CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Khảo sát khả năng hình thành bào tử B. clausii trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau
2ệ2.1 ệ 1. Khả năng hình thành bào tử khi nuôi cấy ở điều kiện tự nhiên.
2ệ2.1 ệ2. Khả năng hình thành bào tử khi xử lý nhiệt sinh khối (đun cách thủy 100°c/lh).
2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của ion mangan đến sự hình thành bào tử 2ể3ẵ Phương pháp nghiên cứu
2ếj Ệi ế Hoạt hóa giống từ chế phẩm Enterogermina
Pha 100ml môi trường canh thang (MT1) trong bình nón dung tích 250ml, đậy bằng nút bông không thấm nước, hấp tiệt trừng ở 113°c trong 20
phút, để nguội. Tiến hành cấy giống B. clausiỉ từ chế phẩm vào bình nón trong tủ cấy vô trùng. Nuôi cấy trong máy lắc ở 37°c, 110 vòng/phút trong 24hắ
Sau 24h, vi khuẩn phát triển làm đục môi trườngắ 2ếj Ệ2ế Giũ1 giống trên thạch nghiêng
Pha môi trường canh thang thạch (MT2), đun sôi cho đồng nhất các thành phần trong môi trường, chia ra các ống nghiệm, mỗi ống 6ml, nút kín, hấp tiệt trùng ở 113°c trong 20 phút. Để nguội bớt rồi đặt nghiêngắ Dừng que cấy cấy giống trong bình đã hoạt hóa giống lên thạch nghiêng theo hình ziczac trong tủ cấy vô trùng, để ữong tủ ấm 37°c, trong khoảng 48hắ Sau khi khuẩn lạc mọc thì cất giống vào tủ lạnhắ
Định kỳ 2 tháng cấy truyền giống nhằm giữ hoạt tính vi khuẩn.
2ếj Ệj ế Chuẩn 6;ề dịch nhân giống
Chuẩn bị 100ml môi trường MT1 trong bình nón dung tích 250ml. Hấp tiệt trùng ở 113°c trong 20 phútệ Để nguội, dùng que cấy cấy khuẩn lạc trong
ống nghiệm chứa giống vào môi trường. Để trong máy lắc 110 vòng/phút ở 37°c trong 24h.
Cấy 10ml dịch nhân giống vào 100ml môi trường MT1 đã chuẩn bị, đem lắc ở 37°c, 110 vòng/phút trong máy lắc. Sau khoảng thời gian xác định lấy mẫu.
2.3.4. Phương pháp thu bào tử
2.3.4.1. Phả vỡ màng tể bào bằng lysozyme
- Ly tâm dịch sau khi lên men, thu cắn (5000 vòng/phút trong 10-1 5 phút).
- Cắn được hòa trong 10ml dung dịch đệm phosphat pH 7,6, thêm khoảng 15 - 20ml dung địch lysozyme (1 mg/ml), ủ ở 37°c trong 30 phút để phá vỡ vỏ bọc tế bào, giải phóng bào tử.
- Ly tâm dịch thu cắn (tốc độ 6000 vòng/phút trong 10-15 phút)
- Hòa cắn trong dung dịch KC1 IM để loại vỏ tế bào, ly tâm dịch thu cắn (6000 vòng/phút trong 10-15 phút).
- Tiếp tục hòa cắn trong dung dịch NaCl IM để loại hoàn toàn vỏ tế bào, ly tâm dịch thu cắn (6000 vòng/phút trong 10-15 phút)
- Thu cắn và rửa bằng nước cất 3 làn thu được bào tửệ
- Lượng bào tử được xác định bằng phương pháp cân hoặc đo độ đục hoặc đếm số lượng bào tử [16].
2.3.4.2. Xử lí bằng nhiệt
- Dịch nuôi cấy sẽ được đun cách thủy ở 100°c trong lh để diệt hoàn toàn dạng sinh dưỡng và tạo điều kiện để bào tử hình thành.
- Sau đó xác định lượng bào tử thu được bằng phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc hoặc xử lí bang lysozyme như trên rồi cân lượng bào tử [3].
2.3.5. Phương pháp nhuộm màu bào tử: theo Ôgietska Nguyên tắc:
Màng bào tử: dày, chắc, chứa nhiều lipid khỏ bắt màu nên phải xử lý để tế bào chất của bào tử dễ bắt màu với nhiệt và acidệ Nhuộm màu cả tế bào chất của bào tử và tế bào bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh. Tẩy màu tế bào chất của tế bào đi và nhuộm bằng thuốc nhuộm màu bằng thuốc nhuộm bổ sung. Nhờ đó tế bào chất bào tử và tế bào chất tế bào có màu phân biệt.
Tiến hành:
- Làm tiêu bản vết bôi và để vết bôi khô tự nhiên.
