Phân tích các con đường trao đổi chất và nhóm chức năng cũng chỉ ra điều này. Mặt khác phân tích biểu hiện protein của những protein thay đổi thấy rằng một số protein liên quan đến tổng hợp và vận chuyển sắt là giảm điều hòa đáng kể.
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG ĐÁNH DẤU ĐỒNG VỊ ỔN ĐỊNH BẰNG AXIT AMIN TRONG NGHIÊN CỨU PROTEIN CỦA VI KHUẨN GÂY BỆNH THƯƠNG HÀN SALMONELLA ENTERICA TYPHYMURIUM LT2 TrầnTrung Kiên1, Lin Guo2 Trường Đại học Hùng Vương College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan, China TĨM TẮT Chúng tơi sử dụng phương pháp đánh dấu đồng vị trao đổi chất axit amin, sau dựa phân tích so sánh định lượng proteomic chủng Salmonella enterica Typhymurium LT2 đột biến gen rstB với chủng tự nhiên điều kiện không đầy đủ Mg môi trường nuôi cấy SILAC Kết proteomic rằng, protein giảm điều hòa chủng đột biến gen rstB gấp hai lần so với protein tăng điều hòa Phân tích đường trao đổi chất nhóm chức điều Mặt khác phân tích biểu protein protein thay đổi thấy số protein liên quan đến tổng hợp vận chuyển sắt giảm điều hòa đáng kể Từ kết này, chúng tơi dự đoán chủng đột biến gen rstB giảm độc tính Từ khóa: Vi khuẩn thương hàn, Salmonella enterica Typhymurium LT2, phổ khối lượng, đánh dấu đồng vị, proteomic TỔNG QUAN Vi khuẩn gây bệnh thương hàn có tên khoa học Salmonella enterica Typhimurium vi khuẩn Gram âm, chúng nguyên nhân gây nên bệnh thương hàn, viêm dày ruột, nhiễm trùng huyết, chúng có khả đáp ứng cao gây bệnh cho người động vật Salmonella vào thể qua đường miệng thức ăn, nước uống nhiễm khuẩn thích ứng với mơi trường có độ pH thấp dày Proteomic thuật ngữ lĩnh vực nghiên cứu rộng lớn protein đặc biệt cấu trúc chức năng, phát triển khoảng 20 năm trở lại Phương pháp khối phổ (mass spectrometry- MS), kỹ thuật dùng để đo đạc tỷ lệ khối lượng điện tích ion (massto-charge ratio - m/z), dùng thiết bị chuyên dụng khối phổ kế phổ khối lượng MS-dựa proteomics ngày trở thành công cụ mạnh mẽ cần thiết cho nghiên cứu nghiên cứu tương tác protein - protein, sửa đổi sau phiên mã, biểu protein - mối quan hệ với mARN; cho việc tìm nguyên nhân bệnh tật chuẩn đoán; cho việc phát triển dược phẩm Trong vài phương pháp đánh dấu trình trao đổi chất, đánh dấu đồng vị ổn định axit amin nuôi cấy tế bào (Stable Isotope Labeling by Amino acids in cell Culture - SILAC) lên phương pháp đơn giản, xác để biểu protein việc đưa vào đồng vị ổn định tới tất protein tế bào thông qua axit amin, thường lysine and arginine Một quần thể tế bào phát triển môi trường chứa axit amin tự nhiên (SILAC- nhẹ), quần thể khác phát triển môi trường chứa axit amin đánh dấu với đồng vị (khơng phóng xạ) nặng ổn định (SILAC-nặng) Mơi trường chứa arginine đánh dấu với sáu nguyên tử cacbon 13 (13C) thay cho cacbon 12 (12C) Khi tế bào phát triển môi trường này, chúng hợp axit amin nặng tới peptide dẫn đến thay đổi lượng so sánh với peptide tương ứng nhẹ (6 Da trường hợp 118 KHCN (31) - 2014 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG C6-Arg), khơng thay đổi thành phần hóa học khác Các tế bào sau trộn lẫn định lượng proteomic, peptide xuất cặp quang phổ lượng - peptide với lượng thấp chứa axit amin nhẹ peptide với lượng cao chứa axit amin nặng, tương ứng với quần thể tế bào nuôi cấy đánh dấu Căn vào tỷ lệ peptide xác định MS để thấy thay đổi proteome, so