa, nghiên cứu kỳ vọng cung cấp liệu biến thể HPV16E6, E7 loại tế bào ung thư sở cho chiến lược vắc xin phòng ung thư nhiễm HPV Với lý trên, đề tài: “Nghiên cứu genotype Human Papillomavirus số ung thư sinh dục nữ” tiến hành với hai mục tiêu: Xác định genotype HPV mô UTCTC, UTAH, UTAD Đánh giá liên quan genotype HPV với loại tế bào mơ ung thư Tính cấp thiết nghiên cứu: Vắc-xin thương mại lưu hành Việt Nam có khả phịng nhiễm HPV6, 11, 16, 18 Công bố từ việc xác định HPV16, 18 cặp mồi đặc hiệu E6, E7 cho loại HPV6, 11, 16, 18 mô UTCTC đúc nến khơng phân bố xác genotype HPV Cơng bố từ nhóm nhà khoa học Việt Nam Nhật Bản HPV52 phổ biến dịch phết cổ tử cung gái mại dâm Cho đến nay, vấn đề phân bố xác thực genotype HPV mô UTCTC, UTAH, UTAD chưa sáng tỏ Chính vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài Những đóng góp luận án Nghiên cứu phân bố xác genotype HPV mô ung thư sinh dục Nhiễm HPV16 chiếm tỉ lệ cao (43,5%) HPV18 (23%), đồng nhiễm HPV16, 18 (16,2%); nhiễm HPV52 chiếm 4,2% Lineage European chiếm 94% (94/100) trường hợp nhiễm HPV16; sublineage Asian chiếm tỉ lệ cao nhất, 80% (80/100); European prototype 14%, Asian-American a - 5% African 2-1% Ung thư biểu mô chiếm 99,5% (213/214) trường hợp ung thư sinh dục, đó, ung thư tế bào vảy chiếm tỉ lệ cao (79,8%-170/213) Sublineage Asian HPV16 xuất tất loại tế bào ung thư biểu mô ung thư tế bào vảy chiếm 90% Ung thư tế bào vảy nhiễm tất sublineage HPV16, nhiễm sublineage Asian chiếm 78,3% Bố cục luận án - Luận án trình bày 111 trang bao gồm: đặt vấn đề trang, tổng quan 36 trang, đối tượng phương pháp nghiên cứu 15 trang, kết 33 trang, bàn luận 23 trang, kết luận trang, khuyến nghị trang - Luận án có 21 bảng, 32 hình, gồm 166 tài liệu tham khảo xếp theo thứ tự xuất luận án Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Human Papillomavirus Human Papillomavirus loại virus lây qua đường tiếp xúc trực tiếp, đặc biệt qua quan hệ tình dục Chuỗi xoắn kép DNA HPV dài khoảng 8000 bp, gồm 02 gen muộn (late) L1, L2; 06 gen sớm (early) E1, E2, E4, E5, E6, E7 HPV phân loại theo theo cấu tạo nguy gây bệnh Trình tự DNA L1 khác biệt 10% so với loại gần biết gọi loại HPV mới; khác biệt từ 1-10% lineage, từ 0,5-1% sublineage Theo khả gây bệnh, HPV chia thành nhóm: nhóm nguy cao (gồm HPV16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 82), nhóm có khả gây ung thư (gồm HPV26, 53 66), nhóm nguy thấp (HPV6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 CP6108) HPV16 lại phân chia nhóm thành lineage European gồm sublineage European prototype (có biến thể E-T350 E-G350), sublineage Asian (đột biến T178 với As-a, As-b, As-c) Lineage Non-European gồm sublineage Asian American (AA) (có đột biến G145T T350G) sublineage African1 (Af1) (gồm đột biến C143G G145T); Afican (Af2) có đột biến C143G, G145T C335T Sau virus xâm nhập vào lớp tế bào biểu mô đáy biến nạp vào nhiễm sắc thể tế bào chủ tạo thể nhẫn, protein E6, E7 biểu hiện, ức chế protein áp chế khối u pRb p53 Giai đoạn này, HPV nhân lên với số lượng thấp Tới lớp thượng bì, protein L1, L2 biểu để tạo hạt virus hồn chỉnh Các hạt virus giải phóng khỏi tế bào chủ với bong tế bào biểu mô Các “zinc finger” (acid amin 33-63, 109-139) gen E6 HPV16, vùng gen bảo tồn (acid amin từ 37-49 116-137) gen E7 HPV16 liên quan tới p53, pRb Các vị trí D25, L83 E6 thuộc vùng nhận diện hệ thống miễn dịch Các công bố giới hầu hết HPV bị loại bỏ sau năm lây nhiễm; HPV16, HPV18, HPV31, HPV33 tồn dai dẳng mô tổn thương loạn sản CIN ung thư 1.2 Ung thư sinh dục nữ Năm 2018, WHO phân loại giải phẫu bệnh ung thư sinh dục nữ (UTSDN) thành: ung thư biểu mô (gồm ung thư tế bào vảy, ung thư tế bào tuyến ung thư biểu mô khác ung thư tế bào đáy, ung thư tế bào hỗn hợp tuyến vảy, ung thư tế bào kính, ung thư thần kinh nội tiết ), ung thư hắc tố loại khác Ung thư biểu mô liên quan tới HPV, ung thư hắc tố không liên quan tới HPV Hàm lượng cao NO nitro từ phản ứng viêm làm bổ sung vài nucleotide chuỗi DNA khiến chuỗi DNA bị đứt gãy hình thành liên kết chéo mạch đơn Sự gia tăng gen E6, E7 HPV16 làm giảm có ý nghĩa protein p53 pRb, làm giảm số lượng tế bào chết, tăng tần suất đột biến, làm tính ổn định hệ gen tế bào chủ Sự biến nạp gen E6, E7 vào nhiễm sắc thể chủ dẫn đến tổn thương mức độ nặng hơn, chí ung thư chỗ ung thư xâm lấn Phẫu thuật cắt bỏ kết hợp hóa trị liệu tia xạ phương pháp điều trị UTCTC, UTAH, UTAD Vắc-xin L1HPV phòng nhiễm HPV 6, 11, 16, 18 làm giảm tỉ lệ loạn sản cổ tử cung mức độ CIN2, CIN3 Liệu pháp vắc-xin E7HPV16 có hiệu giảm tổn thương loạn sản cổ tử cung CIN3, xuống CIN2 sau tuần điều trị, giảm đường kính loạn sản âm đạo VAIN2 tới 40% 1.3 Nghiên cứu trong, nước bệnh lý liên quan HPV Kết nghiên cứu giới tỉ lệ nhiễm HPV cộng đồng không cao (80% với HPV16 phổ biến) Nhiễm sublineage European prototype HPV16 phổ biến bệnh nhân UTCTC Italy Ma-rốc, Bắc Trung Quốc; gái mại dâm Philippin Sublineage Asian HPV16 phổ biến bệnh nhân UTCTC Thái Lan gái mại dâm Nhật Bản Tương tự vậy, Việt Nam, tỉ lệ nhiễm HPV cổ tử cung tăng dần từ cộng đồng (6,1-10,2%) tới đối tượng gái mại dâm miền Bắc (49,5% với HPV52 phổ biến), bệnh nhân UTCTC (84,4% cho riêng HPV6, 11, 16, 18 HPV16 chiếm phổ biến) Sublineage Asian HPV16 phổ biến gái mại dâm Việt Nam (95,8%) Nhiễm HPV tổn thương tiền ung thư (80-95%) cao mô ung thư âm hộ (30-60%) ung thư âm đạo (50-75%) Tuy nhiên, HPV16 phổ biến nhất; HPV18 loại phổ biến thứ mô UTAH UTAD Ung thư tế bào vảy chiếm tỉ lệ cao loại tế bào UTSDN Ung thư tế