do an la sen chong oxi hoa

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP HỒ CHÍ MINH VIỆN CƠNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM  BÁO CÁO ĐỒ ÁN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT HỢP CHẤT FLAVONOID TRONG LÁ SEN VÀ THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA GVHD: HUỲNH NGUYỄN QUẾ ANH DANH SÁCH NHÓM STT Họ tên MSSV NGUYỄN THỊ HẠNH VŨ THỊ LINH LÊ THỊ THANH TRÚC 13081601 13050641 13053501 Tp HCM, tháng 10 năm 2016 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Trong năm gần đây, ngồi khuynh hướng nâng cao ý thức phòng chữa bệnh, người tiêu dùng quan tâm đến cách thức ăn uống sinh hoạt Người ta bắt đầu quan tâm nhiều đến việc sử dụng thực phẩm có chức chữa bệnh từ thức ăn loại họ đậu (đậu xanh, đậu nành, gạo lức…) đến thức uống trà dược thảo, nước mát dân gian, trà xanh… Điều cho thấy loại thực phẩm gần gũi với người Việt – thực phẩm truyền thống sử dụng trở lại Khoa học đại khuyến khích sử dụng nguồn thực phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên loài thảo mộc, loại trà xanh, dược thảo Những thực phẩm khơng thực phẩm đơn mà có tác dụng phòng chữa bệnh Sen loài quen thuộc với người Việt Nam Sen biểu tượng tinh thần dân tộc Việt : “Gần bùn mà chẳng hôi mùi bùn” Không đẹp, hương thơm mà sen có nhiều công dụng, tác dụng quý báu Hải Thượng Lãn Ông viết sen sau: “cây sen mọc bùn đen mà không ô nhiễm mùi bùn, đượm khí thơm lành đất trời; nên củ, lá, hoa, tua, vỏ, quả, ruột thuốc hay” Nhưng từ trước đến nay, người ta ý đến sử dụng hạt sen (liên nhục) để nấu chè, tâm sen (liên tâm) làm thuốc an thần, tua sen (liên tu) dùng ướp chè, ngó sen (liên ngẫu) làm thực phẩm Còn sen dùng để gói thức ăn, người nghĩ sen có nhiều tác dụng quý để chữa bệnh Ngày nay, nhờ công nghệ đại, nhà khoa học phát chất đặc biệt sen, chất nuciferine có tác dụng chống viêm, giảm đau, trị béo phì, hạ cholesterol máu hoạt tính chống lại serotonin Lá sen chứa nhiều nuciferine nhất.Nuciferine chiết từ sen có cơng dụng kéo dài giấc ngủ Ngồi ra, sen chứa nhiều vitamin C, alkaloid tác dụng an thần mạnh tâm sen Về hóa học, sen chứa nhiều thành phần như: tanin, flavonoid, hợp chất polyphenol, alkaloid có nuciferine, nor-nuciferine, roemerine, anonain, liriodenin, pro-nuciferine, O-nornuciferine, armeparin, N-nor-amepavin, metylcoclaurin, nepherin, dehydro roemerine, dehydro nuciferine, dehydro anonain, Nmetyl lisococlaurin Trong đó, nuciferine alkaloid Về dược lý, sen nghiên cứu có tác dụng an thần, chống co thắt trơn, chống thoáng phản vệ, ức chế loạn nhịp tim, từ lâu y học cổ truyền dùng làm thuốc chữa bệnh Về sau bệnh béo phì trở nên phổ biến, sen sử dụng hiệu để chống lại bệnh Chính lý trên, nhóm chúng em chọn đề tài “NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT HỢP CHẤT FLAVONOID TRONG LÁ SEN VÀ THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA” để làm đề tài đồ án tốt nghiệp MỤC TIÊU ĐỀ TÀI .2 CHƯƠNG I TỔNG QUAN Giới thiệu sen - Cây sen thuộc loài Nelumbo nucifera Gaertn 2.Đối tượng nghiên cứu 3.Tình hình nghiên cứu nước giới Một số sản phẩm từ sen có thị trường CHƯƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 1.Thời gian địa điểm nghiên cứu 18 a.Thời gian nghiên cứu: 18 b.