khảo sát khả năng hình thành bào tử bacillus clausii

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI • • • • NGUYỄN THỊ HIÈN KHẢO SÁT KHẢ NĂNG HĨNH THÀNH BÀO TỬ CỦA VI KHUẨN Bacillus cỉausii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ • • • Kho tài liệu miễn phí Ket-noi.com blog giáo dục, cơng nghệ HÀ NỘI - 05/2012 B ộ YTẾ TRƯỜNG ĐAI HOC DƯƠC HÀ NƠI • • • • NGUYỄN THỊ HIỀN KHẢO SÁT KHẢ NĂNG HÌNH THÀNH BÀO TỬ CỦA VI KHUẨN Bacillus clausỉỉ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ • • • Người hướng dẫn: TS Đàm Thanh Xuân Noi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược Trường đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 05/2012 LỜI CẢM ƠN Với tất kính trọng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới cô giáo TS Đàm Thanh Xuân - Giảng viên môn Công nghiệp Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội, người ln động viên, tận tình hướng dẫn tơi suốt q trình thực đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn DS Lê Ngọc Khánh, DSệ Nguyễn Khắc Tiệp tồn thể thày giáo anh chị kĩ thuật viên môn Công nghiệp dược nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt thời gian nghiên cứu để hồn thảnh khỏa luận Tơi xin cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, thầy giáo trường Đại học Dược Hà Nội dìu dắt tơi suốt q trình học tập trườngắ Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè ln bên, động viên giúp đỡ sống học tập Hà Nội, ngày 15 tháng năm 2012 Sinh viên Nguyễn Thị Hiền MỤC LỤC Trang Các chữ viết tắt Danh mục bảng Danh muc hình vẽ, đồ thi Đặt vấn đề Chương TỔNG QUAN 1.1 Đại cương probiotic 1ệ1ệ1ệ Giới thiệu probiotic từ bào tử 1ệ1ệ2ệƯu điểm probiotic từ bào tử 1ệ1ệ3 Tính an tồn bào tử tạo chế phẩm probiotic 1.1.4ắ Chế phẩm probiotic từ bào tử l ể2ể Giói thiệu bào tử 1.2ắ1ắĐặc điểm bào tử .5 1.2ắ2ắ Sự hình thành bào tử 1ệ2ệ3ệ Cấu tạo bào tử 1.2ắ4ắ Sự nảy mầm bào tử 1.2ắ5 Sức đề kháng bào tử 1.2ắ6 Các yếu tố ảnh hưởng tới hình thành bào tử 1.3 Gỉớỉ thiêu Bacillus clausii 1ệ3ệ1ệĐặc điểm sinh lí hình thái Bacillus clausỉỉ .8 1.3.2ắứng dụng Bacillus clausỉỉ .9 Chương 2ề NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIÉT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị 2ắ1ắ1ắNguyên liệu, hóa chất 12 2ểl ể2ểMáy móc, thiết bị 13 2ệl ệ3ệMôi trường sử dụng 13 2.2 Nội dung nghiên cứu 2ệ2ệl ệ Khảo sát khả hình thành bào tử B clausii điều kiện nuôi cấy khác 14 2ệ2ệ2ệKhảo sát ảnh hưởng ion mangan đến hình thành bào tử 14 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2ệ3ệ1ệHoạt hóa giống từ chế phẩm Enterogermina 14 2ệ3ệ2ệ Giữ giống thạch nghiêng 14 2ể3.3 Chuẩn bị dịch nhân giống 14 2ắ3.4ắPhương pháp thu bào tử 15 2ắ3.5 Phương pháp nhuộm màu bào tử: theo Ôgietska 15 2ắ3.6 Phương pháp xác định thời điểm tạo bào tử vi khuẩn 16 2ắ3.7 Phương pháp xác định lượng bào tử hình thành theo thời gian 17 2ệ3ệ8ệ Phương pháp khảo sát ảnh hưởng ion mangan đến hình