- Nhỏ vài giọt HC1 0,5% lên vết bôi, hơ nóng trên ngọn đèn cồn cho bốc hoi, giữ 2 phút rồi rửa nước cấtệ
- Đặt lên vết bôi miếng giấy lọc, rồi nhỏ dung dịch fuchsin Ziehl, hơ nóng cho đến khi bốc hơi, nếu thuốc nhuộm cạn phải bổ sung ngay và giữ trong 5 phút.
- Bỏ giấy ra và rửa vết bôi lại bằng nước cất.
- Tẩy màu bằng cách nhúng phiến kính vào dung dịch H2S 0 4 1% trong 2
phútệ
- Rửa vết bôi bằng nước cất.
- Nhuộm vết bôi bằng xanh methylen Loeffler trong 5 - 1 5 phút.
- Rửa nước cất, để khô tự nhiên vết bôi.
- Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính dầu: bào tử màu đỏ, tế bào màu xanh [2]ắ
2.3.6. Phương pháp xác định thời điểm tạo bào tử của Vỉễ khuẩn
❖ Trong môi trường lỏng:
Chuẩn bị môi trường lên men MT1, hấp tiệt trùng ở 113°c trong 20 phút. Cấy dịch nhân giống B. clausỉỉ vào, nuôi cấy trong máy lắc ở 37°c, 110 vòng/phút. Tại các thời điểm khác nhau (1, 2, 3, 4, 5.ệ. ngày) lấy mẫu đem nhuộm tiêu bản theo Ôgietska để xác định thời điểm xuất hiện bào tử trong
điều kiện tự nhiênệ Đồng thời, lấy mẫu đem xử lí nhiệt rồi nhuộm tiêu bản theo Ôgietska xác định thời điểm xuất hiện bào tử trong điều kiện xử lí nhiệt.
❖ Trong môi trường đặc
Chuẩn bị môi trường thạch thường (MT2) và đĩa petri hấp tiệt trùng ở 113°c trong 20 phút đổ vào mỗi đĩa petri 25ml thạch, để nguội đến nhiệt độ phòng. Cấy vào mỗi đĩa lml dịch nhân giống, ủ trong tủ ấm 37°c. Sau các thời điểm xác định làm tiêu bản theo phương pháp 2.3.5 xác định sự có mặt của bào tử trong điều kiện tự nhiên và sau khi xử lí bằng nhiệt.
2.3.7. Phương pháp xác định lượng bào tử hình thành theo thời gian
❖ Trong môi trường lỏng:
Chuẩn bị môi trường lên men MT1, hấp tiệt trùng ở 113°c ữong 20 phútệ Cấy dịch nhân giống B. clausỉi, nuôi cấy trong máy lắc ở 37°c, 110 vòng/phút. Tại các thời điểm xác định thu dịch nuôi cấy xử lí theo phương pháp 2.3.4ệl rồi xác định khối lượng bào tử hình thành khi nuôi cấy tự nhiên, xử lí nhiệt để thu lượng bào tử tạo thành tại các thời điểm khác nhau bằng phương pháp cân.
❖ Trong môi trường đặc:
Chuẩn bị môi trường thạch thường (MT2) và đĩa petri hấp tiệt trừng ở 113°c ữong 20 phút, đổ vào mỗi đĩa petri 25ml thạchắ Để nguội đến nhiệt độ phòng, cấy vào mỗi đĩa lml dịch nhân giống, ủ trong tủ ấm 37°c. Sau các
khoảng thời gian xác định thu sinh khối, hòa vào nước cất vô trùng. Sinh khối được xử lí bằng lysozyme để xác định lượng bào tử hình thành bằng phương pháp cânắ
Tiến hành tương tự, sinh khối được xử lí nhiệt, phá vỡ vỏ bọc tế bào bằng lysozyme để xác định lượng bào tử hình thành khi xử lí nhiệt.
2.3.8. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của Iểơn mangan đến sự hình thành bào tử
Chuẩn bị 50ml môi trường canh thang (MT1) chứa M nS04 với nồng độ 10'5 M trong bình nón 250ml. Đem hấp tiệt trùng ở 113°c trong 20 phút, cấy 5ml dịch nhân giống, nuôi cấy ở 37°c trong máy lắc 110 vòng/phút. Xác định thời điểm hình thảnh bào tử và thời điểm thu bào tử lớn nhất tương tự như khi nuôi cấy không có ion manganệ
Trong môi trường đặc: tiến hành tương tự trong môi trường đặc không có ion mangan như đã nêu ở mục 2ệ3.6 và 2.3.7 và bổ sung MnSƠ4 với nồng độ 10'5 M vào môi trường thạch thường (MT2) trước khi hấp tiệt trùng.