Địa điểm nghiên cứu: 18 2.Nguyên vật liệu thiết bị, dụng cụ-hóa chất 18 a.Nguyên liệu 18 b.Thiết bị, dụng cụ-hóa chất 19 3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát nồng độ dung mơi cồn trích ly cho hàm lượng flavonoid cao 23 3.7.Quy trình tiến hành nghiên cứu 29 a.Sơ đồ quy trình xử lý nguyên liệu 29 b.Sơ đồ quy trình trích ly 30 3.8.Phương pháp phân tích .32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong năm gần đây, khuynh hướng nâng cao ý thức phòng chữa bệnh, người tiêu dùng quan tâm đến cách thức ăn uống sinh hoạt Người ta bắt đầu quan tâm nhiều đến việc sử dụng thực phẩm có chức chữa bệnh từ thức ăn loại họ đậu (đậu xanh, đậu nành, gạo lức…) đến thức uống trà dược thảo, nước mát dân gian, trà xanh… Điều cho thấy loại thực phẩm gần gũi với người Việt – thực phẩm truyền thống sử dụng trở lại Khoa học đại khuyến khích sử dụng nguồn thực phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên loài thảo mộc, loại trà xanh, dược thảo Những thực phẩm thực phẩm đơn mà có tác dụng phòng chữa bệnh Sen lồi quen thuộc với người Việt Nam Sen biểu tượng tinh thần dân tộc Việt : “Gần bùn mà chẳng hôi mùi bùn” Không đẹp, hương thơm mà sen có nhiều công dụng, tác dụng quý báu Hải Thượng Lãn Ông viết sen sau: “cây sen mọc bùn đen mà không ô nhiễm mùi bùn, đượm khí thơm lành đất trời; nên củ, lá, hoa, tua, vỏ, quả, ruột thuốc hay” Nhưng từ trước đến nay, người ta ý đến sử dụng hạt sen (liên nhục) để nấu chè, tâm sen (liên tâm) làm thuốc an thần, tua sen (liên tu) dùng ướp chè, ngó sen (liên ngẫu) làm thực phẩm Còn sen dùng để gói thức ăn, người nghĩ sen có nhiều tác dụng quý để chữa bệnh Ngày nay, nhờ công nghệ đại, nhà khoa học phát chất đặc biệt sen, chất nuciferine có tác dụng chống viêm, giảm đau, trị béo phì, hạ cholesterol máu hoạt tính chống lại serotonin Lá sen chứa nhiều nuciferine nhất.Nuciferine chiết từ sen có cơng dụng kéo dài giấc ngủ Ngồi ra, sen chứa nhiều vitamin C, alkaloid tác dụng an thần mạnh tâm sen Về hóa học, sen chứa nhiều thành phần như: tanin, flavonoid, hợp chất polyphenol, alkaloid có nuciferine, nor-nuciferine, roemerine, anonain, liriodenin, pro-nuciferine, O-nornuciferine, armeparin, N-nor-amepavin, metylcoclaurin, nepherin, dehydro roemerine, dehydro nuciferine, dehydro anonain, Nmetyl lisococlaurin Trong đó, nuciferine alkaloid Về dược lý, sen nghiên cứu có tác dụng an thần, chống co thắt trơn, chống thoáng phản vệ, ức chế loạn nhịp tim, từ lâu y học cổ truyền dùng làm thuốc chữa bệnh Về sau bệnh béo phì trở nên phổ biến, sen sử dụng hiệu để chống lại bệnh Chính lý trên, nhóm chúng em chọn đề tài “NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT HỢP CHẤT FLAVONOID TRONG LÁ SEN VÀ THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA” để làm đề tài đồ án tốt nghiệp MỤC TIÊU ĐỀ TÀI Tách chiết thu nhận dịch giàu flavonoid từ sen ứng dụng thử hoạt tính chống oxy hóa CHƯƠNG I TỔNG QUAN Giới thiệu sen - Cây sen thuộc loài Nelumbo nucifera Gaertn Ngành Ngọc Lan (magno liophyta) Lớp Ngọc Lan (magno liopsida) Phân lớp Sen (Nelumbonidae) Bộ Sen (Nelumbonales) Họ Sen (nelumbonaceae) Chi Nelumbo Adans Ngồi có tên khác như: Liên, Ngậu (Tày) Tên khoa học: Nelumbo nuciferagaertn Tên nước ngoài: sacred lotus, chinese water-lily, Indian lotus, Egypian bean Hình 1.1.Lá sen Mơ tả sen: sen loại mọc nước, sống dai nhờ thân rễ Ngó sen màu trắng, tiết diện gần tròn.Thân rễ phình to thành củ, màu vàng nâu, hình dùi trống, gồm nhiều đoạn, thắt lại giữa, có nhiều khuyết rộng Lá hình lọng có thùy sâu đối xứng nhau, mặt xanh đậm, nhẵn bóng, mặt xanh nhạt, nhám Cuống màu xanh, hình trụ, có nhiều gai.Hoa to, màu hồng hay trắng Cuống hoa màu xanh, dài già chuyển sang màu nâu, có nhiều gai nhọn Cuống cuống hoa có nhiều khoang rỗng bên trong.Đế hoa lồi dạng hình nón ngược, mép lồi lõm, xốp, non màu vàng, già màu xanh.Quả màu xanh, nhẵn, hình bầu dục Hạt màu trắng mầm dày mập màu trắng , bên có tâm sen màu xanh Tâm sen gồm rễ mầm, thân mầm, chồi mầm Loại đất có đặc điểm tự nhiên thích hợp cho sen phát triển đất phèn, vùng trồng sen số lượng lớn phải kể đến tỉnh thuộc đồng sông Cửu Long như: Đồng Tháp, Long An, Tây Ninh, An Giang, Ở miền trung bật sen trồng Huế trở thành đặc trưng mảnh đất này, Quảng Nam có vùng nhỏ lẻ hộ gia đình Tại miền Bắc, sen trồng ao hồ nhỏ với quy mơ hơn, phân bố vùng như: Vĩnh Phúc, Bắc Ninh, Hòa Bình,… Trên giới Sen trồng số nước như: Nhật Bản, Ấn Độ, Trung Quốc, Ai Cập, Đài Loan, Hàn Quốc,… Đối tượng nghiên cứu Lá sen lấy đại lộ Võ Văn Kiệt quận Các hợp chất hóa học có sen: Năm 1970, D Cunitomo ( J Pharm Soc Jap., 1970, 90, 9,1165) tách từ sen chất anonain, pronuxiferin, N-nornuxiferin, liriodenin, D N metylcoclaurin, roemerin, nuxiferin O.nornuxiferin Theo sách thuốc vị thuốc Việt Nam giáo sư tiến sĩ Đỗ Tất Lợi sen có nhiều alkaloid, nuciferine alkaloid Cơng thức phân tử nuciferine: C19H21NO2 Trọng lượng phân tử: 295,2 Công thức cấu tạo nuciferine Hàm lượng alkaloid toàn phần sen chiếm từ 0.28-0.8% tùy theo điều kiện khí hậu, thổ dưỡng Có khoảng 15 alkaloid xác định.Các alkaloid sen có cấu trúc isoquinolin bao gồm phân nhóm aporphin, proaporphin, benzylisoquinolin bisbenzylisoquinolin.Các alkaloid có cấu trúc aporphin chiếm phần lớn tỉ lệ số lượng alkaloid toàn phần sen Hàm lượng flavoniod toàn phần sen từ 3.814% tùy theo điều kiện khí hậu, thổ dưỡng Có khoảng 16 flavonoid xác định sen Flavonoid sen thuộc nhóm flavonol, flavon, catechin, leucoanthocyanidin, hàm lượng cao tìm thấy quercetin 3-O-β-D-glucuronid - - Tính chất lí – hóa: Nuciferin chất kết tinh, tinh thể hình khối, màu vàng nhạt, khơng mùi, khơng vị, tan tốt CHCl3, MeOH, EtOH nóng, khơng tan nước, nhiệt độ nóng chảy 164– 165oC, Phổ UV (đo MeOH) cho λ max bước sóng 210 nm, 228 nm, 270nm Tác dụng dược lí: Nuciferin chiết từ Sen có tác dụng giải thắt co trơn, ức chế thần kinh trung ương, chống viêm yếu, giảm đau, chống ho, kháng serotonin vàcó hoạt tính phong bế thụ thể adrenergic Nuciferin độc, liều LD50 330 mg/kg thể trọng chuột Nuciferin có tác dụng tăng cường q trình ức chế tế bào thần kinh vùng vỏ não cảm giác – vận động thể thân não thỏ thí nghiệm, có tác dụng an thần kéo dài giấc ngủ pentobarbital chuột thí nghiệm Bảng 2.1 Bảng thành phần dinh dưỡng sen: Thành phần Hàm lượng Nước 57.9% Glucid 0.8% Protein 9.5% Lipid 0.5% Tro 1.8% Cellulose 29.5% Bảng 2.2 Bảng so sánh hàm lượng flavonoid alkaloid sen với mã đề lược vàng: Qua bảng cho ta thấy hàm lượng flavonoid