thành bào tử .17 Chương KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Khảo sát khả tạo bào tử B clausii điều kiện nuôi cấy khác 3.1.1 Khả hình thành bào tử ni cấy điều kiện tự nhiên 19 3.1.1.1 Môi trường lỏng 20 3.1.1.2ắMôi trường đặc 22 3.1.2ể Khả hình thành bào tử xử lý nhiệt sinh khối 26 3.1.2ể1ểMôi trường lỏng 27 ệ1ệ2ệ2ệMôi trường đặc 28 3.2ể Khảo sát ảnh hưởng ỉon mangan đến hình thành bào tử 3.2ểl ểMơi trường lỏng .32 Kho tài liệu miễn phí Ket-noi.com blog giáo dục, công nghệ 3.2ắ2ắMôi trường đặc .34 KÉT LUẬN VÀ ĐÈ XUẤT 37 Tài liêu tham khảo DANH MỤC CÁC BẢNG • Nội dung Trang Bảng 2ệ1 Các hóa chất sử dụng nghiên cứu 12 Bảng 2ắ2 Các máy móc, thiết bị sử dụng nghiên cứu 13 Bảng 3ệl Tương quan lượng bào tử sinh khối nuôi cấy 21 môi trường lỏng Bảng 3ệ2 Tương quan lượng sinh khối bào tử B clausỉi 23 nuôi cấy môi trường đặc Bảng 3ệ3 Tương quan lượng bào tử sinh khối trong môi 27 trường lỏng xử lí nhiệt Bảng 3ệ4 Tương quan lượng bào tử sinh khối môi 29 trường đặc xử lí nhiệt Bảng 3.5 Tương quan lượng bào tử sinh khối môi 33 trường lỏng có ion mangan Bảng 3.6 Tương quan lượng bào tử sinh khối môi 34 trường đặc có ion mangan DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Nội dung Hình 1.1 Trang Hình ảnh B anthrasis Hình 1.2 Quá trình hình thành bào tử Hình l ệ3 Cấu tạo bào tử Hình l ể4 Chế phẩm Enterogermina 10 Hình l ệ5 Chế phẩm Erceflora 11 Hình 1.6 Chế phẩm Bazivic 11 Hình 3.1 Hình ảnh B clausii mơi trường lỏng sau 48h 20 Hình 3.2 Hình ảnh B clausii mơi trường lỏng sau 72h 20 Hình 3.3 Biểu đồ thể tương quan lượng bào tử sinh khối môi trường lỏng theo thời gian nuôi cấy Hình ảnh B clausii mơi trường đặc sau 96h ni cấy 21 Hình 3.4 Hình 3.5 Biểu đồ tương quan lượng bào tử sinh khối nuôi cấy mơi trường đặc Hình 3.6 So sánh hình thành bào tử mơi trường lỏng đặc chưa xử lí Hình 3.7 Biểu đồ tương quan lượng bào tử sinh khối nuôi cấy mơi trường lỏng có xử lí nhiệt Hình 3.8 Biểu đồ tương quan lượng bào tử sinh khối ni cấy mơi trường đặc có xử lí nhiệt Hình 3ệ9 So sánh hình thành bào tử nuôi cấy môi trường đặc lỏng có xử lí nhiệt Hình 3.10 Biểu đồ thể tương quan lượng bào tử sinh khối mơi trường lỏng có ion mangan Hình 3.11 Hình ảnh B clausii mơi trường đặc có ion mangan sau 24h Hình 3ệ12 So sánh hình thành bào tử mơi trường đặc có khơng có ion mangan Kho tài liệu miễn phí Ket-noi.com blog giáo dục, công nghệ 23 24 25 28 29 31 33 34 35 ĐẢT VẮN ĐÈ • Trong đường người có diện lớn hệ vi sinh vật với khoảng 100 tỉ vi khuẩn, bao gồm vi sinh vật có lợi (như loài thuộc chi Lactobacillus, Bifidobacteria) vi sinh vật gây hại (như Clostridium, Staphylococcus ) Các vi sinh vật có lợi có tác động tốt cho sức khỏe tổng họp vitamin, giảm hình thành chất gây hại một, hỗ trợ tiêu hóa, giúp hấp thu tốt cải thiện rối loạn đường một, tăng cường sức đề kháng, giúp phòng bệnhệ Ngược lại, vi sinh vật gây hại gây tác động xấu cho thể hình thành chất gây hoại tử ruột, chất