Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii

Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii

Trang 1

BO Y TE TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI S NỌC g— Ky BoD 7 § É mw a i, NGUYÊN THỊ HIẾN

KHAO SAT KHA NANG HINH

THANH BAO TU CUA VI KHUAN

Bacillus clausti

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 05/2012

Trang 2

BO Y TE

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYEN THI HIEN

KHAO SAT KHA NANG HINH THANH BAO TU CUA VI KHUAN Bacillus clausti KHOA LUAN TOT NGHIEP DUOC Si Người hướng dẫn: TS Đàm Thanh Xuân Nơi thực hiện:

Bộ môn Công nghiệp Dược Trường đụi học Dược Hà Nội

HÀ NỘI - 05/2012

Trang 3

LỜI CÁM ƠN

Với tất cả sự kính trọng, tôi xin bảy tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu

sắc tới cô giáo T'% Đàm Thanh Xuân — Giảng viên bộ môn Công nghiệp Dược — Trường Đại học Dược Hà Nội, người đã luôn động viên, tận tình

hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn DS Lê Ngọc Khánh, DS Nguyễn Khắc

Tiệp cùng toản thé cdc thay cô giáo và các anh chị kĩ thuật viên bộ môn Công nghiệp dược đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu để hồn thành khóa luận

Tơi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, các thầy cô giáo

trường Đại học Dược Hà Nội đã dìu dắt tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

Cuôi cùng, tôi xin bày tỏ lòng biệt ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn ở bên, động viên và giúp đỡ tôi trong cuộc sông và học tập

Hà Nội, ngày 15 thang 5 nam 2012 Sinh viên

Trang 4

MỤC LỤC Trang Các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ, đồ thị

Đặt vấn đỀ <5 <6 sư Sư g2 ong go g0 g0 5ø 1

Chuong 1 TONG QUAN

1.1 Dai cwong vé probiotic

1.1.1 Giới thiệu về probiotic từ bảo tử - - xxx svevevseserresee 2

1.1.2 Ưu điểm của probiotic từ bào tử xxx se xessreree 2

1.1.3 Tính an toàn của bảo tử tạo chế phẩm probiotic «: 3

1.1.4 Chế phẩm probiotic từ bào tử - + + +xx+xexeEseseerssee 4

1.2 Giới thiệu về bào tử

1.2.1 Đặc điểm của bào tử tac TE 1H ng He re sseesersrd 5 1.2.2 Sự hình thành bào tỬ - - Ccc Ăn S SH nH Hy vế 5 1.2.3 Cấu tạo của bảo th oes eeeeeesecseesseessesneesseesecssecseceneesesneeseenneenseeneeses 6

1.2.4 Sự nảy mầm của bào tử - + 2x39 2 cv vkgkvererrkved 7

1.2.5 Sức đề kháng của bào tỬ ch HH TT g reyg 7 1.2.6 Các yếu tô ảnh hưởng tới sự hình thành bảo tử - 8

1.3 Giới thiệu về Bacillus clausii

1.3.1 Đặc điểm sinh lí hình thai cla Bacillus clausii cà: 8

1.3.2 Ứng dụng của Bacillus CLAUSE .o.ccccccccccccccscsssscsescsesssssestseseseaees 9

Chương 2 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị

Trang 5

2.1.2 Máy móc, thiẾt bị - sst t1 2971 1 1113 97 1x11 re rerkved 13

2.1.3 Môi trường sử dụng - .- -á - < HH ng g1 1 kh 13

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Khảo sát khả năng hình thành bào tử của Ö ciausii trong các

điều kiện nuôi cây khác nhau . - - + 2 6 SE E*£E£E£vEeEecrkeed 14

2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của ion mangan đến sự hình thành bảo tử 14

2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Hoạt hóa giống từ chế phẩm Enterogermina - 2 - 14 2.3.2 Giữ giống trên thạch nghiêng . + + << E+xcx se £exced 14 2.3.3 Chuẩn bị dịch nhân giỗng - + - s9 2E x+EkeveEsrererkred 14 2.3.4 Phương pháp thu bào tỬ .- - - G - SH H1 n 11H HS HH ng H111 k4 15 2.3.5 Phương pháp nhuộm màu bảo tử: theo Ôgietska 15

2.3.6 Phương pháp xác định thời điểm tạo bào tử của vi khuẩn 16

2.3.7 Phương pháp xác định lượng bào tử hình thành theo thoi gian 17

2.3.8 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của ion mangan đến sự hình thành bảo tỬ - - HH nọ Th cg nk 17 Chương 3 KẾT QUÁ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Khảo sát khả năng tạo bào tử B cizusii trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau 3.1.1 Khả năng hình thành bào tử khi nuôi cấy ở điều kiện tự nhiên 19 3.1.1.1 Môi trường lỏng - SH ng xu 20 SN 008i: 0 22 3.1.2 Khả năng hình thành bảo tử khi xử lý nhiệt sinh khối 26 S00 008i 150 01111— 27

3.1.2.2, MO1 trOng AAC oe 28

Trang 6

3.2.2 Môi trường đặc

KẾT LUẬN VÀ ĐÈ XUẤT

Trang 7

Nội dung Bang 2.1 Bang 2.2 Bang 3.1 Bang 3.2 Bang 3.3 Bang 3.4 Bang 3.5 Bang 3.6 DANH MUC CAC BANG Trang

Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 12

Các máy móc, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 13

Tương quan giữa lượng bảo tử và sinh khối khi nuôi cay 21 trong môi trường lỏng

Tương quan giữa lượng sinh khối và bào tử Ö clzusi khi 23 nuôi cây trong môi trường đặc

Tương quan giữa lượng bào tử và sinh khối trong trong môi 27 trường lỏng khi xử lí nhiệt

Tương quan giữa lượng bào tử và sinh khối trong môi 29 trường đặc khi xử lí nhiệt

Tương quan giữa lượng bảo tử và sinh khối trong môi 33 trường lỏng có Ion mangan

Trang 8

Nội dung Hình 1.1 Hình 1.2 Hình 1.3 Hình 1.4 Hinh 1.5 Hinh 1.6 Hinh 3.1 Hinh 3.2 Hinh 3.3 Hinh 3.4 Hinh 3.5 Hinh 3.6 Hinh 3.7 Hinh 3.8 Hinh 3.9 Hinh 3.10 Hinh 3.11 Hinh 3.12 DANH MUC CAC HINH VE, DO THI Trang Hinh anh B anthrasis 5 Quá trình hình thành bao tử 3 Câu tạo bảo tử 6 Chế phẩm Enterogermina 10 Ché pham Erceflora 1] Ché pham Bazivic 11

Hinh anh B clausii trong m6i truong long sau 48h 20

Hinh anh B clausii trong m6i truong long sau 72h 20

Biểu đồ thể hiện sự tương quan giữa lượng bảo tử và sinh 21

khối trong môi trường lỏng theo thời gian nuôi cẫy

Hinh anh B clausii trong méi trudng dic sau 96h nudicay 23

Biểu đồ tương quan giữa lượng bảo tử và sinh khối khinuôi 24 cây trong môi trường đặc

So sánh sự hình thành bào tử trong môi trường lỏng và đặc 25

khi chưa xử lí

Biểu đồ tương quan giữa lượng bảo tử và sinh khối khinuôi 28 cây trong môi trường lỏng có xử lí nhiệt

Biểu đồ tương quan giữa lượng bảo tử và sinh khối khinuôi 29 cây trong môi trường đặc có xử lí nhiệt