bào tuyến đứng thứ mô UTCTC âm đạo, ung thư tế bào đáy đứng thứ hai mô UTAH Tỉ lệ nhiễm HPV HPV16 ung thư tế bào vảy chiếm ưu so với ung thư tế bào tuyến ung thư tế bào hỗn hợp tuyến vảy 1.4 Các kỹ thuật phát hiện, xác định genotyep HPV xét nghiệm mô bệnh học Bằng cặp mồi GP5+/6+, kỹ thuật PCR khuếch đại đoạn gen 140 bp L1 phát nhiều loại HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 45, 51, 54, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 74 Cặp mồi bổ sung MGP5+/6+ thiết kế thay nucleotid tăng kích thước lên 10 bp so với cặp mồi gốc tăng khả phát HPV nguy cao (từ 0,7 lên 17,2%) Các cặp mồi GP5+/6+ MGP5+/6+; HPV16-E6 HPV16-E7 công bố từ nghiên cứu trước Kỹ thuật lai màng genoarrays phát 15 HPV nguy cao (HPV16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68) HPV nguy thấp (6, 11, 42, 43, 44, CP8304 (81)) Xét nghiệm mơ bệnh học xét nghiệm chẩn đốn xác định loại tổn thương Các mô sau đúc nến cắt lạnh, nhuộm HE quan sát kính hiển vi vật kính 100 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu 214 bệnh nhân UTCTC, UTAH, UTAD Khoa Khám bệnh, Bệnh viện K Trung ương; Khoa Ngoại 1, Bệnh viện Ung bướu thành phố Hồ Chí Minh Khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Phụ sản Trung ương Các bệnh nhân lựa chọn theo tiêu chuẩn: bệnh nhân mắc UTCTC, UTAH, UTAD nguyên phát; mắc 01, 02 03 UTCTC, UTAH, UTAD; chưa điều trị hóa chất tia xạ; chẩn đoán ung thư kết xét nghiệm mô bệnh học Những bệnh nhân mắc UTCT, UTAH, UTAD thứ phát nguyên phát điều trị tia xạ hóa chất khơng đưa vào nghiên cứu 2.2 Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả cắt ngang thu thập cách lấy mẫu thuận tiện Các số nghiên cứu gồm thông tin tuổi; kết loại tê bào ung thư; kết tỉ lệ nhiễm HPV, genotype HPV, lineage, sublineage E6, E7 HPV16 2.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu * Địa điểm phân tích mẫu nghiên cứu Khoa Y, Trường Đại học Kanazawa, Nhật Bản Trung tâm Nghiên cứu Gen Protein, Đại học Y Hà Nội *Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 6/2013 đến tháng 10/2018 2.4 Trang thiết bị, hóa chất: hàng Sigma-Alderich (Đức), Hydri-bio (Hongkong), Applied Biosystems 2.5 Qui trình nghiên cứu * Tách chiết DNA từ mẫu mơ: sử dụng enzym proteinase K phenol, chloroform, isoamyl alcohol * Khuếch đại gen L1 HPV phát nhiễm HPV Trình tự nucleotid cặp mồi: Mồi xi GP5+: tttgttactgtggtagatactac Mồi ngược GP6+: cttatactaaatgtacaaataaaaag Mồi xuôi GP5+M1: tttRactgttgtWgatactac Mồi xuôi GP5+M2: tgtWactgttgtWgataccac Mồi xuôi GP5+M3: gtWactgttgtRgacaccac Mồi ngược GP6+M1: cttatactWaatgtcaaataWaaagttaa Mồi ngược GP6+M2: cttaWactaaatgtYaaatacaaag Mồi ngược GP6+M3: ctcaWactaaacgtYaaataaaaag Thành phần phản ứng 30μL: Đệm 10X-3,0 μL; NTPs 2mM: 3,0μL; MgCl2 25mM: 