Tổng số 238 mẫu tôm, trong đó có 52 mẫu tôm giống (post-larva) và 186 mẫu tôm thương phẩm đã được thu thập từ các ao nuôi tôm nghi mắc bệnh do vi bào tử trùng tại ba tỉnh Ninh Thuận, Kiên Giang và Bạc Liêu để sử dụng trong nghiên cứu này. Áp dụng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu EHP-510F/ EHP-510R để xác định tỷ lệ nhiễm vi bào tử trùng EHP từ số lượng mẫu nêu trên. Kết quả PCR cho thấy tỷ lệ tôm bị nhiễm bệnh ở 3 tỉnh Ninh Thuận, Kiên Giang và Bạc Liêu.
KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXV SỐ - 2018 KHẢO SÁT TỶ LỆ NHIỄM VÀ PHÂN TÍCH GEN SSU RRNA CỦA VI BÀO TỬ TRÙNG GÂY BỆNH TRÊN TÔM NUÔI NƯỚC L Vũ Khắc Hùng1, Nguyễn Thị Thu Giang1, Trịnh Thị Thu Hằng , Nguyễn Xuân Trường1, Nguyễn Văn Duy2 TÓM TẮT Tổng số 238 mẫu tơm, có 52 mẫu tơm giống (post-larva) 186 mẫu tôm thương phẩm thu thập từ ao nuôi tôm nghi mắc bệnh vi bào tử trùng ba tỉnh Ninh Thuận, Kiên Giang Bạc Liêu để sử dụng nghiên cứu Áp dụng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu EHP-510F/ EHP-510R để xác định tỷ lệ nhiễm vi bào tử trùng EHP từ số lượng mẫu nêu Kết PCR cho thấy tỷ lệ tôm bị nhiễm bệnh tỉnh Ninh Thuận, Kiên Giang Bạc Liêu là: 19,44%; 1,16% 2,27%; tỷ lệ nhiễm bệnh tôm thương phẩm cao so với tơm giống Kết phân tích trình tự nucleotide SSU rRNA từ 23 mẫu tôm cho thấy tất vi bào tử trùng phân lập thuộc loài Enterocytozoon hepatopenaei Kết xây dựng phân loại cho thấy loài vi bào tử trùng Việt Nam có quan hệ gần với lồi vi bào tử Nucleospora salmonis, Agmasoma penae gây bệnh cá Từ khóa: vi bào tử trùng, bệnh tôm, tôm nước lợ, EHP Infection rate and SSU rRNA gene analysis of microsporidium caused disease in brackishwater shrimp Vu Khac Hung, Nguyen Thi Thu Giang, Trinh Thi Thu Hang, Nguyen Xuan Truong, Nguyen Van Duy SUMMARY A total of 238 shrimps (52 post-larvae and 186 commodity shrimps) were collected from the shrimp farms, suspecting infection with microsporidium in Ninh Thuan, Kien Giang and Bac Lieu provinces as materials for this study Total DNA from these samples were extracted to identify the EHP infection rate by PCR method using specific primers EHP-510F/ EHP-510R The PCR result showed that the EHP infection rate of shrimps in Ninh Thuan, Kien Giang and Bac Lieu provinces was 19.44%; 1.16%; 2.27%, respectively; of which, the infection rate of the commodity shrimps was higher than that of the post-larvae The result of analyzing 23 SSU rRNA sequences from 23 shrimp samples indicated that the isolated microsporidium strains in Viet Nam belonged to Enterocytozoon hepatopenaei species, and this species related closely with Nucleospora salmonis, Agmasoma penae, which caused diseases in fish Keywords: microsporidian, shrimp disease, brackish water shrimp, EHP I ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh vi bào tử trùng bệnh phổ biến nguy hiểm cho ngành nuôi tôm (Karthikeyan Kesavan cs., 2016) Theo Perschbacher (1995); Tourtip cs., (2009), Đông Nam Á, tỷ lệ tôm chết nhiễm vi bào tử Phân viện Thú y miền Trung Đại học Nha Trang trùng Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) gia tăng đáng kể năm gần Hiệp hội chế biến xuất thủy sản Việt Nam (VASEP) họp ngày 10/2/2015 Cần Thơ nêu tình trạng tơm ni bị chậm lớn diễn nhiều vùng nuôi tôm Việt Nam từ năm 2014, gây thiệt hại đáng kể Tại họp, tiến 71 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXV SỐ - 2018 sĩ Trần Hữu Lộc nhận định: tôm chậm lớn nhiều nguyên nhân, cần kể đến nhiễm vi bào tử trùng EHP Cho đến nay, nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc phát bệnh vi bào tử trùng phương pháp mô học chưa có nghiên cứu cụ thể xác định tỷ lệ cảm nhiễm vi bào tử trùng thành phần lồi vi bào tử trùng tơm ni Việt Nam Trước tình hình trên, chúng tơi thực nghiên cứu “Khảo sát tỷ lệ nhiễm phân tích gen SSU rRNA vi bào tử trùng gây bệnh tôm nuôi nước lợ” Mục tiêu nghiên cứu nhằm xác định tỷ lệ nhiễm vi bào tử trùng tôm nuôi ba tỉnh Ninh Thuận, Kiên Giang, Bạc Liêu; đồng thời xác định loài vi bào tử trùng gây bệnh tôm II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thu mẫu tôm 238 mẫu tơm có dấu hiệu còi cọc thu thập từ ao nuôi nghi ngờ nhiễm bệnh tỉnh Ninh Thuận, Kiên Giang Bạc Liêu từ tháng – 9/2016 Mẫu cho vào hộp nhựa sạch, trữ lạnh chuyển trực tiếp phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Phân viện thú y miền Trung – Nha Trang Mẫu xử lý tách chiết DNA cố định cồn ethanol 96% 2.3 Phương pháp PCR xác định tỷ lệ nhiễm vi bào tử trùng Cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR EHP510F (5’-GCCTGAGAGATGGCTCCCACGT-3’) EHP-510R (5’-GCGTACTATCCCCAGAGCCCGA- 3’) theo mô tả Tang cs, 2015 Hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm: 12,5µl GoTaq colorless master mix 2x (Promega); 9,5µl nước; 0,5µl mồi, 2µl DNA Chu trình nhiệt thực 35 chu kỳ bao gồm: 94ºC: 30 giây, 60ºC: 30 giây, 72ºC: 90 giây Sản phẩm phản ứng điện di gel agarose 1,5% Sản phẩm PCR tách chiết tinh từ gel kit sinh phẩm QIAquick Gel Extraction Kit theo hướng dẫn nhà sản xuất Sản phẩm PCR gửi giải trình tự cơng ty Macrogen Hàn Quốc Trình tự DNA được xử lý kết quả bằng phần mềm Mega và dữ liệu ở htTp://www.ncbi.nlm.nih.gov/ III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết xác định tỷ lệ nhiễm vi bào tử trùng tôm Đồng thời với việc lấy mẫu tôm, thu mẫu nước để đo hàm lượng muối trung bình ao nuôi Nồng độ muối đo máy đo độ mặn ATAGO ES-421 2.2 Phương pháp chiết tách DNA tổng số DNA từ mẫu gan tụy qua xử lý tách chiết kit QIAGEN Dneasy Blood & Tissue Kit theo hướng dẫn nhà sản xuất DNA tổng số sau tách chiết kiểm tra phương pháp điện di đệm TAE nguồn điện 130V, DNA sau tách chiết bảo quản -20ºC để sử dụng cho phản