So sánh sự hình thành bào tử khi nuôi cấy trong 2 môi 31

trường đặc và lỏng khi có xử lí nhiệt

Biểu đồ thể hiện sự tương quan giữa lượng bảo tử và sinh 33

khối trong môi trường lỏng có ion mangan

Hình ảnh Ö cla„sïi trong môi trường đặc có lon mangan 34

sau 24h

So sánh sự hình thành bảo tử trong 2 môi trường đặc cóvà 35

Trang 9

ĐẶT VẤN ĐÈ

Trong đường ruột con người có sự hiện diện rất lớn của hệ vi sinh vật

với khoảng hơn 100 tỉ vi khuẩn, bao gồm cả vi sinh vật có lợi (như các loài thuộc chi Lactobacillus, Bifidobacteria) va vi sinh vật gây hại (như Clostridium, Staphylococcus ) Cac vi sinh vat cé loi sẽ có tác động tốt cho sức khỏe như tổng hợp vitamin, giảm sự hình thành các chất gây hại trong

ruột, hỗ trợ tiêu hóa, giup hap thu tốt hơn và cải thiện sự rỗi loạn của đường

ruột, cũng như tăng cường sức đề kháng, giúp phòng bệnh Ngược lại, các vi

sinh vật gây hại sẽ gây ra những tác động xấu cho cơ thê như hình thành các

chất gây hoại tử trong ruột, các chất gây ung thư, tiêu chảy Trong cuộc

sống hàng ngày, hệ vi sinh vật đường ruột rất đễ bị tác động bởi các yếu tố

bên ngoài như sự lão hóa, dùng kháng sinh, thức ăn không vệ sinh làm mất cân bằng về số lượng giữa vi khuẩn có lợi và có hại, gây nên các bệnh đường

ruột trong đó tiêu chảy là một điển hình Vì vậy việc duy trì lượng vi sinh vật

có lợi chiếm ưu thế nhằm hỗ trợ các chức năng về tiêu hóa và miễn dịch ở

đường ruột là rất quan trọng

Sử dụng các sản phẩm chứa vi sinh vật có lợi (Problotic) nhằm bô sung,

cân bằng lại hệ vi sinh vật đường ruột là một trong các phương pháp phòng và chữa bệnh tiêu chảy Probiotic có thể được sử dụng dưới dạng tế bào (chỉ Lactobacillus, Bifidobacterium ) hoac dang bao tir (chi Bacillus .) trong

đó chế phẩm chứa bảo tử của B clausii duoc ding rat phd bién trén thé giới

Tuy nhiên, ở Việt Nam, vi khuan B clausii van chưa được nghiên cứu nhiều

Do đó đề tài: “Khảo sát khá năng hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus

c[ausi?° được thực hiện dé giải quyết các mục tiêu sau:

1 Khảo sát khả năng hình thành bào tử Bacillus clausii trong các điều

kiện nuôi cay khác nhau

Trang 10

CHƯƠNG 1 TỎNG QUAN

1.1 Đại cương về probiotic

1.1.1 Giới thiệu về probiotic từ bào tử

“Probiotic” xuất phát từ “prolife”, tiếng Hy Lạp, có nghĩa là “dành cho

Cuộc sông” Theo FAO/WHO probiotic được định nghĩa như sau:

Probiotic là một hay hỗn hợp nhiều vi khuân mà khi cung cấp cho

người hay động vật thì mang lại những hiệu quả có lợi cho vật chủ bằng cách tăng cường các đặc tính của vi sinh vật trong hệ tiêu hóa [12]

Vi sinh vật được sử dụng trong các chế phẩm probiotic có thể ở dạng tế bào hoặc bào tử, trong đó các chế phẩm probiotic chứa bào tử vi khuẩn tương

đôi phô biến Trong các loại vi sinh vật có khả năng tạo bào tử, bào tử của các

loài thuộc chi 8zci/us thường được sử dụng để tạo probiotic nhờ các ưu điểm vuot trdi va tinh an toan cao Cac loai hay dung 1a: Bacillus subtilis, Bacillus clausii, Bacillus cereus, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis San pham dau tién chira bao tir cua vi khuan B clausii 1a Enterogermina duoc san xuat

tai Y (nim 1958) [13]

1.1.2 Ưu điểm cia probiotic tir bao tir

Bào tử vi khuẩn có sức đề kháng rất lớn với các điều kiện khắc nghiệt

của môi trường do đó chế phẩm probiotic từ bào tử có những ưu điểm sau: v_ Trong quá trình sản xuất, các điều kiện như sấy, đông khô không ảnh hưởng tới số lượng và chất lượng bao tir trong cdc ché pham probiotic

v Trong quá trình lưu hành trên thị trường chế phẩm probiotic từ bảo tử ít chịu ảnh hưởng của điều kiện môi trường nên đảm bảo được yêu câu về tiêu chuẩn chất lượng của sản phẩm

Trang 11

vx Kháng kháng sinh (đặc biệt là vi khuẩn Ö c/zusii trong chế phẩm Enterogermina) [4], [21], [26]

1.1.3 Tinh an toan cia bao tir tao ché pham probiotic

Viéc su dung bat ki loai probiotic nào dù cho con người hay động vật

đều phải nghiên cứu tính an toàn của chế phẩm Đặc biệt là probiotic được lam tir bao tử thi van dé an toàn càng phải được nghiên cứu kĩ lưỡng vì có rất

nhiều loại bảo tử sản sinh độc tính có hại cho sức khỏe con người Khi sử

dụng bào tử cũng như tế bào của vi khuẩn thuộc chi Bacillus, can cha y một số điểm sau đây:

> Vi khuan chi Bacillus có thể gây ra nhiễm trùng:

Một số chủng Ö cereus có thể gây nôn hoặc tiêu chảy do khi vào trong đường tiêu hóa chúng sẽ nảy mầm thành tế bảo và sinh ra các loại độc tô B thuringiensis có thê sinh ra độc tố gây viêm dạ dày, ruột B licheniformis trong một số trường hợp cũng sinh ra độc tô dẫn tới tiêu chảy và cũng có trường hợp ảnh hưởng nặng tới trẻ so sinh B subtilis cing cé thé gay ra nén mura

> Tinh khang khang sinh:

Một số chủng trong các chế phẩm probiotic chứa bào tử khi sử dụng có

khả năng kháng một số loại kháng sinh như:

- B clausii ATCC 9799 kháng erythromycin, lincomycm, cephalosporins va cycloserines

- B cereus (cing nhu B thuringiensis) cé6 kha năng tạo ra ÿ- lactamase va do đó có khả năng kháng kháng sinh nhom penicillin va cephalosporin

> Để đảm bảo tính an toàn khi tạo ra chế phẩm probiotic từ bảo tử thì cần phải tuân thủ theo nguyên tắc:

Trang 12

-_ Chủng phải được lưu giữ tại ngân hàng giống quốc tế

- Chủng phải được đánh giá trong ống nghiệm để xác định an toản và các

yếu tố độc lực

-_ Xác định hoạt động kháng khuẩn

-_ Đánh giá tính an toàn trên tiền lâm sàng trong các mô hình động vật -_ Đánh giá lâm sàng trên động vật để chứng minh hiệu quả