sánh mức độ protein liên quan trạng thái tế bào khác 13 Trong nghiên cứu này, thực định lượng protein, tập trung protein thay đổi đáng kể Salmonella enterica Typhimurium LT2 (S.Typhimurium LT2) vi khuẩn thương hàn LT2 điều kiện kích hoạt hệ thống PhoP/PhoQ (ở nồng độ Mg thấp) Dựa kỹ thuật đánh dấu protein, nồng độ tối thiểu Mg sử dụng để đánh dấu đồng vị axit amin nuôi cấy tế bào Tiếp theo sử dụng sắc ký lỏng cao áp - đôi phổ khối lượng (LCMS/MS) - dựa proteomic để thực phân tích so sánh định lượng protein chủng đột biến gen rstB với chủng tự nhiên LT2 Vi khuẩn nuôi cấy điều kiện nồng độ Mg tối thiểu, điều kiện gần giống với môi trường mà vi khuẩn gặp phải đại thực bào [4] Chúng áp dụng thành công với hiệu suất cao kỹ thuật đánh dấu ổn định đồng vị axit amin phương pháp khối phổ, liệu quan sát toàn diện độ phong phú protein chủng đột biến rstB gen so với chủng tự nhiên Từ liệu thu được, chúng tơi phân tích đường trao đổi chất, nhóm chức năng, tăng giảm protein điều hòa Kết thay đổi protein quan tâm xác nhận real-time PCR số biểu kiểu hình ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP 2.1 Chủng vi khuẩn, môi trường nuôi cấy điều kiện phát triển Vi khuẩn sử dụng cho nghiên cứu S.Typhimurium LT2 (vi khuẩn thương hàn chủng LT2) chủng đột biến gen rstB Vi khuẩn nuôi cấy môi trường Luria - Bertani (LB) (10g/l NaCl, 5g/l Yeast extract, 10g/l Tryptone) môi trường tối thiểu N (5mM KCl, 7.5mM (NH4)2SO4, 0.5mM K2SO4, 1mM KH2PO4, 0.1M Tris-base, 38mM glycerol, pH 7.4) Môi trường tối thiểu N-SILAC bổ sung với 10 µM MgCl2 and 40g/L lysine, 40g/L arginine với ligh [13C615N4]-L-arginine heavy [13C615N2]L-lysine Vi khuẩn nuôi cấy điều kiện 37oC, với lắc 9h 2.2 Chuẩn bị mẫu protein phân giải Peptide Chuẩn bị mẫu protein: Vi khuẩn sau nuôi cấy 9h môi trường nuôi cấy SILAC, thu hoạch li tâm với tốc độ 10000g/phút 15 phút 4oC thu cặn, sau làm tan dung dịch chứa 5mM Tris-HCl, 5mM EDTA, pH 7.5 Dịch tế bào sau phá vỡ sóng siêu âm (altrasonication), li tâm loại bỏ mảnh vỡ tế bào lại, dịch chiết protein thô đo phương pháp Bradford trộn theo tỷ lệ 1:1 đồng vị nặng - nhẹ bảo quản -80oC Hình 1: Các bước thực nghiên cứu proteomic vi khuẩn gây bệnh thương hàn KHCN (31) - 2014 119 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG Phân giải peptide: Protein thu từ nuôi cấy SILAC khử, alkyl hóa, thuỷ phân trypsin loại muối (Hình 1) Sau peptide phân tách sắc ký trao đổi ion (Strong Cation Exchange chromatography-SCX) Tiếp theo phân đoạn peptide loại muối đầu micropipet Ziptip C18 hút chân không đến khô trước nhận diện peptide MS 2.3 Xác định protein làm giàu liệu Phổ lượng thực với cặp đôi thiết bị QSTAR-Eliter với hệ thống nano MDLC Dữ liệu thu từ thiết bị đo xử lý tiếp với phần mền Mascot Daemon (version 2.3, Matrix Science, London, U.K.) để lựa chọn đỉnh phù hợp dựa máy chủ MASCOT dựa kho liệu vi khuẩn S.Typhimurium tải xuống từ Uniprot Web (http://www.uniprot.org) Và thông số phù hợp cho việc phân tích định lượng thiết lập cho phần mền xử lý Sau liệu proteomic tạo ra, cơng việc phân loại nhóm chức protein việc chuyển liệu thu đến kho liệu máy chủ để tự động phân loại thông qua DAVID BIOINFORMATICS Resources 6.7 (http://david.abcc.ncifcrf.gov/) đường trao đổi chất thông qua KEGG PATHWAY (http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html) Và cuối protein