ứng PCR sau 72 Hình Kết điện di mẫu tôm bị nhiễm vi bào tử trùng EHP M: Marker kích thước 100bp P: Đối chứng dương NTC (Non-template control): Đối chứng âm -6: Mẫu vi bào tử trùng tách từ gan tụy tôm Phản ứng PCR cho band có kích thước khoảng 500bp, kích thước mong muốn Tang cs., (2015) Nhóm tác giả phát triển kỹ thuật KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXV SỐ - 2018 PCR với cặp mồi đặc hiệu EHP-510F/ EHP-510R để phát EHP tơm ni khuếch đại đoạn gen có kích thước 510bp Cặp mồi xây dựng đặc hiệu riêng cho loài Enterocytozoon hepatopenaei, nhân lên với DNA lồi phân biệt rõ ràng (khơng nhân lên) với DNA lồi có quan hệ gần Enterocytozoon bieneusi Mặt khác, nhóm tác giả chứng minh cặp mồi không nhân lên với loài vi bào tử giống với Pleistophora có liên quan đến bệnh tơm bơng gòn Kết điện di cho thấy 23/238 mẫu dương tính, có 21 mẫu thu từ Ninh Thuận (chiếm 19,44%), mẫu Kiên Giang (1,16%) mẫu Bạc Liêu (2,27%) (bảng 1) Bảng Tỷ lệ mẫu dương tính với phản ứng PCR theo địa phương Tỉnh Sớ mẫu Sớ mẫu dương tính Tỷ lệ (%) Ninh Thuận 108 21 19,44 Kiên Giang 86 1,16 Bạc Liêu 44 2,27 Tổng mẫu 238 23 9,66 Nguyễn Thị Hà (2010) trước cho thấy tỷ lệ nhiễm vi bào tử trùng tôm 78,78% 85,45%; tỷ lệ này khá cao vì các mẫu để kiểm tra đều lấy từ tôm xác định là đã nhiễm bệnh, có dấu hiệu bệnh lý rõ ràng Trong nghiên cứu của Bùi Quang Tề (2010), kết phân tích mẫu gan tụy tơm ni thương phẩm ao bị bệnh phương pháp mô bệnh học cho tỷ lệ nhiễm vi bào tử (Enterocytozoon sp.) 92,77% Kết quả nghiên cứu của chúng không cao, nguyên nhân mẫu tôm được lấy ngẫu nhiên từ các ao hồ nuôi tôm bình thường Tuy nhiên, cũng theo tác giả Bùi Quang Tề (2010), tỷ lệ cảm nhiễm các ao tôm khỏe (bình thường) là 22% Một nghiên cứu khác của Prasertsri (2009) xác định được tỷ lệ nhiễm vi bào tử là 25 – 28% đối với tôm thả ao 60 ngày Khi xem xét tỷ lệ dương tính tỉnh, chúng tơi nhận thấy Ninh Thuận có tỷ lệ nhiễm vi bào tử cao so với hai tỉnh Bạc Liêu Kiên Giang Điều thay đổi nồng độ muối nước ao nuôi Để khẳng định nhận định trên, tiến hành đo nồng độ muối trung bình ao ni ba tỉnh Tại thời điểm lấy mẫu, nhận thấy ao ni Ninh Thuận có nồng độ muối trung bình 2,28%, cao so với ao nuôi Kiên Giang (1,78%) Bạc Liêu (1,82%) Năm 2015, nghiên cứu yếu tố môi trường làm phát sinh bệnh vi bào tử, John Sackton khẳng định độ mặn thấp tạo thuận lợi gây tác động tăng trưởng tơm tốt hơn; độ mặn cao xuất tương quan với tăng trưởng tác động lớn Ngoài ra, vi bào tử trùng lây lan nước, gần khơng thể phá hủy, q trình ni, nhiều ao nuôi khu vực bị nhiễm bệnh, đường dẫn nước mang bào tử đưa tới ao, trại giống tôm bố mẹ chưa bị nhiễm bệnh khác Bảng Tỷ lệ mẫu dương tính với phản ứng PCR theo cỡ tơm Sớ mẫu Sớ mẫu dương tính Tỷ lệ % Tơm post Loại tôm 52 5,77 Tôm thương phẩm 186 20 10,75 238 23 9,6 Tổng mẫu 73 