-_ Giai đoạn I (xác định tính an toàn) thử nghiệm ở con người

- Giai đoạn II (hiệu quả) và giai đoạn II (hiệu quả) thử nghiệm Ở người

-_ Ghi nhãn đúng qui định [13|

1.1.4 Chế phẩm probiotic từ bào tử

Trên thị trường có rất nhiều chế phẩm probiotic từ bảo tử vi khuẩn, các

loại vi khuẩn hay được sử dụng là: B clausii, B subtilis, B cereus, B licheniformis véi rat nhiéu dang bao chế khác nhau và số lượng bảo tử cũng khác nhau ở cizusii được sản xuất đưới hai dạng bào chế chủ yếu là viên nang và dạng hỗn dịch — chita 2 ti bao tir trong glycerin B subtilis cé trong rất nhiều chế phẩm, có trong cả chế phâm đơn lẻ và chế phâm phối hợp với

các loại vi khuẩn khác như Lactobacillus acidophilus, dang bao chế có thể ở

dạng cốm bao trong gói hoặc trong nang cứng với số lượng bào tử từ 10” -

10° [13]

Việt Nam đã sản xuất chủ yếu các ché pham probiotic cé chita B

subtilis nhu: Bio-acimin, Bibactyl, Bidisubtilis một số chế phẩm chứa Ö

Trang 13

1.2 Giới thiệu về bào tử 1.2.1 Đặc điểm của bào tử

Bào tử là một hình thức tiềm sinh của vi khuẩn, nó giúp cho vi khuẩn vượt qua những điều kiện bất lợi như: môi trường nghèo dinh dưỡng, nhiệt

độ, pH không thích hợp, môi trường tích luỹ nhiều sản phẩm trao đôi chất bất

lợi Mỗi vi khuân chỉ tạo được một bảo tử Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ phát triển thành tế bào sinh dưỡng [1], [4]

anthracis rods

Hinh 1.1: Hinh anh B anthracis 1.2.2 Su hinh thanh bao tw

Sự hình thành bảo tử là quá trinh té bao sinh duéng chuyén thanh dang

bao tử có khả năng kháng nhiệt, hóa chất, dung môi, bức xạ, sây khô Sự hình

thành bảo tử vi khuân được chia ra làm nhiều giai đoạn như sau:

Trang 14

e_ Trong tế bào sinh dưỡng, ADN được phân chia thành chromosome riêng biệt và màng tế bảo chất lấn sâu vào phân chia tế bào để hình thành vách ngăn

e_ ADN được bao bọc hoàn toàn bằng màng tế bào chất, thành bảo tử

được hình thành và một phần vỏ cũng được hình thành

e _ Vỏ bào tử được hình thành đầy đủ bao quanh ADN

e Bao tử chín và được giải phóng ra ngoài

e_ Quá trình hình thành bảo tử mất khoảng 6 - 8h, là quá trình tương

đối phức tạp để tạo ra được cấu trúc bên vững chịu được điều kiện khắc

nghiét [1]

1.2.3 Cau tạo của bào tử

Câu trúc của bào tử là hệ thống nhiều lớp vỏ bền vững bao quanh vùng lõi chứa ADN Bào tử bao gồm:

Trang 15

Bảo tử có các lớp bao bọc chiếm 50% thê tích Vỏ bào tử có nhiều lớp,

bề mặt của các lớp này xù xì với thành phần hóa học chủ yếu là protein có chứa nhiều glyxin, tyroxin và đặc biệt là cystein, ngoải ra còn có sự tham gia cua keratin; hydratcarbon; lipid; peptidoglycan và canxi dipicolinat, không chứa acid teichoic Đây là những lớp có khá năng ngăn chặn sự thâm thấu của nước và các chất hoả tan trong nước, chúng có tác dụng tăng cường khả năng

bảo vệ bao tử trước các điều kiện bất lợi

Lõi của bào tử chứa một lượng nước rất thấp và tồn tại ở dạng liên kết cùng với canxi dipicolinat [1], [4]

1.2.4 Sự nảy mâm của bào tử

Bào tử vi khuẩn khi gặp điều kiện thuận lợi về nhiệt độ, pH, dinh

dưỡng sẽ nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng Sự nảy mam của bào tử xảy ra theo 3 giai đoạn: hoạt hóa, nảy mam va sinh trưởng [4]

1.2.5 Sức đề kháng của bào tử

Bào tử vi khuân có sức đề kháng cao đối với các yếu tô vật lý và hoá học

như: nhiệt độ, hóa chất, dung môi, bức xạ Nguyên nhân là đo:

e_ Nước trong bảo tử phần lớn ở trạng thái liên kết, do đó không có

khả năng làm biến tính protein khi tăng nhiệt độ

e _ Do bào tử có lượng lớn ion CaŸ” và acid dipicolinic, protein của bào tử kết hợp với canxi dipicolinat thành một phức chất có tính chất ôn định cao

đối với nhiệt độ

e_ Các cnzym và các hoạt chất sinh học khác chứa trong bảo tử đều

tồn tại dưới dạng không hoạt động, hạn chế sự trao đôi chất của bào tử đối với

tế bảo bên ngoài

e_ Cấu trúc có nhiều màng bao bọc và tính ít thâm thấu của các lớp mang làm cho các chất hoá học và chất sát trùng khó có thê tác động tới bảo

Trang 16

1.2.6 Các yêu tố ảnh hưởng tới sự hình thành bào tử

Sự hình thành bảo tử từ tế bào sinh dưỡng được kích thích bởi nhiều

yếu tô khác nhau Ngay cả trong môi trường nuôi dưỡng vi sinh vật thì sự

giảm nồng độ các chất dinh dưỡng trong môi trường (đặc biệt là cacbon, nitơ,

phospho ), hoặc sự thay đôi về nhiệt độ và pH cũng ảnh hưởng tới thời điểm

và thời gian hình thành bảo tử của vi khuẩn [11], [22] Một số báo cáo đưa ra

khoảng pH tối ưu để hình thành nhiều bào tử nhất của vi khuẩn Ö subfilis là từ 6 — 8 [7] Ngoài ra các thành phần của môi trường cũng có ảnh hưởng tới

sự hình thành bào tử của vi khuẩn đặc biệt là sự có mặt của ion Mn”” lon

Mn”” ở mức độ thấp sẽ cần thiết cho sự tăng trưởng và trao đôi chất của vi

khuẩn và trực khuân cần nhiều Mn”” hơn cho sự hình thành các bào tử kháng

nhiệt vì khi đó, Mn”” sẽ bị oxy hóa thành MnO; bám trên bê mặt bào tử [6],

[8], [19]

1.3 Giới thiệu về Bacillus clausii

1.3.1 Đặc điểm sinh li hinh thai cia Bacillus clausii > Đặc điểm phân loại:

Bacillus clausii thuộc: Bộ: Eubacteriales Ho: Bacillaceae Chi: Bacillus Loai: Bacillus clausii > Đặc điểm phân bố:

Bacillus clausii phân bố ở nhiều nơi nhưng chủ yếu là trong đất, có thê

la dat vuon (B clausii KSM- K16, B clausii DSM 8716, ATCC 31084 ),

hoặc dat sét (B clausii DSM 9784 ) Ngoai ra co thé tim thay B clausii 6 nước (Ö clzusii MB9 được phân lập từ mẫu nước vùng ven biển phía đông

Trang 17

> Đặc điểm hình thái

Bacillus clausii có hình que đứng đơn lẻ hoặc kết thành chuỗi, là vi

khuân Gram dương, có khả năng di động, hình thành bào tử có hình bầu dục

B clausii có kích thước chiều rộng 1-2um, chiều đài 5um [23]