gây ung thư, tiêu chảy Trong sống hàng ngày, hệ vi sinh vật đường dễ bị tác động yếu tố bên ngồi lão hóa, dùng kháng sinh, thức ăn không vệ sinh làm cân số lượng vi khuẩn có lợi có hại, gây nên bệnh đường ruột tiêu chảy điển hình Vì việc trì lượng vi sinh vật có lợi chiếm ưu nhằm hỗ trợ chức tiêu hóa miễn dịch đường quan trọng Sử dụng sản phẩm chứa vi sinh vật có lợi (Probiotic) nhằm bổ sung, cân lại hệ vi sinh vật đường ruột phương pháp phòng chữa bệnh tiêu chảy Probiotic sử dụng dạng tế bào (chi Lactobacillus, Bifidobacterium ) dạng bào tử (chi Bacillus ) chế phẩm chứa bào tử B clausỉỉ dùng phổ biến giới Tuy nhiên, Việt Nam, vi khuẩn B clausỉỉ chưa nghiên cứu nhiều Do đề tài: “Khảo sát khả hình thành bào tử vỉ khuẩn Bacillus clausip’ thực để giải mục tiêu sau: Khảo sát khả hình thành bào tử Bacillus clausii điều kiện nuôi cay khác Khảo sát ảnh hưởng ion mangan đến hình thành bào tử CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Đại cương probiotic 1.1.1 Giới thiệu probiotic từ bào tử “Probiotic” xuất phát từ “prolife”, tiếng Hy Lạp, có nghĩa “dành cho sống” Theo FAO/WHO probiotic định nghĩa sau: Probiotic hay hỗn hợp nhiều vi khuẩn mà cung cấp cho người hay động vật mang lại hiệu có lợi cho vật chủ cách tăng cường đặc tính vi sinh vật hệ tiêu hóa [12]ệ Vi sinh vật sử dụng chế phẩm probiotic dạng tế bào bào tử, chế phẩm probiotic chứa bào tử vi khuẩn tương đối phổ biến Trong loại vi sinh vật có khả tạo bào tử, bào tử loài thuộc chi Bacillus thường sử dụng để tạo probiotic nhờ ưu điểm vượt trội tính an tồn cao Các lồi hay dừng là: Bacillus subtilis, Bacillus clausii, Bacillus cereus, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis Sản phẩm chứa bào tử vi khuẩn B clausiỉ Enterogermina sản xuất Ý (năm 1958) [13] 1.1.2 ưu điểm probiotic từ bào tử Bào tử vi khuẩn có sức đề kháng lớn với điều kiện khắc nghiệt môi trường chế phẩm probiotic từ bào tử có ưu điểm sau: v' Trong trình sản xuất, điều kiện sấy, đông khô không ảnh hưởng tới số lượng chất lượng bào tử chế phẩm probiotic s Trong trình lưu hành thị trường chế phẩm probiotic từ bào tử chịu ảnh hưởng điều kiện môi trường nên đảm bảo yêu cầu tiêu chuẩn chất lượng sản phẩmắ v' Các bào tử có khả chịu đựng pH dày tác động muối mật, để tới non nảy mầm 27 Trong mơi trường lỏng: B clausỉỉ ni cấy 50ml MT1, 37°c, 100 vịng/phút, sau thời điểm 1, 2, 3, ngày, lấy mẫu đun cách thủy 100°c lh, làm tiêu xác định thời điểm xuất bào tử theo phương pháp nêu mục 2.3.5 Đồng thời, lấy mẫu xử lí lysozyme theo phương pháp mục 2.3ệ4.1 xác định lượng bào tử tạo thành theo thời gian Trong môi trường đặc: Nuôi cấy B clausỉỉ 25ml môi trường đặc MT đĩa petri, ủ 37°c Sau 1, 2, ngày, thu sinh khối xử lí nhiệt cách đun cách thủy 100°c/lh, xác định thời điểm xuất bào tử xác định lượng bào tử tạo thành theo thời gian tương tự môi trường lỏngắ ♦♦♦ Kết thu sau: 3.I.2.I Trong môi trường lỏng > Thời điểm xuất bào tử: Khi ni