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXV SỐ - 2018 Theo kết tỷ lệ nhiễm bệnh theo giai đoạn phát triển tơm, chúng tơi nhận thấy tơm thương phẩm có tỷ lệ nhiễm vi bào tử trùng cao so với tôm post (10,75% 5,77%) Theo nghiên cứu Bùi Quang Tề cs., (2010), tỷ lệ nhiễm tôm post thu 19,44%, thấp so với tơm thương phẩm 92,77% Ngồi ra, Chalor Limsuwan cs., (2008) nghiên cứu tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) tại tỉnh Prachup Khiri Khan kết luận tôm bị nhiễm kí sinh trùng vi bào tử lúc 20 ngày tuổi sau thả giống vào ao Kết giải trình tự gen mẫu dương tính với phản ứng PCR Sau xác định dương tính với vi bào tử trùng phản ứng PCR, gửi tất mẫu giải trình tự cơng ty Macrogen Inc., Hàn Quốc Sản phẩm PCR 23 chủng sau gửi giải trình tự sử dụng chương trình BLAST N (Nucleotide Basic Local Alignment Search Tool) để so sánh với trình tự 18S rRNA vi bào tử trùng EHP có ngân hàng liệu NCBI (National Center for Biotechnology Information) Hình Cây phả hệ 23 loài Enterocytozoon hepatopenaei phân lập 500bp Kết cho thấy 23 mẫu phân lập có trình tự 18S rRNA tương đồng 100% với trình tự 18S rRNA Enterocytozoon hepatopenaei Khi so sánh độ tương đồng nucleotide 23 chủng EHP với nhau, nhận thấy tất 23 chủng tương đồng 100% Điều chứng tỏ trình tự nucleotide SSU rRNA chủng 74 EHP có mức tương đồng cao Kết giải trình tự cặp mồi đặc hiệu cho thấy 23 mẫu từ tôm nghi bị bệnh vi bào tử trùng thuộc loài Enterocytozoon hepatopenaei Kết xây dựng phân lồi, chủng Enterocytozoon có quan hệ gần với chủng gây bệnh cá Nucleospora salmonis, KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXV SỐ - 2018 Agmasoma penaei ; chủng gây bệnh côn trùng Cytosporogenes legeri, Cytosporogenes operophterae, Endoreticulatus bombyds, Endoreticulatus schubergi Theo nghiên cứu Tourtip cs., (2009), nhóm tác giả nhận thấy trình tự SSU rRNA EHP giống 84% so với trình tự SSU rRNA Enterocytozoon bieneusi có quan hệ gần với Nucleospora salmonis Kết hoàn toàn tương đồng với kết mà thu IV KẾT LUẬN Tỷ lệ nhiễm vi bào tử trùng EHP tỉnh Ninh Thuận, Kiên Giang, Bạc Liêu 19,44%; 1,16%; 2,27%, tơm thương phẩm có tỷ lệ nhiễm (10,75%) cao so với tôm post (5,77%) 100% mẫu tôm dương tính tơm thẻ Kết giải trình tự cho thấy vi bào tử trùng gây bệnh tôm ba tỉnh Ninh Thuận, Kiên Giang, Bạc Liêu thuộc loài Enterocytozoon hepatopenaei tỷ lệ tương đồng chủng 100% Kết phân tích phân lồi chủng Enterocytozoon phân lập có quan hệ gần gũi với chủng gây bệnh cá Nucleospora salmonis, Agmasoma penaei, chủng gây bệnh côn trùng Cytosporogenes legeri, Cytosporogenes operophterae, Endoreticulatus bombyds, Endoreticulatus schubergi TÀI LIỆU THAM KHẢO Bùi Quang Tề, Lê Ngọc Quân, Nguyễn Thị Biên Thùy, Bùi Quang Tâm, Hoàng Thị Yến, Nguyễn Thị Niên, Nguyễn Văn Thành, Phan Thị Hường (2010) Kết nghiên cứu bệnh gan tụy tôm sú (Penaeus monodon) ni