> Điều kiện nuôi cây

e_ Nhu cầu oxy: Ö cizusii là vi khuẩn hiểu khí do đó trong quá trình nuôi cây cần có sự cấp khí

e Về nhiệt độ: nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là từ 15 — 50°C Mỗi chủng có nhiệt độ tôi ưu riêng như: chủng Ö c/zusii DSM 8716 có nhiệt độ tôi ưu là

30°C, ching B clausii KSM-K16 c6 nhiét d6 t6i uu 14 40°C, B clausii ATCC

31084 có nhiệt độ tôi wu 14 37°C [24], [25]

e Về pH: khoảng pH nuôi cấy thích hợp là từ 7 — 10,5 Chung B

clausii KSM-K]16 có pH tôi ưu là 9,0 [24]

e Về dinh dưỡng, Ö cizusii có thê sử dụng nhiều nguồn cacbohydrat

khác nhau như: glucose, galactose, mannose, sorbitol, 2- ketogluconat ;

nguồn nitơ, phospho, các nguyên tổ vi lượng > Đặc điểm sinh hóa

Vi khuan B clausii cé kha nang thuy phan duoc casein, gelatin va tinh bột, nhưng không thủy phân được pullulan, Tween 20, 40 hoặc 60 Cho phan ứng oxidase, catalase duong tính, khử nritrat thành mtrit [17]

1.3.2 Ứng dụng của Bacilius clausii

B clausii có hai ứng dụng quan trọng đó là: sản xuất enzym và sản xuất ché pham probiotic

Trang 18

10

Protease 14 enzym quan trọng, chiếm gần 60% tổng doanh số các enzym trên thế giới Protease có ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau như

chất tây rửa, công nghiệp thuộc da, thực phẩm Protease cũng có thể được

sử dụng với mục đích thủy phân protemn dạng sợi như sừng, lông và tóc [9], [18], [24] > Sản xuất chế phâm probiotic từ bào tử B clausii Enterogermina’y Hình 1.4: Ché pham Enterogermina

Bào tử Ö clausii được sử dụng trong sản phẩm Enterogermina (Sanofi - Aventis) — một chế phẩm probiotic có tác dụng hữu hiệu trong điều trị tiêu chảy ở trẻ em Enterogermina chứa bào tử vi khuẩn Ö c/zwsii đưới 2 đạng: dạng huyền dịch trong ống nhựa (2 tý bảo tử trong 5ml) và dạng viên nang (2 tỷ bảo tử trong ] viên nang) Enterogermina được chỉ định trong các trường hợp:

e_ Điều trị và phòng ngừa rối loạn khuẩn chí đường ruột và bệnh lý kém hấp thu vitamin nội sinh

e_ Điều trị hỗ trợ để phục hồi hệ khuẩn chí đường ruột bị ảnh hưởng khi

Trang 19

11

e R6i loan tiéu héa cap và mãn tính ở trẻ em do nhiễm độc hoặc rối loạn

khuẩn chí đường ruột và kém hấp thu vitamin

B clausii có khả năng kháng kháng sinh, do đó khi sử dụng kháng sinh nên uống chế phẩm xen kẽ với khoảng thời gian dùng kháng sinh Chế phẩm sử dụng dạng bào tử vi khuẩn nên có nhiều ưu điểm (như đã nêu ở mục I.1.2)

Chế phẩm Enterogermna chứa bốn loài Ư clzusii, mỗi lồi kháng một

số loại kháng sinh nhất định: O/C kháng chloramphenicol, N/R khang novobiocin va rifampicin, T khang tetracycline, SIN khang streptomycin va neomycin [15]

Ngoài Enterogermina chứa bào tử B clausii con mét sé ché pham khác

chua B clausii nhu: Progemila, Erceflora, Bazivic, Probacin, Enterum

Trang 20

12

CHUONG 2 NGUYEN LIEU, HOA CHAT, THIET BI VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU

2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất > Các hóa chất sử dụng: Bang 2.1: Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu Hóa chất Xuất xứ

Hóa chat sir dung pha môi trường

Natri clorid Trung Quôc

Pepton Trung Quôc Cao thịt Trung Quôc

Thạch bột Việt Nam

Mangan sulfat Trung Quốc

Trang 21

13 2.1.2 Máy móc, thiết bị Bang 2.2: Các máy móc, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu Thiết bị Xuất xứ Tủ cây Bioair (Italy)

May ly tam Rotofix (Đức)

Nôi hâp ALP (Nhật)

Tủ lạnh Toshiba (Nhật)

Tủ âm Memmert (Duc)

Tu say Memmert (Đức) Tủ lắc Bioshake (Đức)

Máy vortex IKA (Đức)

Lò vi sóng Daewoo (Han Quéc) Nôi cách thủy Trung Quôc

Trang 22

14

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Khảo sát khả năng hình thành bào tử B clausii trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau

2.2.1.1 Khả năng hình thành bào tử khi nuôi cây ở điều kiện tự nhiên

2.2.1.2 Khả năng hình thành bảo tử khi xử lý nhiệt sinh khối (đun cách

thủy 100”C/1h)

2.2.2 Khảo sát ảnh hướng của ion mangan đến sự hình thành bào tử 2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Hoạt hóa giống từ chế phẩm Enterogermina

Pha 100ml môi trường canh thang (MITI) trong bình nón dung tích 250ml, đậy bằng nút bông không thâm nước, hấp tiệt trùng ở 113°C trong 20 phút, để nguội Tiến hành cấy giống Ö cizusii từ chế phẩm vào bình nón trong tủ cây vô trùng Nuôi cấy trong máy lắc ở 37°C, 110 vòng/phút trong 24h

Sau 24h, vi khuẩn phát triển làm đục môi trường

2.3.2 Giữ giỗng trên thạch nghiêng

Pha môi trường canh thang thạch (MT2), đun sôi cho đồng nhất các

thành phần trong môi trường, chia ra các ống nghiệm, mỗi ống 6ml, nút kín,

hấp tiệt trùng ở 113°C trong 20 phút Để nguội bớt rồi đặt nghiêng Dùng que cây cây giống trong bình đã hoạt hóa giống lên thạch nghiêng theo hình ziczac trong tủ cây vô trùng, để trong tủ ấm 37°C, trong khoảng 48h Sau khi khuẩn lạc mọc thì cất giống vào tủ lạnh

Định kỳ 2 tháng cây truyền giống nhằm giữ hoạt tính vi khuẩn

2.3.3 Chuẩn bị dịch nhân giống

Trang 23

15

ống nghiệm chứa giống vào môi trường Để trong máy lắc 110 vòng/phút ở 37°C trong 24h

Cay 10ml dịch nhân giống vào 100ml môi trường MTI1 đã chuẩn bị, đem lắc ở 37C, 110 vòng/phút trong máy lắc Sau khoảng thời gian xác định lây mâu

2.3.4 Phương pháp thu bào tử

2.3.4.1 Phá vé mang té bao bang lysozyme

Ly tâm dịch sau khi lên men, thu căn (5000 vòng/phút trong 10 - 15 phút)

Căn được hòa trong 10ml dung dịch đệm phosphat pH 7,6, thêm khoảng

15 - 20ml dung dich lysozyme (1 mg/ml), u 6 37°C trong 30 phút để phá vỡ vỏ bọc tế bảo, giải phóng bảo tử

Ly tâm dịch thu cắn (tốc độ 6000 vòng/phút trong 10 - 15 phút)

Hòa căn trong dung dịch KCI IM để loại vỏ tế bào, ly tâm dịch thu cắn (6000 vòng/phút trong 10 - 15 phút)

