Khảo sát tỷ lệ nhiễm Epstein-Barr virus và định typ trong mẫu nước bọt thanh niên 18-25 tuổi

Bài viết Khảo sát tỷ lệ nhiễm Epstein-Barr virus và định typ trong mẫu nước bọt thanh niên 18-25 tuổi trình bày chuẩn hóa quy trình xác định typ EBV trong mẫu nước bọt; Khảo tỷ lệ nhiễm EBV và tỷ lệ từng chủng EBV ở thanh niên từ 18-25 tuổi.

TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 518 - THÁNG - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2022 Chronopoulou E, Harper JC., "IVF culture media: past, present and future.," Hum Reprod Update: 21:39-55 Vol 21, No.1, 2014, pp 39-55 https://doi.org/10.1093/humupd/dmu040 Morbeck DE, Krisher RL, Herrick JR, Baumann NA, Matern D, Moyer T , "Composition of commercial media used for human embryo culture.," Fertil Steril Vol.102, No.3, 2014 pp 759–766.e9 https://doi.org/110.1016/j.fertnstert.2014.05.0 43., 2014 Leese HJ, Whitear SL., " Female tract environment and its relationship to ART media composition In: Quinn P, editor Culture media, solutions and systems in human ART," Cambridge: Cambridge University Press; 2014 p 21–9 Cimadomo D, Scarica C, Maggiulli R, Orlando G, Soscia D, Albricci L, et al , " Continuous embryo culture elicits higher blastulation but similar cumulative delivery rates than sequential: a large prospective study.," J Assist Reprod Genet, vol 35, no.7, 2018 pp.1329–38 https://doi.org/10.1007/s10815-018-1195-4 10 Piko L and Taylor K.D, "Amounts of mitochondrial DNA abundance of mitochondrial gene transcripts in early mouse embryos," Developmental Biology, vol 123, no.2, 1987, pp 364-374 https:// doi.org/10.1016/0012-1606(87)90395-2 KHẢO SÁT TỶ LỆ NHIỄM EPSTEIN-BARR VIRUS VÀ ĐỊNH TYP TRONG MẪU NƯỚC BỌT THANH NIÊN 18-25 TUỔI Đặng Thị Hồng1, Trần Văn Khoa1, Lê Thị Kim Dung1, Nguyễn Văn Phong1, Phạm Trường Giang1, Trần Khánh Linh2 TÓM TẮT 30 Epstein-Barr Virus (EBV) virus thuộc nhóm Human Herpes virus 4, lây nhiễm nhiễm phổ biến cộng đồng toàn cầu EBV yếu tố tham gia vào chế tiến triển số bệnh vật chủ bệnh tăng bạch cầu đơn Học viện quân y Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học q́c gia Hà Nội Chịu trách nhiệm chính: Đặng Thị Hồng, Trần Văn Khoa Email: tvkhoabio@gmail.com Ngày nhận bài: 26/7/2022 Ngày phản biện khoa học: 10/08/2022 Ngày duyệt bài: 29/08/2022 nhân nhiễm khuẩn, u lympho Burkitt, ung thư biểu mơ vịm họng (UTVH) Việc định typ EBV có vai trị quan trọng nghiên cứu sâu tìm hiểu chế tiến triển loại ung thư Ngoài ra, xác định tỷ lệ nhiễm typ quần thể loại ung thư sở khoa học để thiết kế vaccin phịng EBV Mục tiêu: i) Chuẩn hóa quy trình xác định typ EBV mẫu nước bọt; ii) Khảo tỷ lệ nhiễm EBV tỷ lệ chủng EBV niên từ 18-25 tuổi Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Mẫu nước bọt 131 niên khoẻ mạnh (91 nam 50 nữ) lứa tuổi từ 18-25 tuổi tách chiết DNA xác định nhiễm EBV, định typ EBV Nested-PCR Kết quả: 1, Đã 215 HỘI NGHỊ KHOA HỌC HÌNH THÁI HỌC TỒN QUỐC