quan tâm phân tích xác nhận kết lần thơng qua realtime PCR Tồn quy trình mơ tả qua hình 2.4 Định lượng real - time PCR (qPCR) Dịch nuôi cấy vi khuẩn sau thu tách chiết RNA, sau chuỗi đơn cDNA tổng hợp qPCR thực với CFX Manager Version 3.0 với supermix SYBR green dnaK sử dụng gen tiêu chuẩn (internal control), thí nghiệm lặp lại lần với mẫu KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tổng quan liệu proteomics Proteomics sử dụng nghiên cứu vi sinh vật với mục đích nhận biết biểu protein sinh bệnh học biến đổi môi trường Để nghiên cứu thay đổi protein chủng S.Typhimurium LT2 đột biến gen rstB so sánh với S.Typhimurium LT2 chủng tự nhiên, mẫu protein chuẩn bị phương pháp đánh dấu đồng vị ổn định axit amin với 9h nuôi cấy môi trường tối thiểu N- SILAC, nồng độ Mg thấp Tiếp theo peptide tách sắc ký lỏng (SCX) xác định phổ lượng MS/MS cuối định lượng phần mền Mascot Daemon Thí nghiệm SILAC định lượng proteomics thực hai lần Kết định lượng xác định tổng số 911 protein, chiếm khoảng 20% tổng số Hình 2: Kết định lượng MS với tỷ lệ protein dự đoán Salmonella protein Trục tung tương ứng Phân tích tỷ lệ protein chủng đột biến số lượng protein, trục hoành tương ứng với gen rstB với chủng tự nhiên (∆RstB/WT) khoảng thay đổi liệu định lượng 120 KHCN (31) - 2014 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG thấy 55,92% protein không thay đổi với tỷ lệ từ 0,769 đến 1,3; 13,93% tăng điều hòa (up-regulated) với tỷ lệ 1,3; 30,15% giảm điều hòa (down-regulated) với tỷ lệ nhỏ 0,769 (hình 2) Như thấy protein giảm điều hòa cao khoảng hai lần so với protein tăng điều hòa Hầu hết protein tăng điều hòa protein liên quan đến q trình trao đổi chất, cần thiết cho đền bù phải trải qua điều kiện môi trường không thuận lợi Protein giảm điều hòa bao gồm nhiều protein liên quan đến độc tính vi khuẩn, tích lũy vận chuyển kim loại Mg, Fe, P… 3.2 Phân tích đường trao đổi chất nhóm chức từ liệu proteomics Để xác định ảnh hưởng đột biến gen rstB vi khuẩn thương hàn LT2 điều kiện nuôi cấy với nồng độ Mg thấp pha nuôi cấy muộn (9h) (late log phase) biểu protein thông qua đường trao đổi chất nhóm chức năng, chúng tơi thực “làm giàu” liệu thơng qua phân tích Gene Ontology (GO) Kết với 900 protein phân chia vào 55 đường trao đổi chất Trong đường trao đổi chất tăng điều hòa trao đổi selenoamino acid, đường trao đổi chất giảm điều hòa phosphoryl hóa oxy hóa, trao đổi nitơ, trao đổi Thiamine (Vitamin B1), q trình tổng hợp, vận chuyển điều hòa sắt nội bào Cũng thơng qua việc phân tích liệu này, protein phân chia vào 106, 18 36 nhóm chức cho protein tổng số, protein tăng điều hòa protein giảm điều hòa, tương ứng Cũng giống phân tích tỷ lệ protein trên, phân tích nhóm chức thấy số protein giảm điều hòa (down-regulated) phân chia vào 36 nhóm chức năng, gấp đơi số nhóm chức protein tăng điều hòa (up-regulated) (18 nhóm) Dựa thông tin phân loại liệu này, chúng tơi dự đốn chủng đột biến giảm độc tố điều kiện thí nghiệm 3.3 Protein điều hòa tổng hợp, vận chuyển cân sắt giảm điều kiện không đầy đủ Mg môi trường nuôi cấy SILAC Protein vận chuyển sắt (siderophore) biết với vai trò quan trọng biểu độc lực vi khuẩn hình thành màng sinh học (biofilm) Protein vận chuyển sắt- siderophore kiểm soát gen khác để tích lũy vận chuyển sắt, sắt cần thiết cho phát triển, bảo vệ hoạt động tế bào Kết LC-MS/MS