4,2μL; mồi: 0,375μL (cặp mồi GP5+/6+)/ 0,3μL (cặp mồi MGP5+/6+); Ampli Taq Gold 5U/µL-0,3μL; nước cất: 16,125μL (cặp mồi GP5+/6+)/ 16,2 μL (cặp mồi MGP5+/6+); DNA khuôn: 3,0 μL Chu kỳ nhiệt phản ứng: 94oC - 10 phút; 45 chu kỳ [94 oC-45 giây, 48oC-4 giây, 38oC-30 giây, 42oC-5 giây; 66oC-5 giây cho cặp mồi GP5+/6+ 95oC-30 giây, 45oC-30 giây cho cặp mồi MGP5+/6+]; 71oC-90 giây; bảo quản mẫu 4oC * Điện di xác định sản phẩm gen L1 sau khuếch đại: với thang chuẩn 100bp gel agarose 2%, băng DNA nhuộm ethidium bromide chụp ảnh hệ thống máy EC3 Imaging system * Giải trình tự gen L1 xác định sản phẩm sau khuếch đại Mồi GP5+/6+ Thành phần phản ứng 20μL: Big Dye term.V3.1 (2,5X): 1,0μL; Big Dye buffer 5X: 3,5μL; mồi (5pmol/µL): 1,5μL; nước cất: 12,0 μL; sản phẩm PCR tinh sạch: 2,0μL Chu kỳ nhiệt phản ứng: 96oC-5 phút; 25 chu kỳ [95oC-10 giây, 50oC-5 giây]; 60oC–4 phút; bảo quản mẫu 4oC * Kỹ thuật lai màng genoarrays Khuếch đại gen L1 HPV với nucleotide biotin hóa Thành phần phản ứng 25µL: Master mix PCR -23,25µL; DNA Taq polymerase: 0,75µL; DNA khn: 1µL Chu trình nhiệt phản ứng: 96oC-phút; 40 chu kỳ [96oC-20 giây, 55oC-30 giây]; 72oC-30 giây; bảo quản mẫu 4oC Lai màng * Xác định phân nhóm nhóm (lineage) HPV16 Khuếch đại gen E6, E7 HPV16: Trình tự cặp mồi Mồi xi HPV16-E6: gaaatcggttgaaccgaaac Mồi ngược HPV16-E6: acctctatgtggatgtaacg Mồi xuôi HPV16-E7: gaccggtcgatgtatgtcttg 10 Mồi ngược HPV16-E7: cttctcccatgccctacattac Thành phần phản ứng 40μL: đệm 10X: 4,0 μL; dNTPs 2mM: 4,0μL; MgCl2 25mM: 5,6μL; mồi: 1,0μL; DNA Taq polymerase: 0,4; nước cất: 20μL; DNA khuôn: 4,0μL Chu kỳ nhiệt phản ứng: 95oC-10 phút; 40 chu kỳ [95oC-30 giây, 50oC cho E6/ 53oC cho E7-30 giây]; 72oC-45 giây; bảo quản mẫu 4oC Điện di xác định sản phẩm với thang 100bp gel agarose 2% Giải trình tự gen E6, E7 cặp mồi E6, E7 HPV16; so sánh trình tự gen E6, E7 với trình tự GenBank 2.6 Xử lý số liệu Sử dụng phần mềm Bioedit MEGA để phân tích trình tự gen; thuật tốn thống kê Khi bình phương (Chi-square) phần mềm SPSS 20.0 để so sánh genotype HPV với loại tổn thương tế bào mô ung thư 2.7 Đạo đức nghiên cứu: thông qua Hội đồng Y đức trường Đại học Y Hải Phòng theo định số 7/2011 HĐĐĐ-YHP 2.8 Kinh phí thực đề tài: hỗ trợ từ kinh phí đề tài cấp Nhà nước: “Hợp tác nghiên cứu tỉ lệ nhiễm phân bố genotype Human Papillomavirus số bệnh ung thư phía Bắc, Việt Nam” Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Qua nghiên cứu 188 mẫu UTCTC, mẫu UTAD 24 mẫu UTAH thu kết sau: 3.1 Đặc điểm tuổi đối tượng nghiên cứu Tuổi trung bình đối tượng nghiên cứu 52,7 ± 12,5 (17-87 tuổi), nhóm UTCTC: 50,9 ± 11,4; nhóm UTAH: 63,0 ± 7,0 64,2% bệnh nhân UTSDN, 100% bệnh nhân UTAD, 95,8% bệnh nhân UTAH 60,1% bệnh nhân UTCTC 50 15 Ref: trình tự gen