LẦN THỨ XVIII NĂM 2022 chuẩn hố hồn thiện quy trình xác định typ EBV mẫu nước bọt niên kỹ thuật Nested-PCR; 2, Mẫu nước bọt niên khoẻ mạnh (18-25 tuổi) có tỷ lệ nhiễm EBV 50,38% đó: tỷ lệ nhiễm EBV typ 36,64%; tỷ lệ nhiễm EBV typ 7,63% tỷ lệ đồng nhiễm typ 6,87%; 3, Khơng có khác biệt lớn tỷ lệ nhiễm EBV tỷ lệ chủng nhiễm mẫu nước bọt hai giới tính niên khoẻ mạnh (18-25 tuổi) Từ khoá: EBV, typing SUMMARY SURVEY ON EPSTEIN –BARR VIRUS INFECTION RATES AND TYPOLOGY IN SALIVA SAMPLES OF 18-25 YEAR OLDS Epstein-Barr Virus (EBV) is a member of the Human Herpes virus group 4, infecting communities around the world EBV is a factor involved in the progression mechanism of a number of host diseases such as infectious mononucleosis, Burkitt lymphoma, nasopharyngeal carcinoma (UCVH), etc EBV typing plays an important role in the research and in-depth understanding of the mechanism of cancer progression In addition, determining the infection rate for each type in the population and in each type of cancer is also a scientific basis for designing EBV vaccines Objectives: i) Standardize the procedure for determining EBV type in saliva samples; ii) To study the prevalence of EBV infection and the rate of each strain of EBV in young people aged 18-25 years old Subjects and methods: Saliva samples of 131 healthy young men (91 men and 50 women) aged 18-25 years old were extracted DNA and determined for EBV infection, EBV type determination by Nested-PCR Results: 1, Standardized the process of determining EBV type in saliva samples of young people by Nested-PCR technique; 2, The saliva sample of healthy young adults (18-25 years old) had an 216 EBV infection rate of 50.38%, of which: EBV type infection rate was 36.64%; the rate of EBV type infection was 7.63% and the rate of co-infection with both types was 6.87%; 3, There were no major differences in the prevalence of EBV infection and the prevalence of each strain in saliva samples between the sexes in healthy young adults (18-25 years of age) Key words: EBV, typing I ĐẶT VẤN ĐỀ Epstein-Barr Virus (EBV) phát lần đầu vào năm 1964 Epstein cộng sự, virus thuộc nhóm Human Herpes virus 4, lây nhiễm nhiễm phổ biến cộng đồng toàn cầu Số liệu CDC Hoa Kỳ ước tính, có đến 90% người trưởng thành có chứng nhiễm EBV trước [1] Tính lây nhiễm phổ biến EBV bắt nguồn từ đặc điểm lây truyền dễ dàng qua đường miệng, thông thường nước bọt từ cá thể nhiễm EBV; ghép tạng truyền máu đường lây truyền bệnh [2-3] Virus gây sơ nhiễm tồn lâu dài thể mà không gây bệnh cho vật chủ Tuy nhiên số trường hợp, EBV lại yếu tố tham gia vào chế tiến triển số bệnh vật chủ bệnh tăng bạch cầu đơn nhân nhiễm khuẩn, tăng sinh lympho B hay u lympho Burkitt, bệnh Hodgkin, số dạng T-lymphoma, ung thư biểu mơ vịm họng (UTVH)… Chúng cho ngun nhân khoảng 200,000 ca mắc ung thư năm tồn cầu [4-5] Hệ gen EBV có cấu trúc DNA sợi đơi, dài khoảng 184kps mã hóa cho 85 gen