cấy hiếu khí mơi trường lỏng, sau 24h không phát bào tử dù qua xử lí nhiệt, sau 48h ni cấy sinh khối xử lí nhiệt thể nhiều bào tử màu đỏ, tế bào chứa chấm nhỏ bên màu đỏ tương đối nhiều Trong đó, ni cấy lỏng khơng có xử lí nhiệt sinh khối, sau 24h 48h chưa thấy có tế bào có chấm đỏệ Như vậy, có tác động nhiệt độ, phần tế bào sinh dưỡng B clausii chuyển thành dạng bào tử, so với khơng có tác động nhiệt, bào tử B clausii xuất sớm hon (48h so với 72h)ệ > Thòi điểm thu nhiều bào tử nhất: Lượng sinh khối bào tử tạo thể bảng 3.3 Bảng 3.3: Tương quan lượng bào tử sinh khối mơi trường lỏng xử lí nhiệt Lượng sinh khối (mg) Lượng bào tử (mg) 530,1 - % bào tử hình thành so vổi sinh khối - 28 591,2 340,9 57,66 497,6 306,9 62,22 511,0 410,0 80,23 411,8 273,7 66,46 357,0 239,5 67,09 289,7 191,7 66,17 Hình 3Ế7: Biểu đồ tương quan lượng bào tử sinh khối nuôi cấy mơi trường lỏng có xử lí nhiệt Bảng 3.3 cho thấy, sau xử lí sinh khối nhiệt, lượng bào tử tạo vào ngày thứ đạt giá trị cao (410,0 mg) chiếm 80,23% so với tổng lượng sinh khối Sau ngày thứ lượng sinh khối bào tử giảm đần Bảng 3.1 3.3 cho thấy, theo thời gian ni cấy có xử lí nhiệt khối lượng bào tử tạo (phần trăm bào tử hình thành) nhiều so với điều kiện tự nhiên thời điểm Điều chứng tỏ, việc xử lí nhiệt đẩy q trình tạo bào tử vi khuẩn nhanh hơn, giúp giảm bớt thời gian ni cấy giảm chi phí sản xuấtệ 3.I.2.2 Trong môi trường đăc > Thời điểm xuất bào tử: 29 Trên vi trường bào tử màu đỏ xuất tương đối nhiều, tế bào màu xanh tế bào mang bào tử đỏ chiếm lượng lớn sau 24hệ > Thời điểm thu nhiều bào tử nhất: tương quan lượng bào tử tạo thành theo thời gian thể bảng 3ệ4 Kết cho thấy, phàn trăm lượng bào tử tạo thành tăng dần theo thời gian, tới ngày thứ đạt 87,20% Tuy nhiên, ngày thứ lượng sinh khối thu lớn nhất, bào tử thu lớn (265,6 mg) Bảng 3Ề4: Tương quan lượng bào tử sinh khối môi trường đặc khỉ xử lí nhiệt T ^ N g a y )^ ^ Lượng sinh khối (mg) 267,6 Lượng bào tử (mg) 125,2 % bào tử hình thành so vói sinh khối 45,26 320,0 165,9 51,84 412,4 265,6 64,40 251.4 160.2 63,73 242,6 161,5 66,57 288,3 207,8 72,08 173,5 151,3 87,20 thời gian (ngày) Hình 3Ế8: Biểu đồ tương quan lượng bào tử sinh khối nuôi cấy môi trường đặc có xử lí nhiệt 30 Từ kết bảng 3.4 bảng 3ệ2 thấy lượng bào tử B clausỉỉ tạo thành sau nuôi cấy bề mặt môi trường đặc xử lí nhiệt lớn ni cấy từ mơi trường đặc khơng xử lí nhiệtệ Phàn trăm lượng bào tử tạo thành xử lí nhiệt cao khơng xử lí nhiệt, nhiên chênh lệch khơng lớnệ Sau ngày ni cấy mơi trường đặc có xử lí đạt 87,20%, khơng xử lí nhiệt đạt 83,74% Sau ngày nuôi cấy môi trường đặc, có 80% tế bào sinh dưỡng chuyển thành bào tử, lượng tế bào sinh dưỡng sinh khối cịn lại khơng nhiều nên có tác động nhiệt độ vào lượng tế bào chuyển thành dạng bào tử khơng nhiều Do đó, sau ni cấy ngày mơi trường đặc có xử lí nhiệt lượng bào tử tăng khơng nhiều, từ 83,74% lên 87,20%ệ ❖ So sánh môi trường đạc lỏng xử lí