Tiếp tục hòa cắn trong dung dich NaCl 1M để loại hoàn toàn vỏ tế bảo, ly

tâm dịch thu căn (6000 vòng/phút trong 10 - 15 phút)

Thu căn và rửa bằng nước cất 3 lần thu được bảo tử

Lượng bào tử được xác định bằng phương pháp cân hoặc đo độ đục hoặc

đếm số lượng bào tử [16]

2.3.4.2 Xử lí bằng nhiệt

Dịch nuôi cấy sẽ được đun cách thủy ở 100°C trong 1h để diệt hoàn toàn

dạng sinh đưỡng và tạo điều kiện đề bảo tử hình thành

Sau đó xác định lượng bào tử thu được bằng phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc hoặc xử lí bằng Iysozyme như trên rồi cân lượng bảo tử [3]

2.3.5 Phương pháp nhuộm màu bào tứ: theo Ôgietska

Trang 24

16

Mang bao tir: day, chắc, chứa nhiều lipid khó bắt màu nên phải xử lý

đề tế bảo chất của bào tử dễ bắt màu với nhiệt và acid Nhuộm màu cả tế bào chất của bào tử và tế bảo bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh Tây màu tế bào chất của tế bào đi và nhuộm bằng thuốc nhuộm màu bằng thuốc nhuộm

bồ sung Nhờ đó tế bào chất bào tử và tế bào chất tế bảo có màu phân biệt Tiến hành:

- Làm tiêu bản vết bôi và để vết bôi khô tự nhiên

- Nhỏ vài giọt HCI 0,53% lên vết bôi, hơ nóng trên ngọn đèn côn cho bốc

hơi, giữ 2 phút rồi rửa nước cất

- Đặt lên vết bôi miếng giấy lọc, rồi nhỏ dung dịch fuchsin Ziehl, hơ nóng

cho đến khi bốc hơi, nếu thuốc nhuộm cạn phải bô sung ngay và giữ trong 5 phút

- Bỏ giấy ra và rửa vết bôi lại bằng nước cất

- Tẩy màu bằng cách nhúng phiến kính vào dung dịch H;SO¿x 1% trong 2 phút

- Rửa vết bôi bằng nước cất

- Nhuộm vết bôi bằng xanh methylen Loeffler trong 5 - 15 phút

- Rửa nước cất, để khô tự nhiên vết bôi

- Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính dầu: bào tử màu đỏ, tế bào màu

xanh [2|

2.3.6 Phương pháp xác định thời điểm tạo bào tử của vi khuẩn

s% Trong môi trường lỏng:

Chuẩn bị môi trường lên men MTI, hấp tiệt trùng ở 113C trong 20 phút Cây dịch nhân giống Ö c/zwsii vào, nuôi cây trong máy lắc ở 37C, 110

Trang 25

17

điều kiện tự nhiên Đồng thời, lẫy mẫu đem xử lí nhiệt rồi nhuộm tiêu bản theo Ôgietska xác định thời điểm xuất hiện bảo tử trong điều kiện xứ lí nhiệt

s% Trong môi trường đặc

Chuẩn bị môi trường thạch thường (MT2) và đĩa petri hấp tiệt trùng ở

113”C trong 20 phút đồ vào mỗi đĩa petri 25ml thạch, để nguội đến nhiệt độ

phòng Cây vào mỗi đĩa 1ml dịch nhân giống, ủ trong tủ âm 37C Sau các thời điểm xác định làm tiêu bản theo phương pháp 2.3.5 xác định sự có mặt

của bào tử trong điều kiện tự nhiên và sau khi xử lí bằng nhiệt

2.3.7 Phương pháp xác định lượng bào tử hình thành theo thời gian s% Trong môi trường lỏng:

Chuẩn bị môi trường lên men MTI, hấp tiệt trùng ở 113”C trong 20

phút Cây dịch nhân giống Ö cizusi, nuôi cấy trong máy lắc ở 37C, 110

vòng/phút Tại các thời điểm xác định thu dịch nuôi cây xử lí theo phương

pháp 2.3.4.1 rồi xác định khối lượng bào tử hình thành khi nuôi cấy tự nhiên, xử lí nhiệt đề thu lượng bào tử tạo thành tại các thời điểm khác nhau bằng

phương pháp cân

s% Trong môi trường đặc:

Chuẩn bị môi trường thạch thường (MT2) và đĩa petri hấp tiệt trùng ở 113°C trong 20 phút, đỗ vào mỗi đĩa petri 25ml thạch Để nguội đến nhiệt độ phòng, cây vào mỗi đĩa Iml dịch nhân giống, ủ trong tủ ấm 37C Sau các

khoảng thời gian xác định thu sinh khối, hòa vào nước cất vô trùng Sinh khối

được xử lí bằng lysozyme đề xác định lượng bào tử hình thành bằng phương pháp cân

Tiến hành tương tự, sinh khối được xử lí nhiệt, phá vỡ vỏ bọc tế bào băng lysozyme để xác định lượng bào tử hình thành khi xử lí nhiệt

Trang 26

18

Chuẩn bị 50ml môi trường canh thang (MT1) chứa MnSO¿ với nông độ 10” M trong bình nón 250ml Dem hap tiệt trùng ở 113”C trong 20 phút, cây 5ml dịch nhân giống, nuôi cây ở 37C trong máy lắc 110 vòng/phút Xác định

thời điểm hình thành bào tử và thời điểm thu bảo tử lớn nhất tương tự như khi

nuôi cây không có ion mangan

Trang 27

19

Chương 3 KẾT QUÁ VA BAN LUẬN

3.1 Khảo sát khả năng hình thành bào tử B clausii trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau

Cũng như các loài vi sinh vật khác trong tự nhiên, quá trình sinh trưởng của Ö clzwusii diễn ra theo các pha: pha tiềm tảng (pha lag), pha lũy thừa (pha log), pha cân bằng, pha suy vong Trong quá trình nuôi cấy nồng độ các chất dinh dưỡng giảm dân theo thời gian, đồng thời có thê tạo ra nhiều chất có hại

cho sự phát triển Bào tử vi khuẩn Ö clzusii có thể xuất hiện sớm hoặc muộn

phụ thuộc nhiều vào điều kiện nuôi cấy (môi trường nuôi cấy lỏng hay đặc,

nhiệt độ nuôi cấy, điều kiện cấp khí ) và phương pháp thu bảo tử (xử lí nhiệt

hay không xử lí) Việc khảo sát các yếu tổ ảnh hưởng đến quá trình hình

thành bào tử sẽ góp phân xác định điều kiện nuôi cấy, thời điểm và phương

thức thu bảo tử, góp phân tiết kiệm chi phí nuôi cấy Các yếu tô ảnh hưởng đến quá trình hình thành bảo tử được khảo sát ở nghiên cứu này gồm:

e_ Điều kiện nuôi cấy (môi trường đặc hay lỏng)

e Thời điểm thu bào tử

e Phương pháp xử lí thu bào tử

3.1.1 Kha nang hinh thanh bao tv khi nuoi cay ở điều kiện tự nhiên

B clausii thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí, vì vậy phương pháp nuôi cấy được lựa chọn là nuôi cây bề mặt trên môi trường đặc trong các petri và trong môi trường lỏng ở máy lắc

$ Äục tiêu: Xác định thời điểm xuất hiện bảo tử và thời gian hình thành

nhiều bảo tử nhất trong 2 môi trường lỏng và đặc

% Tiến hành:

Trong môi trường lỏng: Nuôi cấy Ö cizusii trong bình nón 250ml chứa 50ml môi trường canh thang ở 37C trong máy lắc 110 vòng/phút Sau