có ba họ gen đóng vai trị quan trọng: EBNAs (EBV nuclear antigens), LMPs (Latent membrane proteins) EBERs (Non- TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 518 - THÁNG - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2022 coding nuclear RNAs) [6] Dựa vào khác biệt trình tự kháng nguyên số gen mã hoá (EBNA2-A EBNA2-B EBNA3-A, EBNA3-B EBNA3-C), EBV chia làm typ: EBV typ (typ A) EBV typ (typ B) Hai typ khác khả biến đổi khả tái hoạt vật chủ Việc định typ EBV có vai trị quan trọng nghiên cứu sâu tìm hiểu chế tiến triển loại ung thư Ngoài ra, xác định tỷ lệ nhiễm typ quần thể loại ung thư sở khoa học để thiết kế vaccin phòng EBV Tại Việt Nam, nghiên cứu tập chung chủ yếu mối liên quan EBV giá trị marker loại ung thư Chưa thực có nghiên cứu với cỡ mẫu lớn thực niên để xác định tỷ lệ nhiễm EBV tỷ lệ typ Chính vậy, xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn mang lại mong muốn góp phần bổ sung vào đồ giới tỷ lệ nhiễm EBV, tiến hành đề tài: “Xác định tỷ lệ nhiễm Epstein-Barr Virus định typ mẫu nước bọt niên độ tuổi 18-25” với hai mục tiêu: Chuẩn hóa quy trình xác định typ EBV mẫu nước bọt niên Khảo sát tỷ lệ nhiễm EBV tỷ lệ từng chủng EBV niên khoẻ mạnh độ tuổi 18-25 II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Mẫu nước bọt 131 người khoẻ mạnh (91 nam 50 nữ) lứa tuổi từ 18-25 tuổi Phương pháp nghiên cứu 2.1 Kỹ thuật tách chiết bảo quản DNA từ mẫu nước bọt Mẫu nước bọt thu từ đối tượng bảo quản ống falcon chứa 5ml dung dịch bảo quản trước tiến hành tách chiết DNA Kit QIAamp DNA mini Kit (Đức) Quy trình tách chiết thực theo hướng dẫn nhà sản xuất Dung dịch SDS proteinase K sử dụng để phá vỡ nhân tế bào niêm mạc miệng phân hủy protein DNA phân tách theo phương pháp cột silica Nồng độ DNA độ tinh từ mẫu bệnh phẩm sau tách chiết xác định máy đo SpectraMax QuickDrop, đảm bảo lượng DNA tổng số khoảng 10-20 pg, độ tinh A260/280 từ 1,8-2,2 Các mẫu không đảm bảo tiêu chuẩn tiến hành tinh lại đạt yêu cầu, sau bảo quản -20°C trước tiến hành PCR giải trình tự gen 2.2 Phản ứng Nested-PCR định typ EBV Các cặp mồi nhóm nghiên cứu lựa chọn kiểm tra để khuếch đại đoạn gen EBNA2-A EBNA2-B cách sử dụng phần mềm Primer-BLAST Bảng 1: Trình tự mồi khuếch đại đoạn gen EBNA2-A EBNA2-B EBNA-2F 5’-TGGAAACCCGTCACTCTC -3’ EBNA-2I 5’- TAATGGCATAGGTGGAATG-3’ EBNA-2C 5’-AGGGATGCCTGGACACAAGA -3’ EBNA-2G 5’-GCCTCGGTTGTGACAGAG -3’ EBNA-2B 5’-TTGAAGAGTATGTCCTAAGG -3’ 217 HỘI NGHỊ KHOA HỌC HÌNH THÁI HỌC TỒN QUỐC LẦN THỨ XVIII NĂM 2022 Tất mồi sử dụng phản ứng có nhiệt độ nóng chảy xấp xỉ khoảng 52ºC -58.5ºC, EBNA-2F EBNA-2I khuếch đại cho đoạn gen vịng ngồi (801bp); cặp mồi EBNA-2C EBNA-2G khuếch đại đoạn gen EBNA2- A(250bp); EBNA-2C EBNA-2B cho đoạn gen EBNA2-B với kích thước 300bp Ngồi ra, nhóm nghiên cứu sử dụng phản ứng cặp mồi β-globin F βglobin R khuếch đại đoạn gen beta-globin (119bp), chứng nội nhằm mục đích kiểm tra chất lượng mẫu ADN tách chiết Bảng 