nhiêt: Khi so sánh khả hình thành bào tử ữong điều kiện ni cấy đặc lỏng thấy: > Thời điểm hình thảnh bào tử: Sau xử lí nhiệt sinh khối, thời điểm xuất bào tử môi trường đặc 24h, môi trường lỏng sau 48h (2 ngày) Như vậy, xử lí nhiệt ni cấy mơi trường đặc bào tử xuất sớm môi trường lỏngệ > Thời điểm thu bào tử lớn nhất: Kết hình 3.9 cho thấy, thời điểm lượng bào tử hình thành lớn mơi trường lỏng ngày, môi trường đặc ngàyệ 31 Hình 3.9: So sánh hình thành bào tử nuôi cấy môi trường đặc lỏng có xử lí nhiệt Như vậy, sau thu sinh khối xử lí nhiệt kết cho thấy: mơi trường đặc lượng bào tử hình thành lớn (87,20%) môi trường lỏng (80,23%) Tuy nhiên, chênh lệch khơng lớn Như vậy, chọn môi trường đặc để thu bào tử B clausỉỉ phải ni cấy ngày, mơi trường lỏng cần ngày phải có xử lí nhiệt Nuôi cấy ngày tiết kiệm chi phí ni cấy, tăng suất ♦♦♦ Kết luận: Từ kết lựa chọn ni cấy thu bào tử cách nuôi cấy lỏng ngày có xử lí nhiệt sinh khối ni cấy đặc ngày khơng xử lí Tuy nhiên, ni cấy đặc tốn chi phí điện năng, thiết b ị so với nuôi cấy mơi trường lỏngệVì vậy, để thu bào tử nhanh nhiều nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng ion mangan tới hình thành bào tử 3.2 Khảo sát ảnh hưởng ion mangan đến hình thành bào tử Sự hình thành bào tử B clausỉỉ chịu ảnh hưởng nhiều yếu tố, có yếu tố vật lí như: nhiệt độ ni cấy, pH mơi trường, cấp khí ễvả yếu tố hóa học như: nồng độ carbon, nitơ, nguyên tố vi lượng ắ Mỗi yếu tố có ảnh hưởng khác tới hình thành bào tử vi khuẩn B 32 clausỉỉ Trong yếu tố đó, có mặt ion mangan yếu tố càn thiết thúc đẩy trình hình thành bào tử vi khuẩn B clausỉỉ Khảo sát ảnh hưởng ion mangan tới hình thành bào tử thực môi trường: đặc lỏng với nồng độ 10"5M ❖ Mục tiêu: Xác định thời điểm hình thành bào tử tạo nhiều bào tử vi khuẩn B clausỉỉ mơi trường lỏng đặc có mặt Mn2+ệ ♦♦♦ Tiến hành: Trong môi trường lỏng: Nuôi cấy B clausii mơi trường MT1 có bổ sung MnSƠ4 10"5M Sau 1, 2, ệ ngày lấy mẫu làm tiêu xác định thời điểm hình thành bào tử, đồng thời lấy mẫu xử lí thu bào tử theo phương pháp nêu mục 2ệ3ệ4ệl xác định lượng bào tử tạo thành theo thời gian nuôi cấy Trong môi trường đặc: B clausii ni cấy mơi trường MT2 có bổ MnS04 1O'5M đĩa petri 37°c Sau 1,2,3 ngày xác định thời điểm hình thành bào tử lượng bào tử tạo thành theo thời gian nuôi cấy môi trường lỏng ❖ Kết quả' 3.2.1 Trong môi trường lỏng > Thời điểm xuất bào tử: Khi quan sát vi trường thời điểm 24h thấy có bào tử màu đỏ Trong mơi trường lỏng khơng có ion mangan, sau 72h bào tử xuất hiệnắ Điều cho thấy ảnh hưởng tích cực ion mangan tới hình thành bào tử, kích thích bào tử xuất sớm hơnệ > Thời điểm thu nhiều bào tử nhất: lượng sinh khối bào tử tạo thành theo thời gian thể bảng 3.5 33 Bảng 3.5: Tương quan lượng bào tử sinh khối môi trường lỏng có ỉon mangan ^ (N g a y )^ \ Lượng sinh khối (mg) Lượng bào tử (mg) % bào tử hình thành so với sinh khối 831,0 743,0 446,5 397,2 350,4 394,0 356,3 79,5 