Trang 28

20

pháp nêu ở mục 2.3.5 xác định sự xuất hiện bào tử Đồng thời, lẫy mẫu xử lí

bang lysozyme theo phương pháp ở mục 2.3.4.1 xác định lượng bào tử tạo thành theo thời gian bằng cách cân

Trong môi trường đặc: Nuôi Ö c/z„si¡ trong 25ml thạch trên petri ở

tủ âm 37C Tại các thời điểm 1, 2, 3, 4 ngày làm tiêu bản xác định sự xuất

hiện của bào tử và lượng bào tử tạo thành theo thời gian như môi trường lỏng $%* KẾ quả:

3.1.1.1 Trong môi trường lỏng

> Thời điểm xuất hiện bào tử

Dưới kính hiển vi sau 24h và 48h thấy chỉ có tế bào màu xanh, đôi khi

nỗi với nhau thành sợi dài, chưa thay có sự xuất hiện của bào tử Sau (72h) thì bat dau thay sy xuat hién cua bào tử màu đỏ và một sô tê bào xanh có bào tử

bên trong, tê bào màu xanh vẫn chiêm chủ yêu

Hình 3.1: Hinh anh B clausii Hinh 3.2: Hinh anh B clausii

trong môi trwong long sau 48h trong môi trường lỏng sau 72h

Như vậy, khi nuôi cây trong môi trường lỏng, trong 48h đầu nồng độ các chất dinh đưỡng và oxy cung cấp cao nên tế bảo vi khuân Ö e/zusii phát triển mạnh, tế bảo phân chia đề tăng số lượng, đến ngày thứ 3 lượng dinh dưỡng và oxy giảm dân tế bào sinh dưỡng bắt đầu có sự biến đổi thành dạng

Trang 29

21

> Thoi diém thu duoc nhiéu bao tir nhat

Lugng bao tu tao thanh dugc danh gia qua tuong quan giira luong sinh khối và bảo tử tạo thành trong môi trường nuôi cấy lỏng theo thời gian (bảng 3.1)

Bảng 3.1: Tương quan giữa lượng bào tử và sinh khối khi nuôi cây

trong môi trường lóng

Lượng sinh | Lượng bào L ?⁄% bào tử hình thành

khôi (mg) tử (mg) so với sinh khôi T (ngày) 1 530,0 - - 2 560,0 - - 3 655,2 40,82 7,36 4 575,8 295,7 51,35 5 467,8 216,6 46,30 6 454,1 195,9 43,14 7 241,7 61,7 25,53 (-) không phát hiện bảo tử š B bào tử b 2 600 { = ra a = sin 01 sao EERE aE a § 0=^” = = =] — 2 yo o1 >) ,— 58 Đ 5) E : 3 4 5 —_ & , 6 thời gian (ngày)

Trang 30

22

Nhận xét:

Các số liệu trong bảng 3.1 và biểu đồ ở hình 3.3 cho thấy lượng sinh

khối đạt cực đại sau 3 ngày nuôi cây (655,2 mg), từ ngày thứ 4 lượng sinh

khối giảm dần Mặt khác, ở thời điểm 3 ngày bảo tử bắt đấu xuất hiện với

lượng nhỏ (40,82 mg), 4 ngày là thời điểm lượng bào tử tạo thành lớn nhất (295,7 mg), chiếm 51,35% so với tổng lượng sinh khối, sau đó lượng bảo tử giảm dân do trong môi trường lỏng lượng dinh dưỡng vẫn còn nhiều nên một số bào tử có thể nảy mâm trở lại dạng tế bảo sinh dưỡng

Kết quả trên phù hợp với nghiên cứu của Sharpe E S và Rhodes R A

[20], cho thấy bào tử trưởng thành xuất hiện sau 3 ngảy nuôi cây trong môi

trường lỏng do khi đó nồng độ chất dinh dưỡng giảm làm cho tỉ lệ phân chia

tế bào giảm xuống, tế bảo sinh dưỡng sẽ chuyên thành dạng bảo tử Theo kết

quả nghiên cứu của chúng tôi, lượng bào tử B clausii sau 4 ngày nuôi cây đạt giá trị cao nhất, chiếm 51,35% so với tổng lượng sinh khối Kết quả này gần với công bố của Donnellan J E và cộng sự: sau 4 ngày nuôi cấy B subtilis có

60 — 80% tế bào ở dạng sinh dưỡng chuyên thành dạng bảo tử [11]

3.1.1.2 Trong môi trường đặc

Nuôi cấy trong môi trường đặc chỉ thích hợp với vi khuẩn hiếu khí, vi

sinh vật chỉ phát triển trên bề mặt thạch Khi nuôi cây bề mặt, lượng dinh

dưỡng và nồng độ oxy ít hơn so với nuôi cây chìm nên khả năng hình thành và lượng bào tử tạo ra cũng không giống nhau

> Thời điểm xuất hiện bào tử:

Sau 24h trên vi trường kính hiến vi thấy: chủ yếu vẫn là tế bào màu

Trang 31

23 ros Ss ’ ¥; eta ~~ Ẻ , “Ắ ,® ence 2 St ree I * ~_ eet — ` : SỐ _—“<" — > “# os * > - ~ “~~ “ <= - ~.F - cx a“ X — Zs ` mm ` "và ae 4 = <= r1? 4n Seo - CS —— 3 = 4 -^~ de -

Hình 3.4: Hình ánh B cizwsii trong môi trường đặc sau 96h nuôi cấy

> Thời điểm thu được nhiều bào tử nhất

Lượng sinh khối và bào tử tạo thành theo thời gian nuôi cây được thê hiện trong bảng 3.2

Bang 3.2: Tương quan giữa lượng sinh khỗi và bào tử Ö clzusii khi nuôi cây trong môi trường đặc

Lượng sinh Lượng bào tử | % bào tử hình thành

Trang 32

24 E bào tử 600 ¬ 8 sinh khối lượng sinh khối và bào tir (mg) or ˆ — | / a 4 thời gian (ngày)

Hình 3.5: Biểu đồ tương quan giữa lượng bào tử và sinh khối khi nuôi cấy trong môi trường đặc

Kết quá (bảng 3.2) cho thấy, lượng sinh khối tạo thành đạt giá trị cao nhất sau 3 ngày nuôi cấy (415,5 mg/1 petri), sau đó giảm dần Lượng bào tử cũng đạt cực đại vào ngảy thứ 3 (219,4 mg/1 petri) và giảm dân Tuy nhiên, khi so sánh tương quan giữa lượng sinh khối và lượng bào tử trong môi trường nuôi cây đặc, kết quả cho thấy khác với nuôi cây trong môi trường

lỏng, trong môi trường đặc lượng bào tử tạo thành ở ngày thứ 3 chỉ chiếm

51,72% so với tông lượng sinh khối, nhưng đến ngày thứ 7 chiếm 83,74% Kết quả trên có thê được giải thích như sau: Khi nuôi cấy bề mặt, trong 24h đầu sự tiếp xúc giữa Ö clzusii với môi trường dinh dưỡng và nồng độ

oxy lớn nên vi khuân sẽ phát triển mạnh mẽ về số lượng Sau 24h, những tế

bào ở phía đưới tiếp xúc được với môi trường dinh dưỡng, nhưng nông độ oxy lại không cao, còn những tế bảo ở trên được cung cấp oxy nhưng lại

không được tiếp xúc với dinh dưỡng, do đó sự phân chia tế bảo vi khuẩn Ö

clausii giảm xuống dẫn đến pha logarit và cân bằng của vi khuẩn rút ngăn lại

và tế bảo nhanh chóng tạo bảo tử

Như vậy, khi nuôi cấy trên môi trường đặc, lượng bảo tử hình thành

Trang 33

25

“+ So sánh khá năng sinh bào tử trong 2 điều kiện nuôi cấy

> Về thời điểm xuất hiện bào tử: Khi so sánh thời điểm xuất hiện bào tử cuả

B clausii nuôi cây ở 2 điều kiện lỏng và đặc, kết quả cho thây có sự khác biệt

rõ rệt Trong môi trường đặc bào tử xuất hiện sớm (sau 24h đã đạt > 40%)