2: Trình tự mồi khuếch đại đoạn đoạn gen beta-globin β-globin F 5’-ACACAACTGTGTTCACTAGC-3’ β-globin R 5’-CAACTTCATCCACGTTCACC-3’ Sau chạy phản ứng Nested-PCR, sản vòng: phẩm khuếch đại kiểm tra phương - Vịng 1: ống phản ứng tích pháp điện di gel agarose 3%, qua 12.5 μl chứa 6.25 μl GoTaq Green mẫu xác định dương tính với EBV Mastermix 2X (Lot.No 0000440041; HSD: hay không loại typ EBV tương ứng 05/2023); 1.75 μl nước; 0.5 μl mồi 2.3 Giải trình tự Sanger EBNA-2F, EBNA-2I, β-globin F β-globin Các đoạn gen EBNA2-A EBNA2-B R; 2.5 μl DNA template khuếch đại sử dụng để giải Dựa vào nhiệt độ nóng chảy cặp trình tự máy SeqStudio kit mồi, phản ứng PCR thực với dải BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing gradient nhiệt độ gắn mồi từ 50-60℃ dựa hãng Thermo Fisher Scientific vào kết phản ứng này, nghiên cứu lựa Thành phần phản ứng Sanger chọn 52℃ làm nhiệt độ gắn mồi tối ưu gồm 3.2 pM mồi xuôi mồi ngược; 50ng Phản ứng lặp lặp lại lần DNA, μl BigDye, μl Buffer nước kết lần thực đồng tương ứng tổng thể tích 10 μl với chu Chu trình nhiệt thực với phản ứng trình nhiệt sau: 96°C - phút; 25 chu kỳ vòng 1: (96°C - 10 giây, 50°C - phút, 60°C - Số chu Nhiệt độ Thời gian phút); giữ 4°C Sản phẩm tinh kỳ phương pháp tủa EtOH/EDTA DNA 95ºC phút thu đem điện di mao quản Trình tự 95ºC 30 giây nucleotid đoạn gen xác định 52ºC 30 giây 25 chiều (xuôi ngược) phần mềm 72ºC 90 giây Bioedit Sequence Alignment Editor Các 72ºC 10 phút mẫu xác định dương tính định typ - Vịng 2: ống phản ứng tích sử dụng làm chứng dương 12.5 μl gồm 6.25 μl GoTaq Green Mastermix 2X; 4.25 μl nước; 0.5 μl mồi EBNA-2C, III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết chuẩn hoá quy trình phản EBNA-2G, EBNA-2B; 1.0 μl sản phẩm PCR vịng ứng Nested-PCR định typ EBV Tương tự phản ứng PCR vòng 1, dựa Phản ứng Nested-PCR tiến hành 218 TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 518 - THÁNG - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2022 nhiệt độ nóng chảy cặp mồi, phản ứng PCR vòng thực với dải gradient nhiệt độ gắn mồi từ 50-60℃ dựa vào kết quả, nghiên cứu lựa chọn 52℃ làm nhiệt độ gắn mồi tối ưu Chu trình nhiệt vịng 2: Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ 95ºC phút 95ºC 30 giây 52ºC 30 giây 35 72ºC 60 giây 72ºC 10 phút Sau phản ứng Nested-PCR, sản phẩm điện di gel agarose 3%, mẫu xuất băng 250bp 300bp (tương ứng với kích thước đoạn gen EBNA2-A EBNA2-B mà nhóm nghiên cứu thiết kế) Ngoài ra, mẫu xuất băng 119bp (tương ứng kích thước đoạn gen β-globin thiết kế), chứng tỏ quy trình tách chiết DNA thực đảm bảo chất lượng, tránh tượng âm tính giả Kết xác định tỷ lệ nhiễm EBV định typ nhóm đối tượng Kết xác định mẫu mắc EBV định typ nhóm nam giới khoẻ mạnh: Hình 1: Kết điện di sản phẩm Nested-PCR gel agarose 3% đối tượng thuộc nhóm nam giới khoẻ mạnh 219 HỘI NGHỊ KHOA HỌC HÌNH THÁI HỌC TỒN QUỐC LẦN THỨ XVIII NĂM 2022 - : Chứng âm + : Chứng dương 1-91: Các