158,3 252,9 258,5 245,4 301,6 168,6 9,57 22,16 56,64 65,00 70,03 76,55 47,32 thời gian (ngày) Hình 3.10: Biểu đồ thể tương quan lượng bào tử sinh khối mơi trường lỏng có ion mangan Kết bảng 3.5 hình 3.10 cho thấy, thời điểm 24h lượng sinh khối thu lớn (831,0 mg sinh khối ướt/50ml dịch lên men), sau lượng sinh khối giảm dàn Như vậy, mơi trường có ion mangan kích thích tế bào B clausii sinh trưởng mạnh mẽ hơn, sau 24h lượng sinh khối đạt lớn (831,0 mg), mơi trường khơng có ion mangan lượng sinh khối đạt lớn thời điểm 72h (655,2 mg)ắ Lượng bào tử tăng dần theo thời gian nuôi cấy đạt lớn môi trường nuôi cấy bổ sung ion mangan sau ngày (301,6 mg) chiếm 76,55% 34 so với tổng lượng sinh khối Lượng bào tử đạt lớn mơi trường lỏng khơng có ion mangan sau ngày, đạt 51,35% so với tổng lượng sinh khối, mơi trường có ion mangan lượng bào tử sau ngày đạt 65% so với tổng sinh khối Như vậy, ion mangan thêm vào môi trường nuôi cấy kích thích bào tử tạo sớm hom nhiều 3ệ2.2 Trong môi trường đặc > Thời điểm xuất bào tử: sau 24h làm tiêu soi kính hiển vi thấy bào tử màu đỏ xuất nhiều Hình 3.11: Hình ảnh B clausii mơi trường đặc có ỉon mangan sau 24h > Thời điểm thu bào tử B clausii lớn nhất: Lượng sinh khối bào tử B clausỉi thu theo thời gian nuôi cấy thể bảng 3.6 Bảng 3.6: Tương quan lượng bào tử sinh khối môi trường đặc có ion mangan ^N gàyK Lượng sinh khối (mg) Lượng bào tử (mg) % bào tử hình thành so i sinh khối 367,9 307,4 364,3 361,8 218,7 201,9 286,0 357,8 59,45 65,68 78,51 98,89 35 Kết bảng 3.6 cho thấy, sau 24h lượng bào tử đạt 50% so với tổng lượng sinh khối Tới ngày (96h) lượng bào tử đạt 98% so với tổng lượng sinh khối Lượng bào tử đạt cao nhiều so với lượng bào tử tạo thành nuôi cấy môi trường lỏng có ion mangan mơi trường đặc khơng có ion manganệ Hình 3Ế12: So sánh hình thành bào tử mơi trường đặc có khơng có ỉon mangan Mơi trường khơng có mangan, sau ngày đạt 80%, mơi trường có ion mangan sau ngày đạt 98% Theo nghiên cứu Rossont R A Nealson Kắ H [19], tất vi khuẩn địi hỏi có ion mangan mức độ thấp cho tăng trưởng trao đổi chất, trực khuẩn nói chung càn nhiều ion mangan cho hình thành bào tử kháng nhiệt so với phát triển tế bào sinh dưõngệ Các kết cho thấy, bổ sung ion mangan vào môi trường nuôi cấy B clausii tăng trưởng mạnh mẽ số lượng đặc biệt 24h đàu, đồng thời kích thích hình thành bào tử Cơ chế hình thành bào tử De Vrind J p M [8] đưa Mn2+ bị oxy hóa thành MnƠ2 bám bề mặt bào tửệ Theo Mikio Amaha cộng [5], với lồi Bacillus coagulans ni cấy mơi trường đặc có ion mangan sau ngày hình thành bào tử gần hồn tồn 36 ❖ Kểtluận: lon mangan có tác động tích cực lên trình tạo bào tử vi khuẩn, việc thêm ion mangan với nồng độ 10'5 M vào môi trường lỏng đặc làm tăng lượng bào tử thu đượcệNhư vậy, điều kiện lựa chọn để thu bào tử mơi trường đặc có bổ sung ion mangan với nồng độ 10"5 M 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KÉT LUẬN Trên sở kết đạt được, đề tài đạt số kết luận sau: l ẵl ể Khả hình thành bào tửi?