Trong khi đó ở môi trường lỏng bào tử xuất hiện chậm hơn (sau 72h đạt 7,36%) Điều này chứng tỏ khi được nuôi cấy trong môi trường lỏng tế bảo được cung cấp đầy đủ về dinh dưỡng, oxy nhiều hơn nên pha logarit và cân

bằng kéo dải hơn, bảo tử hình thành chậm hơn Tại môi trường đặc, vi khuẩn

chỉ tiếp xúc với nguồn dinh dưỡng bề mặt do đó pha logarit và cân bằng bị

ngắn lại Như vậy, chất đinh dưỡng ít hơn sẽ kích thích tạo nhiều bảo tử hơn và sớm hơn > Thời điểm thu được nhiều bảo tử nhất: 90 80 70 60 = long 50 -#-đặc 40 30 20 10 0 %obào tử hình thành 1 2 3 4 5 6 ?

thời gian (ngày)

Hình 3.6: So sánh sự hình thành bào tử trong môi trường lóng và đặc khi chưa xử lí

Đồ thị biểu diễn tương quan giữa % lượng bảo tử hình thành so với

Trang 34

26

giảm dần Điều đó chứng tỏ khi nuôi cấy trong môi trường đặc thì lượng bào tử 8 clausii được tạo ra nhanh hơn và nhiều hơn so với môi trường lỏng

Hơn nữa khi nuôi cây B clausii trong môi trường đặc, phương pháp thu bảo tử tương đối đơn giản Tuy nhiên khi nuôi cấy trong môi trường đặc năng

suất của quá trình lên men không cao do không tận dụng được hết chất dinh dưỡng mà chỉ lên men bề mặt, tốn điện tích hơn so với lên men trong môi

trường lỏng Lên men bề mặt khó thu hết bào tử B cjzwsi do phải gạt lớp

sinh khối trên bề mặt thạch sau đó mới đem xử lí thu bảo tử nên một lượng

sinh khối chứa bảo tử trên thạch vẫn chưa được thu hết Khi lên men trong môi trường lỏng, quá trình thu bảo tử chỉ cần ly tâm thu lẫy sinh khối và tiếp tục xử lí thu bào tử Tuy nhiên, nếu tính theo thời gian lên men thì nuôi cây bề mặt tỏ ra hiệu quả hơn vì chỉ sau l ngày được trên 40%, còn ở môi trường lỏng sau 4 ngày được trên 50% Mặt khác, tùy thuộc vào phương pháp xử lí thu bảo tử mà lượng bào tử thu được là khác nhau Do đó các nghiên cứu tiếp theo sẽ khảo sát ảnh hưởng của phương pháp xử lí nhiệt đến sự hình thành bào tử B clausii

3.1.2 Khả năng hình thành bào tử khi xử lý nhiệt sinh khỗi

Bào tử của vi khuân có sức đề kháng với nhiều yếu tố, trong đó có nhiệt độ Ö clausii khi ở dạng tế bào sinh dưỡng sẽ bị chết hoặc sẽ chuyên sang

dạng bào tử khi có tác động của nhiệt độ, nhưng với dạng bào tử hay tế bảo

sinh đưỡng đang có sự hình thành bào tử thì vẫn có thể chịu được tác động

của nhiệt Vì vậy, việc xử lí sinh khối để thu được dạng bào tử nhiều hơn sẽ

giúp giảm bớt thời gian nuôi cấy, chi phí trong quá trình tạo sản phẩm dang bào tử

$ Mục tiêu: Xác định thời điểm xuất hiện bao tử và thu được nhiều bào tử Ư

clausii nhất trong mơi trường lỏng và đặc khi xử lí nhiệt sinh khối

Trang 35

27

Trong môi trường lỏng: Ö c/2wsi được nuôi cây trong 50ml MTI, ở

37C, 100 vòng/phút, sau các thời điểm 1, 2, 3, 4 ngày, lấy mẫu đun cách thủy ở 100C trong 1h, làm tiêu bản xác định thời điểm xuất hiện bào tử theo

phương pháp nêu ở mục 2.3.5 Đồng thời, lấy mẫu xử lí bằng lysozyme theo phương pháp ở mục 2.3.4.1 xác định lượng bào tử tạo thành theo thời gian

Trong môi trường đặc: Nuôi cấy B clausii trong 25ml môi trường đặc

MT 2 trong đĩa petri, ủ ở 37C Sau I, 2, 3 ngày, thu sinh khối xử lí nhiệt bằng cách đun cách thủy ở 100°C/1h, xác định thời điểm xuất hiện bào tử và

xác định lượng bảo tử tạo thành theo thời gian tương tự môi trường lỏng s* Kết quả thu được như sau:

3.1.2.1 Trong môi trường lông

> Thời điểm xuất hiện bào tử:

Khi nuôi cấy hiếu khí trong môi trường lỏng, sau 24h hầu như không phát hiện bào tử dù qua xử lí nhiệt, sau 48h nuôi cấy sinh khối được xử lí

nhiệt thể hiện nhiều bào tử màu đỏ, các tế bào chứa chấm nhỏ bên trong màu đỏ là tương đối nhiều Trong khi đó, khi nuôi cấy lỏng không có xử lí nhiệt sinh khối, sau 24h và 48h chưa thấy có tế bào có chấm đỏ

Như vậy, khi có tác động của nhiệt độ, một phan té bao sinh dưỡng B clausii chuyén thành dạng bào tử, do đó so với khi không có tác động nhiệt,

bao tr B clausii xuat hiện sớm hơn (48h so với 72h)

> Thời điểm thu được nhiều bảo tử nhất:

Lượng sinh khối và bào tử tạo ra được thê hiện trong bảng 3.3

Bảng 3.3: Tương quan giữa lượng bào tử và sinh khối trong môi trường lỏng khi xử lí nhiệt

Lượng sinh Lượng bào | ? bào tứ hình thành

khôi (mg) tử (mg) so với sinh khôi

T (ngay)

1 530,1 - -

Trang 36

28 2 591,2 340,9 57,66 3 497,6 306,9 62,22 4 311,0 410,0 80,23 5 411,8 273,7 66,46 6 357,0 239,5 67,09 7 289,7 191,7 66,17 5 E bào tử a 600 ¬ E sinh khối là ‘ 42 am | Be Ễ 1 2 5 ; —— /

thời gian (ngày)

Hình 3.7: Biểu đồ tương quan giữa lượng bào tử và sinh khối khi

nuôi cấy trong môi trường lỏng có xử lí nhiệt

Bảng 3.3 cho thấy, sau khi xử lí sinh khối bằng nhiệt, lượng bào tử tạo

ra vào ngày thứ 4 đạt giá trị cao nhất (410,0 mg) chiếm 80,23% so với tổng lượng sinh khối Sau ngày thứ 4 lượng sinh khối vả bảo tử giảm dân