alkaloid sen, lược vàng mã đề tương đương nhau, chí, hàm lượng flavonoid sen cao so với hai lại Alkaloid Flavonoid Lá sen 0.28-0.8 % [1] 3.81%[1] Lá lược vàng 0.49%[2] 2.5%[2] Lá mã đề 0.69- 3.09%[3] Đã có nhiều báo khoa học chứng minh tác dụng flavonoid chế chống oxy hóa chúng Hợp chất flavonoid có cơng dụng lĩnh vực sinh học y học Flavonoid nhóm hợp chất gọi “những người thợ sửa chữa sinh hóa thiên nhiên” nhờ vào khả sửa chữa phản ứng thể chống lại hợp chất khác dị ứng nguyên, virus chất sinh ung Nhờ chúng có đặc tính kháng viêm, kháng dị ứng, chống virus ung thư Hơn nữa, flavonoid chất chống oxy hóa mạnh giúp thể chống lại tổn thương oxy hóa gốc tự cách hữu hiệu Nhờ flavonoid có tác dụng bảo vệ hệ tim mạch, giảm nguy tử vong bệnh lý tim mạch thiếu máu tim, đau thắt ngực, nhồi máu tim, xơ vữa động mạch,… nhờ khả chống ơxy hóa khơng hồn tồn cholesterol (cũng giống chất chống ơxy hóa khác vitamin C, E,…) Ngược lại, lượng flavonoid cung cấp hàng ngày giảm đi, nguy bệnh lý tăng lên rõ rệt.Khả chống ơxy hóa flavonoid mạnh chất khác vitamin C, E, selenium kẽm Mỗi loại flavonoid mang lại lợi ích riêng, chúng thường hoạt động hỗ trợ tác dụng thường chồng chéo lên - - Các yếu tố ảnh hưởng đến hợp chất có lợi sen: Dung mơi có vai trò đặc biệt quan trọng trình chiết xuất dược liệu Để chiết xuất đạt hiệu suất cao tạp chất phải lựa chọn dung mơi có độ phân cực phù hợp có tính chọn lọc cao với chất cần chiết Trong chiết xuất chất flavonoid sử dụng dung mơi hữu pH, nhiệt độ, nồng độ dung môi yếu tố định đến hiệu suất chiết Vai trò sen dân gian: Chữa nước: Người bị tiêu chảy vừa khỏi, thể bị thiếu nước Chỉ cần lấy sen non (loại cuộn lại chưa mở tốt) rửa sạch, thái nhỏ, ép lấy nước uống làm nhiều lần ngày Hoặc thái nhỏ, trộn với loại rau ghém, ăn sống ngày Chữa máu hôi không hết sau sinh: Lá sen thơm 20-30 g, tán nhỏ, uống với nước, sắc với 200 ml nước 50 ml uống lần ngày Chữa rối loạn mỡ máu: Lá sen khô lá, sắc nước uống ngày Từ đồ thị biểu diễn tương quan nồng độ quercetin chuẩn độ hấp thu, cho thấy khoảng nồng độ từ đến 25ppm có tuyến tính nồng độ độ hấp thu Do đó, dùng phương trình: y=0.012x-0.002 để xác định hàm lượng TFC mẫu phân tích Hàm lượng flavonoid tính cơng thức đây: (1) F%= Với: F% hàm lượng flavonoid có mẫu sen Cx nồng độ flavonoid có dung dịch K hệ số pha loãng Vthu thể tích dịch trích thu mmẫu khối lượng mẫu đem trích ly 4.2.2 Kết khảo sát nhiệt độ sấy nguyên liệu cho hàm lượng flavonoid cao Bảng 4.2.2 Kết khảo sát nhiệt độ sấy nguyên liệu cho hàm lượng flavonoid cao Nhiệt độ sấy (oC) Am 40 50 60 70 80 0.136±0.002 0.149±0.002 0.147±0.004 0.175±0.002 0.144±0.003 92.13±1.39 99.9±2.4 99.234±3.05 117.66±1.68 97.46±2.035 Hàm lượng flavonoid (mg/g) 36 Qua kết xử lý bảng , nhận thấy rằng: hàm lượng flavonoid mẫu sen tăng nhiệt độ sấy từ 40-70 oC, cao chế độ sấy 70oC với hàm lượng 117.66±1.68mg/g , tiếp tục tăng nhiệt độ sấy lên mức 80 oC hàm lượng flavonoid giảm theo độ tăng nhiệt độ, từ 117.66±1.68mg/g giảm 97.46±2.035mg/g Kết số liệu chạy ANOVA cho thấy mức nhiệt độ 70 oC cho hàm lượng cao có ý nghĩa thống kê Hình Ảnh hưởng nhiệt độ sấy đến hàm lượng flavonoid Quá trình sấy nguyên liệu nhằm đảm bảo điều kiện thuận lợi cho bảo quản nguyên