mẫu nhóm nam giới đánh số từ đến 91 Kết xác định mẫu mắc EBV định typ nhóm nữ giới khoẻ mạnh: Hình 2: Kết điện di sản phẩm Nested-PCR gel agarose 3% đối tượng thuộc nhóm nữ giới khoẻ mạnh - : Chứng âm + : Chứng dương 1-50: Các mẫu nhóm nữ giới đánh số từ đến 50 Bảng 3: Tỷ lệ nhiễm EBV tỷ lệ typ mẫu nước bọt nhóm khoẻ mạnh Nhóm đối Tổng EBV(+) EBV Typ EBV Typ Cả Typ tượng Nam giới khoẻ 100% 46,15% 35,16% 6,59% 4,39% mạnh (91) (42) (32) (6) (4) Nữ giới 100% 48% 32% 8% 10% khoẻ mạnh (50) (24) (16) (4) (5) Nhóm người 100% 50,38% 36,64% 7,63% 6,87% khoẻ mạnh (131) (66) (48) (10) (9) IV BÀN LUẬN Sau xây dựng quy trình Nested-PCR, nhóm nghiên cứu tiến hành chạy mẫu nghiên cứu Kết kiểm tra sản phẩm Nested-PCR điện di agarose 3% cho thấy khuếch đại đoạn gen có kích thước thiết kế (250bp 300bp) Để xác định sản phẩm có kích 220 thước 250bp 300bp đoạn gen EBNA2-A (typ 1) EBNA2-B (typ 2) khuếch đại, nhóm nghiên cứu tiến hành giải trình tự số mẫu đại diện Các băng sản phẩm Nested-PCR sau kiểm tra điện di đem giải trình tự theo nguyên lý Sanger để so sánh TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 518 - THÁNG - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2022 Hình 3: Kết giải trình tự Sanger sản phẩm khuếch đại gen EBNA2-B: (A): Mồi EBNA2-C; (B): Mồi EBNA2-B Kết giải trình tự cho thấy peak sản phẩm rõ ràng, trừ số nucleotide phần đầu trình tự vị trí mồi bắt cặp gây tín hiệu khơng rõ ràng Các trình tự nucleotid vùng hiệu chỉnh trình tự bắt cặp bổ sung tương ứng đoạn nucleotid giải trình tự mồi ngược lại Đoạn trình tự sau hồn thiện kiểm tra mức độ tương đồng chương trình BLAST Kết quả, trình tự thu nhận có độ tương đồng cao với trình tự gen EBNA2-A EBNA2-B human herpes virus (HQ827839) Như vậy, quy trình phản ứng Nested-PCR định typ EBV nhóm nghiên cứu chuẩn hố hồn thiện thành cơng Tỷ lệ nhiễm EBV quần thể giới khoảng 97% (theo De The G cộng sự) Tại Đài Loan – nước gần gũi vị trí địa lý văn hoá, tỷ lệ lây nhiễm EBV 100%[7] Tại Việt Nam, xác định tỷ lệ nhiễm EBV kỹ thuật huyết học cho kết 95,7% [8] Trong nghiên cứu chúng tôi, thông qua mẫu nước bọt, tỷ lệ nhiễm EBV 50,38% Sự khác biệt phương pháp phát EBV Nested-PCR mẫu nước bọt phát có mặt EBV thời điểm lấy mẫu, phương pháp huyết học xác định đối tượng nhiễm EBV mà thời điểm lấy mẫu khơng cịn tồn EBV thể Về typ EBV lây nhiễm, hầu hết quần thể giới, EBV typ chủng lây nhiễm chủ yếu, ngoại trừ quần thể người Châu Phi với tỷ lệ nhiễm EBV typ typ gần ngang Tại Việt Nam, Trần Thị Chính cộng tiến hành xác định tỷ lệ nhiễm chủng EBV 32 mẫu máu người khoẻ mạnh, kết cho thấy EBV typ chủng lây nhiễm (66,67%) EBV typ 33,33%[9] Kết tương đồng với nghiên cứu nhóm với tỷ lệ EBV typ chiếm ưu (36,64%), EBV typ 6,87% Tỷ lệ nhiễm EBV nhóm đối tượng nam giới khoẻ mạnh 46,15%; tương đương với tỷ lệ nhóm nữ giới khoẻ mạnh (48%) Về tỷ lệ nhiễm chủng, có tương đồng tỷ lệ nhiễm hai nhóm: tỷ lệ nhiễm EBV typ nhóm nam nữ 35,16% 