Bảng 3.1 và 3.3 cho thấy, theo thời gian nuôi cây khi có xử lí nhiệt khối lượng bào tử tạo ra (phần trăm bào tử hình thành) đều nhiều hơn so với điều kiện tự nhiên tại cùng thời điểm Điều đó chứng tỏ, việc xử lí nhiệt đây quá

trình tạo bào tử của vi khuân nhanh hơn, giúp giảm bớt thời gian nuôi cấy và

có thê giảm chi phí khi sản xuất

Trang 37

29

Trên vi trường bào tử màu đỏ xuất hiện tương đối nhiều, tế bào màu xanh và tế bào mang bảo tử đỏ vẫn chiếm lượng lớn sau 24h

> Thời điểm thu được nhiều bào tử nhất: tương quan giữa lượng bảo tử tạo

thành theo thời gian được thể hiện trong bảng 3.4

Kết quả cho thấy, phần trăm lượng bảo tử tạo thành tăng dân theo thời gian, tới ngày thứ 7 đạt 87,20% Tuy nhiên, ngày thứ 3 lượng sinh khối thu

được là lớn nhất, bào tử cũng thu được lớn nhất (265,6 mg)

Bảng 3.4: Tương quan giữa lượng bào tử và sinh khối trong môi trường đặc khi xử lí nhiệt

Lượng sinh | Lượng bào | ?% bào tử hình thành

T (Ngày khôi (mg) tử (mg) so với sinh khôi l 267,6 125,2 45,26 2 320,0 165,9 51,84 3 412,4 265,6 64,40 4 251.4 160.2 63,73 5 242,6 161,5 66,57 6 288,3 207,8 72,08 7 173,5 151,3 87,20 <S 600 # bào tử a = sinh khối re 300 4 ee - 8 700 - % o =< + Ễ 7

Trang 38

30

Từ kết quả ở báng 3.4 và bảng 3.2 thấy rằng lượng bào tử B clausii tao

thành sau khi nuôi cấy bề mặt môi trường đặc khi xử lí nhiệt đều lớn hơn khi

nuôi cấy từ trong môi trường đặc không xử lí nhiệt Phần trăm lượng bảo tử tạo thành khi xử lí nhiệt đều cao hơn khi không xử lí nhiệt, tuy nhiên sự chênh lệch đó là không lớn Sau 7 ngày khi nuôi cấy trong môi trường đặc có xử lí

đạt 87,20%, khi không xử lí nhiệt đạt 83,74% Sau 7 ngày khi nuôi cây trong

môi trường đặc, có trên 80% tế bào sinh dưỡng đã chuyền thành bào tử, lượng

tế bào sinh đưỡng trong sinh khối còn lại không nhiều nên khi có tác động của nhiệt độ vào thì lượng tế bảo chuyên thành dạng bào tử là không nhiều Do đó, sau khi nuôi cẫy 7 ngày trong môi trường đặc khi có xử lí nhiệt lượng bảo tử tăng không nhiều, từ 83,74% lên 87,20%

s% So sánh môi trường đặc và lông khi xử lí nhiệt:

Khi so sánh khả năng hình thành bảo tử trong 2 điều kiện nuôi cây đặc

và lỏng thì thấy:

> Thời điểm hình thành bào tử:

Sau khi xử lí nhiệt sinh khối, thời điểm xuất hiện bào tử trong môi

trường đặc là 24h, trong môi trường lỏng sau 48h (2 ngày) Như vậy, khi xử lí nhiệt thì nuôi cấy trong môi trường đặc bảo tử sẽ xuất hiện sớm hon trong môi trường lỏng

> Thời điểm thu bảo tử lớn nhất:

Kết quả ở hình 3.9 cho thấy, thời điêm lượng bào tử hình thành lớn nhất

Trang 39

3l 100 & 80 = ~~ â ô= 60 25 :T 40 » 20 i, ` thời gian (ngày) 0 1 2 3 4 5 6 ?

Hình 3.9: So sánh sự hình thành bào tử khi nuôi cây trong 2 môi trường đặc và lông khi có xứ lí nhiệt

Như vậy, sau khi thu sinh khối và xử lí nhiệt kết quả cho thấy: trong môi trường đặc lượng bào tử hình thành lớn hơn (87,20%) môi trường lỏng

(80,23%) Tuy nhiên, sự chênh lệch đó là không lớn Như vậy, nếu chọn môi

trường đặc để thu bào tử B clzusii phải nuôi cấy 7 ngày, trong khi đó môi trường lỏng chỉ cần 4 ngày và phải có xử lí nhiệt Nuôi cấy trong 4 ngày sẽ tiết kiệm được chỉ phí nuôi cấy, tăng năng suất

s%* Kết luận:

Từ kết quả ở trên có thể lựa chọn nuôi cây thu bào tử bằng cách nuôi

cây lỏng trong 4 ngày có xử lí nhiệt sinh khối hoặc nuôi cây đặc trong 7 ngày

không xử lí Tuy nhiên, khi nuôi cẫy đặc sẽ tốn ít chi phí về điện năng, thiết

bị so với nuôi cây trong môi trường lỏng Vì vậy, dé thu được bào tử nhanh hơn và nhiều hơn các nghiên cứu tiếp theo sẽ khảo sát ảnh hưởng của ion mangan tới sự hình thành bào tử

3.2 Khảo sát ảnh hướng của ion mangan đến sự hình thành bào tử

Sự hình thành bào tử cua B clausii chiu ảnh hưởng của nhiều yếu tố, có cả yêu tố vật lí như: nhiệt độ nuôi cay, pH cua môi trường, sự cấp khí và

Trang 40

32

clausii Trong các yếu tô đó, sự có mặt của ion mangan là một trong các yếu

tô cần thiết thúc đây quá trình hình thành bào tử của vi khuẩn Ö clawusii Khảo

sát ảnh hưởng của lon mangan tới sự hình thành bào tử được thực hiện trên 2

môi trường: đặc và lỏng với nồng độ 10M

% Mục tiêu: Xác định thời điểm hình thành bào tử và tạo nhiều bảo tử nhất

cua vi khuan B clausii trong môi trường lỏng và đặc khi có mặt Mn””

% Tiến hành:

Trong môi trường lơng: Ni cấy Ư clawusii trong môi trường MTI có

bồ sung MnSO¿ 10M Sau 1, 2, 3 ngày lẫy mẫu làm tiêu bản xác định thời

điểm hình thành bảo tử, đồng thời lây mẫu xử lí thu bảo tử theo phương pháp

nêu ở mục 2.3.4.1 xác định lượng bào tử tạo thành theo thời gian nuôi cấy Trong mơi trường đặc: Ư cizusiử được nuôi cấy trong môi trường

MT2 có bố MnSO¿ 10° M trong dia petri 6 37°C Sau 1, 2, 3 ngày xác định

thời điểm hình thành bào tử và lượng bảo tử tạo thành theo thời gian nuôi cây như môi trường lỏng

s* KẾ quả:

3.2.1 Trong môi trường lông

> Thời điểm xuất hiện bào tử:

Khi quan sát trên vi trường tại thời điểm 24h thấy có bào tử màu đỏ

Trong khi đó trong môi trường lỏng không có 1on mangan, sau 72h bào tử mới xuất hiện Điều đó cho thấy ảnh hưởng tích cực của ion mangan tới sự

hình thành bào tử, kích thích bào tử xuất hiện sớm hơn

> Thời điểm thu nhiều bào tử nhất: lượng sinh khối và bào tử tạo thành theo