Ệc/au5iềiệtrong điều kiện nuôi cấy khác ❖ Sự hình thành bào tử điều kiện phát triển tự nhiên Khi nuôi cấy môi trường lỏng, thời điểm bắt đầu hình thành bào tử 72h thời điểm thu nhiều bào tử sau ngày ni cấy với tỉ lệ hình thành bào tử 51,35% so với tổng sinh khối Trong môi trường đặc, thời điểm bắt đầu xuất bào tử 24h thời điểm thu nhiều bào tử sau ngày nuôi cấy với tỉ lệ hình thành bào tử 83,74% so với tổng sinh khối ❖ Sự hình thành bào tử có xử lí nhiệt: Khi xử lí nhiệt sinh khối thu từ môi trường lỏng, thời điểm xuất bào tử 48h thời điểm thu nhiều bào tử sau ngày ni cấy với tỉ lệ hình thành bào tử 80,23% so với tổng sinh khối Khi xử lí nhiệt sinh khối thu từ mơi trường đặc, thời điểm xuất bào tử 24h thời điểm thu nhiều bào tử sau ngày ni cấy với tỉ lệ hình thành bào tử 87,20% so với tổng sinh khối l ẵ2ể Ảnh hưởng ion mangan tổi hình thành bào tử Mơi trường lỏng có Mn2+, thời điểm bắt đàu hình thành bào tử 24h thời điểm thu nhiều bào tử sau ngày nuôi cấy với tỉ lệ hình thành bào tử 76,55% so với tổng sinh khối Mơi trường đặc có Mn2+, thời điểm bắt đàu xuất bào tử 24h thời điểm thu nhiều bào tử sau ngày ni cấy với tỉ lệ hình thành bào tử > 98% so với tổng sinh khối 38 Như vậy, thu bào tử sử dụng cho chế phẩm probiotic cách nuôi cấy mơi trường đặc có ion mangan thời điểm ngày ĐỀ XUẤT Do thời gian thực có hạn nên đề tài cịn nhiều thiếu sót hạn chếệDưới số đề xuất để đề tài hồn thiện hơn: Khảo sát ảnh hưởng số thơng số đến hình thành bào tử B clausỉỉ như: chế độ cấp khí, nồng độ cacbon, phospho, nitơ, nguyên tố vi lượng khác ệ Xác định số lượng bào tử khối lượng sinh khối định để lập công thức sản xuất TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1ệ Bộ môn Vi sinh - Sinh học (2007), Vi sinh vật học, Trường đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr 2 - ệ 2ệ Lê Xuân Phương (2008), Thí nghiệm vỉ sinh vật học, Đại học Đà Nắng, Đà Nằng, trệ 54 - 55ệ 3ệ Nguyễn Duy Khánh (2006), Khảo sát điều kiện nuôi cấy sinh bào tử vỉ khuẩn Bacillus subtỉlỉs, Khóa luận tốt nghiệp kĩ sư chuyên ngành công nghệ sinh học, Trường đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh 4ắ Nguyễn Lân Dũng (2000), Giáo trình vi sinh vật học, Nxb giáo dục Tiếng Anh 5ệ Amaha M et alệ (1955), “Sporulation requirements of Bacillus coagulans var Thermoacidurans in complex media”, Journal o f Bacteriology, 72(1), ppắ - Chamey J et al (1951), “Manganese as an essential element for sporulation in the genus bacillus” J Bacteriol, 62(2), ppắ 145- 148 Dawes I w and Mandelstam J (1970), “Sporulation of Bacillus subtilis in continuous culture”, Journal o f Bacteriology, 103(3), pp 529-535 De Vrind J p M (1986), “Manganese oxidation by spores and spore coats of a marine Bacillus species”, Applied and Environmental Microbiology, 52(5), ppắ 1096-1100 Denizci D K A A and Erarslan M N K Aể (2005), “Purification and