liệu suốt trình nghiên cứu đề tài Nguyên liệu tươi sau thu hái tiến hành sấy mốc chế độ khác Các khoảng nhiệt độ sấy lựa chọn để đảm bảo hao hụt hợp chất flavonoid thấp Trong nghiên cứu này, chọn khoảng nhiệt độ sấy nguyên liệu từ mức 40-80 oC dựa nghiên cứu Sriyana cộng (2011), nghiên cứu hàm lượng polyphenol nguyên liệu Orthosiphon staminiues Benth Trên sở lý thuyết, độ ẩm nguyên liệu định nước tự nước liên kết Nguyên liệu có lượng nước liên kết nhiều thời gian sấy để đạt độ ẩm định dài ngược lại Sự thay đổi hàm lượng flavonoid nguyên liệu giải thích động lực q trình trích ly flavonoid khác Nguyên liệu tươi có hàm ẩm cao, chênh lệch nồng độ (gradient nồng độ) không lớn mẫu nguyên liệu tách 37 ẩm Hơn nữa, q trình sấy góp phần cải thiện hiệu trích ly hợp chất flavonoid tính thấm thành tế bào màng tế bào gia tăng tính chọn lọc qua màng bị giảm thành tế bào bị biến tính nhiệt trình sấy (José, 2003) Điều phù hợp với nghiên cứu tác giả Li cộng (2006) số đối tượng nguyên liệu vỏ trái thuộc họ citrus, nhóm tác giả kết luận độ ẩm nguyên liệu thấp hiệu trích ly flavonoid cao Bên cạnh đó, khơng thể khơng nhắc đến vai trò phân hủy hợp chất flavonoid loại enzyme polyphenol oxidase có mặt mẫu nguyên liệu tươi mà khảo sát Sự diện enzyme xay nghiền nguyên liệu tươi trước trích ly tạo điều kiện cho hoạt động oxy hóa phần flavonoid Các mẫu trải qua trình sấy vừa tăng động lực trích ly đồng thời ức chế hoạt động enzyme polyphenol oxidase trước nghiền nhỏ nguyên liệu Việc gia nhiệt nhiệt độ cao phân hủy oxy hóa hợp chất flavonoid nhiều, việc tăng nhiệt độ rút ngắn thời gian sấy độ giảm thời gian lại không tương xứng với độ giảm hàm lượng hoạt tính chất trích ly Điều đề cập đến nghiên cứu Nasir cộng (2008) tác giả nghiên cứu trình sấy olive Họ nhận thấy, nhiệt độ sấy lớn 70 oC hàm lượng hoạt tính oleurpein số phenolic khác bắt đầu giảm mạnh làm cho trình oxy hóa flavonoid diễn mạnh mẽ dẫn đến giảm hàm lượng lẫn hoạt tính flavonoid có ngun liệu trước thực q trình trích ly Ngun liệu sau sấy chế độ đến độ ẩm đạt yêu cầu tiếp tục xay nghiền ray qua màng ray có kích thước 0.5mm, thu nhận bột khơ có kích thước lọt lỗ sàng dao động từ 250 – 500µm Kích thước chúng tơi lựa chọn dựa theo nghiên cứu tác giả: Qu cộng (2010), Kossah cộng (2010), Dianlov cộng (2011) Qu cộng (2010) thực đề tài nghiên cứu mơ hình tách chiết hợp chất chống oxy hóa lựu với kích thước ngun liệu cho q trình khảo sát thay đổi 0.2, 0.5 đến 3.5 mm với thời gian trích ly đến 90 phút Kết cho thấy kích thước hạt nhỏ thời gian trích ly ngắn ngược lại Tóm lại, điều kiện trích ly tác giả khác việc lựa chọn kích thước 38 nguyên liệu nghiên cứu tác giả tuân theo nguyên tắc là: kích thước hạt nhỏ q trình trích ly chất khỏi nguyên liệu ngắn diện tích bề mặt tiếp xúc nguyên liệu với dung môi tăng lên, nhờ ta rút ngắn thời gian nâng cao hiệu trích ly Theo Zhenbin Wang et al, 2011 Zhongli Pan, Haile Ma and Griffiths G Atungulu, (The Open Food Science Journal, 2011, 5, 17-25) kích thước hạt nhỏ làm giảm khoảng cách khuếch tán chất trích vào dung mơi tăng gradient nồng độ; từ giúp cho khoảng cách tiếp cận dung môi chất tan ngắn hơn, dẫn tới thời gian trích ly ngắn cho hiệu cao Nhưng kích thước xay nghiền nhỏ (