Việt Nam biện pháp phòng ngừa Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, 18(2): 64-73 Chalor Limsuwan, Niti Chuchird and Kesinee Laisutisan (2008) Efficacy of Calcium Hypochlorite on the Prevalence of Microsporidiosis (Thelohania) in Pond-Reared Litopenaeus vannamei Kasetsart J (Nat Sci.) 42: 282 – 288 John Sackton (2015). EHP Disease in Shrimp May be Hard to Control, Likely Will Increase Volatility in Market. Seafood.com (an online, subscription-based, fisheries news service) Kathy F.J Tang, Carlos R Pantoja, Rita M Redman, Jee Eun Han, Loc H Tran, Donald V Lightner (2015) Development of in situ hybridization and PCR assays for the detection of Enterocytozoon hepatopenaei (EHP), a microsporidian parasite infecting penaeid shrimp Journal of Invertebrate Pathology 130 37–41 Karthikeyan Kesavan, Ravi Mani, Itami Toshiaki & Raja Sudhakaran (2016) Short communication quick report on prevalence of shrimp microsporidian parasite Enterocytozoon hepatopenaei in India Aquaculture research 1–5 Nguyễn Thị Hà, Đồng Thanh Hà, Nguyễn Thanh Thủy, Vũ Thị Kim Liên (2010) Phát vi bào tử Enterocytozoon hepatopenaei ký sinh tôm sú (Penaeus monodon) bị bệnh phân trắng ni Việt Nam.Tạp chí Nơng nghiệp phát triển nông thôn Kỳ Perschbacher P.W 1995 RecirculationAeration: Bibliography for Aquaculture DIANE Publishing, Beltsrille, MD, USA Satit Prasertsri, Chalor Limsuwan and Niti Chuchird (2009) The Effects of Microsporidian (Thelohania) Infection on the Growth and Histopathological Changes in Pond-reared Pacific White Shrimp (Litopenaeus vannamei) Kasetsart J (Nat Sci.) 43: 680 – 688 Somjintana Tourtip, Somjai Wongtripop, Grant D Stentiford, Kelly S Bateman, Siriporn Sriurairatana, Jittipan Chavadej, Kallaya Sritunyalucksana, Boonsirm Withyachumnarnkµl (2009) Enterocytozoon hepatopenaei sp nov (Microsporida: Enterocytozoonidae), a parasite of the black tiger shrimp Penaeus monodon (Decapoda: Penaeidae): Fine structure and phylogenetic relationships Journal of Invertebrate Pathology 102 (2009) 21–29 10 Trung tâm VASEP.PRO (Hiệp hội VASEP) 2015 Phương pháp phát chiến lược phòng bệnh hoại tử gan tụy bệnh vi bào tử trùng tôm nuôi Ngày nhận 20-9-2017 Ngày phản biện 15-10-2017 Ngày đăng 1-1-2018 75 ... định tỷ lệ cảm nhiễm vi bào tử trùng thành phần loài vi bào tử trùng tơm ni Vi t Nam Trước tình hình trên, chúng tơi thực nghiên cứu Khảo sát tỷ lệ nhiễm phân tích gen SSU rRNA vi bào tử trùng gây. .. gây bệnh tôm nuôi nước lợ Mục tiêu nghiên cứu nhằm xác định tỷ lệ nhiễm vi bào tử trùng tôm nuôi ba tỉnh Ninh Thuận, Kiên Giang, Bạc Liêu; đồng thời xác định loài vi bào tử trùng gây bệnh tôm. .. ra, vi bào tử trùng lây lan nước, gần phá hủy, q trình ni, nhiều ao ni khu vực bị nhiễm bệnh, đường dẫn nước mang bào tử đưa tới ao, trại giống tôm bố mẹ chưa bị nhiễm bệnh khác Bảng Tỷ lệ mẫu