characterization of a serine alkaline protease from Bacillus clausii GMBAE 42”, Microbiol Biotechnol, 32, pp 335-344ắ 10 Devil N ệ Kệ A et alệ (2008), “Bacillus clausii MB9 from the east coast regions of India: Isolation, biochemical characterization and antimicrobial potentials”, Current science, 95, ppệ 627 - 636ệ l l ệ Donnellan Jệ E et al (1964), “Chemically defined, synthetic media for sporulation and for germination and growth of Bacillus subtilis”, Journal o f bacteriology, 87(2), ppệ 332-336ệ 12ẽ FAOAVHO (2001), Probiotic in foodệ 13ệ Hong H A., Le Hong Due, Simon Mệ c (2005), “The use of bacterial spore formers as probiotics”, FEMS Microbiology Reviews, 29, pp 813835 14ệ Kumar Cệ Gệ et alệ (2004), “Thermostable alkaline protease from a novel marine haloalkalophilic Bacillus clausii isolate”, World Journal o f Microbiology & Biotechnology, 20, pp 351-357 15ệ Lippolis Rosa et al (2011), “Comparative proteomic analysis of four Bacillus clausii sữains: Proteomic expression signature distinguishes protein profile o f the strains”, Journal of proteomics, 74, pp 2846 - 2855 16 Nicholson, Setlow w L and p (1990), “Sporulation, germination, and outgrowth”, pp 391 -450 17 Nielsen Pắ et alệ (1995), “Phenetic diversity of alkaliphilic Bacillus strains: proposal for nine new species”, Microbiology, 141, ppắ 1745-1761 18 Oskouie s F G et alệ (2008), “Response surface optimization of medium composition for alkaline protease production by Bacillus clausii”, Biochemical Engineering Journal, 39, pp 37—42 19 Rossont R Aắ and Nealson K Hắ (1982), “Manganese binding and oxidation by spores of a marine Bacillus”, Journal o f bacteriology, 151(2), ppắ 1027-1034ắ 20 Sharpe E s and Rhodes R Aắ (1973), “The Pattern of Sporulation of Bacillus popilliae in Colonies”, Journal o f Invertebrate Pathology, 21, pp 9-15 21 ệ Spinosa Mệ R et al (2000), “On the fate of ingested Bacillus spores”, Res Microbiol, 151, pp 361-368ệ 22ệ Yazdany Sệ and Lashkari K Bệ (1975), “Effect of pH on sporulation of Bacillus stearothermophilus” Appl Environ Microbiol, 30(1), ppệ 1-3 23Ểhttp://eurekamagỂcom/kevphrase/b/001/bacillus-clausiiỂt)hp 24 ■httn://mi crohe wi ki ■kenvon ễe du/index ễphp/B acillus clausii 25Ễhttp://wwwỄatcc.org 26Ểhttp://wwwỂứiuocbietduoc.comỂvn/Estore/drg3165spl 508Ểaspx ... nhiều Do đề tài: ? ?Khảo sát khả hình thành bào tử vỉ khuẩn Bacillus clausip’ thực để giải mục tiêu sau: Khảo sát khả hình thành bào tử Bacillus clausii điều kiện nuôi cay khác Khảo sát ảnh hưởng ion... pháp khảo sát ảnh hưởng ion mangan đến hình thành bào tử .17 Chương KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Khảo sát khả tạo bào tử B clausii điều kiện nuôi cấy khác 3.1.1 Khả hình thành bào tử ni... dung nghiên cứu 2.2.1 Khảo sát khả hình thành bào tử B clausii điều kiện nuôi cấy khác 2ệ2.1ệ1 Khả hình thành bào tử ni cấy điều kiện tự nhiên 2ệ2.1ệ2 Khả hình thành bào tử xử lý nhiệt sinh khối