E6, E7 tham khảo tải từ GeneBank, mã số HQ644236, *:Trình tự nucleotide tương ứng với vị trí: 132, 143, 145, 176, 178, 182, 183, 276, 277, 293, 315, 350, 370 gen E6 571, 647 gen E7 16 Nhận xét: Tại gen E6, 80% (80/100) sublineage Asian với đột biến nucleotid vị trí 178, dẫn đến thay acid amin Aspartic Glutamic Lysin (D25E, D25K) Sublineage European prototype với đột biến thay nucleotid 350 dẫn tới thay acid amin Leucin acid amin Valine (L83V) xuất 5% (5/100) Sublineage Asian American xuất thêm đột biến nucleotid 145, 315 Duy trường hợp có điểm đột biến thay nucleotid: 132 143, 145, 335 dẫn tới thay đổi mã hóa cho acid amin số 10 Arginin thành Isoleucin, Glutamin số 14 thay Aspartic Histidin số 78 thay Tyrosin sublineage African2 Sublineage E-350T khơng có đột biến thay nucleotid vị trí 350, 178, 350 355 Tại gen E7, có vị trí đột biến thay nucleotid vị trí 571 (1%-1/100) 647 (45%-45/100) dẫn tới thay đổi ba mã hóa cho acid amin số Aspartic thành Histidin acid amin Asparagin thành Serin vị trí 29 3.3 Liên quan genotype HPV loại tế bào ung thư 3.3.1 Loại tế bào mơ ung thư Có 02 loại tế bào ung thư gồm ung thư biểu mô (99,5%213/214) ung thư hắc tố (0,5%) Ung thư tế bào vảy chiếm 79,8% (170/213), ung thư tế bào tuyến chiếm 12,7% (27/213) Ung thư tế bào khác tế bào tuyến vảy, tế bào kính, tế bào thần kinh nội tiết, tế bào đáy xuất 7,5% (16/213) Hình 2:Phân bố loại tế bào ung thư mô UTSDN 17 Nhận xét: ung thư tế bào vảy chiếm 78,8% (148/188) 95,6% (22/23) mô UTCTC UTAH Ung thư tế bào tuyến gặp mơ UTCTC (13,8%-26/188), không xuất mô UTAH xuất bệnh nhân mắc UTAD 3.3.2 Liên quan genotype HPV loại tế bào ung thư 3.3.2.1 Liên quan tỉ lệ nhiễm HPV với loại tế bào ung thư Toàn số bệnh nhân nhiễm HPV mắc ung thư biểu mô (172/172) Bệnh nhân mắc ung thư hắc tố không nhiễm HPV Bảng 44:Liên quan tình trạng nhiễm HPV với loại tế bào ung thư biểu mơ Nhiễm HPV HPV dương tính n=172 HPV âm tính (n=41) Tổng số (n=213) Ung thư tế bào vảy 140 30 170 Ung thư tế Ung thư tế bào tuyến bào khác 19 13 27 16 p 0,34 Nhận xét: Trong nhóm nhiễm HPV có 81,4% (140/172) bệnh nhân ung thư tế bào vảy; 11% (19/172) ung thư tế bào tuyến 7,5 % (13/172) ung thư tế bào khác 3.3.2.2 Liên quan genotype HPV với loại tế bào ung thư biểu mô Bảng 55: Liên quan genotype HPV với loại tế bào ung thư biểu mô Ung thư tế Ung thư tế Ung thư tế Nhiễm HPV p bào vảy bào tuyến bào khác HPV16 (n = 83) HPV16.18 (n =31) HPV18 (n = 44) Type khác (n =14) Tổng (n =172) 76 23 28 13 140 10 19 3 13 0,007 Nhận xét: HPV16, HPV18 HPV16,18 phân bố cao loại ung thư tế bào vảy Tỉ lệ nhiễm HPV16 ung thư tế bào vảy cao ung thư tế bào tuyến; nhiễm HPV18 ung thư tế 18 bào tuyến ung thư tế bào khác cao ung thư tế bào vảy có ý nghĩa thống kê với p=0,007 (