32%; tương tự với EBV typ 6,59% 221 HỘI NGHỊ KHOA HỌC HÌNH THÁI HỌC TỒN QUỐC LẦN THỨ XVIII NĂM 2022 8% nhóm nam giới nữ giới khoẻ mạnh Tỷ lệ đối tượng mắc typ EBV có chênh lệch nhóm nam có 4,39% cịn nhóm nữ lại cao (10%) Tóm lại, khơng có khác biệt lớn tỷ lệ nhiễm EBV tỷ lệ nhiễm chủng mẫu nước bọt hai giới tính niên khoẻ mạnh độ tuổi 18-25 V KẾT LUẬN Đã chuẩn hố hồn thiện quy trình định typ EBV mẫu nước bọt kỹ thuật Nested-PCR Mẫu nước bọt niên khoẻ mạnh (18-25 tuổi) có tỷ lệ nhiễm EBV 50,38% đó: tỷ lệ nhiễm EBV typ 36,64%; tỷ lệ nhiễm EBV typ 7,63% tỷ lệ nhiễm typ 6,87% Khơng có khác biệt lớn tỷ lệ nhiễm EBV tỷ lệ chủng nhiễm mẫu nước bọt hai giới tính niên khoẻ mạnh (18-25 tuổi) TÀI LIỆU THAM KHẢO CDC - National Center for Infectious Diseases (2020) About 90% of adults have antibodies that show that they have a current or past EBV infection Wei W., Huang Z., Li S., et al (2014) Pretreatment Epstein-Barr virus DNA load and cumulative cisplatin dose intensity affect long-term outcome of nasopharyngeal carcinoma treated with concurrent 222 chemotherapy: experience of an institute in an endemic area Oncol Res Treat, 37(3), 88– 95.49 Reusch J.A., Nawandar D.M., Wright K.L., et al (2015) Cellular differentiation regulator BLIMP1 induces Epstein-Barr virus lytic reactivation in epithelial and B cells by activating transcription from both the R and Z promoters J Virol, 89(3), 1731–1743 Cancer Research UK (2014) Developing a vaccine for the Epstein–Barr Virus could prevent up to 200,000 cancers globally say experts Khan G, Fitzmaurice C, Naghavi M, Ahmed LA (2020) Global and regional incidence, mortality and disability-adjusted life-years for Epstein-Barr virus-attributable malignancies, 1990-2017 BMJ Open 10 (8): e037505 doi:10.1136/bmjopen-2020-037505 Knipe D M., Howley P M.Rickinson, A B and Kieff, E (2001) Epstein–Barr virus In (eds.), Fields Virology Lippincott Williams and Wilkins; Philadelphia Kee Ching G., Chen Yi Hsu et al (1994) Prevalence of Taiwan variant of Epstein-Barr virus in throat washings from patients with head and neck tumors in Taiwan J of Clinical Microbiology, Vol 32, No.1, p28-31 Hu L.F (1996) Nasopharyngeal carcinoma and EBV PhD thesis MTC Chinh.T.T et al (2007) Định týp EpsteinBarr Virus mô sinh thiết bệnh nhân ung thư vòm mũi họng kỹ thuật PCR  ... “Xác định tỷ lệ nhiễm Epstein-Barr Virus định typ mẫu nước bọt niên độ tuổi 18-25? ?? với hai mục tiêu: Chuẩn hóa quy trình xác định typ EBV mẫu nước bọt niên Khảo sát tỷ lệ nhiễm EBV tỷ lệ từng... trình định typ EBV mẫu nước bọt kỹ thuật Nested-PCR Mẫu nước bọt niên khoẻ mạnh (18-25 tuổi) có tỷ lệ nhiễm EBV 50,38% đó: tỷ lệ nhiễm EBV typ 36,64%; tỷ lệ nhiễm EBV typ 7,63% tỷ lệ nhiễm typ. .. xác định typ EBV mẫu nước bọt niên kỹ thuật Nested-PCR; 2, Mẫu nước bọt niên khoẻ mạnh (18-25 tuổi) có tỷ lệ nhiễm EBV 50,38% đó: tỷ lệ nhiễm EBV typ 36,64%; tỷ lệ nhiễm EBV typ 7,63% tỷ lệ đồng