bốn protein entrobactin gồm EntA, EntB, EntE, EntF giảm điều hòa protein cho cân sắt nội môi IroB, FepA, FepB, FhuA, FhuE, Fes, NuoB, NuoC, NuoF, NuoG, IscS, IscR giảm điều hòa (Bảng 1) Để kiểm tra có hay khơng điều hòa tổng hợp protein vận chuyển sắt-siderophore protein cho cân sắt nội mơi ảnh hưởng việc xóa gen rstB, thực thiết lập plasmid pUHE21-2lacIq mang gen rstB chuyển vào chủng đột biến gen rstB, RstB protein biểu (del rstB.pRstB) với IPTG 0.4mM Sau chúng tơi tiến hành thí nghiệm kiểm tra với real-time PCR, kết thấy chủng đột biến mang plasmid chứa phần bù chúng (pRstB plasmid) trở lại vai trò RstB protein Trong chủng đột biến rstB, vai trò RstB bị loại bỏ, protein liên quan đến tổng hợp nhóm protein vận chuyển sắt - siderophore protein cân sắt nội mơi giảm điều hòa Chủng đột biến mang plasmid pRstB, vai trò RstB protein thể hiện, dẫn đến làm tăng mức độ chép gen tương tự chủng tự nhiên LT2 (Bảng 1) Kết RstB kích hoạt với protein điều hòa tổng hợp vận chuyển sắt - siderophore protein cân sắt nội môi KHCN (31) - 2014 121 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG Bảng Một số protein liên quan đến điều hòa tổng hợp siderophore sắt nội bào phổ lượng MS kết xác nhận thí nghiệm qPCR MS Liên quan đến tổng hợp siderophore sắt nội bào qPCR Tên Protein Tỷ lệ (Nhẹ/Nặng) ∆RstB (số lần biểu hiện) qRstB (số lần biểu hiện) Mẫu đối chứng EntA 0,53 0,79 ± 0,02 1,28 ± 0,05 1,0 ± 0,03 EntB 0,84 0,77 ± 0,04 1,41 ± 0,06 1,0 ± 0,03 EntE 0,49 0,82 ± 0,02 1,5 ± 0,08 1,0 ± 0,03 EntF 0,92 0,72 ± 0,03 1,42 ± 0,06 1,0 ± 0,03 Fur 0,62 0,58 ± 0,02 0,84 ± 0,06 1,0 ± 0,03 Fes 0,71 0,71 ± 0,04 1,06 ± 0,05 ± 0,06 IroB 0,65 0,95 ± 0,04 1,28 ± 0,06 ± 0,06 FepA 0,55 0,91 ± 0,03 1,83 ± 0,11 ± 0,04 FepB 1,22 0,72 ± 0,02 1,08 ± 0,09 1,0 ± 0,05 FhuA 0,8 0,73 ± 0,04 1,06 ± 0,05 1,0 ± 0,03 FhuE 0,26 0,70 ± 0,01 1,01 ± 0,07 1,0 ± 0,02 NuoC 0,46 0,88 ± 0,04 1,31 ± 0,09 1,0 ± 0,02 NuoF 1,17 0,74 ± 0,02 1,33 ± 0,1 1,0 ± 0,07 NuoG 0,48 0,79 ± 0,03 1,39 ± ,01 1,0 ± 0,03 NuoB 0,93 0,72 ± 0,03 1,0 ± 0,07 1,0 ± 0,07 IscR 0,45 0,47 ± 0,01 0,82 ± 0,06 1,0 ± 0,04 IscS 0,6 0,63 ± 0,02 1,48 ± 0,1 1,0 ± 0,04 Nhẹ mẫu đột biến cần kiểm tra đánh dấu đồng vị với SILAC nhẹ, nặng mẫu đối chứng (chủng tự nhiên) đánh dấu với SILAC nặng ∆RstB chủng đột biến gen rstB, qRstB chủng đột biến gen chứa plasmid mang gen rstB Giá trị ±SEM sai số chuẩn số lần lặp lại thí nghiệm Fur a protein kiểm soát nồng độ sắt tế bào, nồng độ sắt ngồi mơi trường cao Fur ức chế với protein liên kết với sắt nội môi để giảm hấp thụ vận chuyển sắt Kết MS/MS Fur giảm điều hòa kết real-time PCR chủng ∆rstB.pRstB hồn lại khơng đầy đủ Điều có nghĩa RstB kiểm sốt khơng hồn tồn với Fur protein KẾT LUẬN Trong nghiên cứu sử dụng phương pháp đánh dấu đồng vị trình trao đổi chất axit amin, sau thực so sánh định lượng proteomic phổ lượng LC-MS/MS chủng S.Typhimurium LT2 đột biến gen rstB chủng S.Typhimurium LT2 tự nhiên phát triển điều kiện thiếu Mg pha nuôi cấy muộn (9h nuôi cấy) thông qua nuôi cấy SILAC Dữ liệu proteomic thu từ phổ lượng thơng qua việc phân tích đường trao đổi chất, nhóm chức dự đốn độc tính vi khuẩn Mặt khác thơng qua việc lựa chọn protein thay đổi (tăng điều hòa, giảm điều hòa) để đánh giá biểu protein Trong nghiên cứu tiếp tục nghiên cứu biểu protein thông qua thay đổi protein khác ảnh hưởng chúng đến sinh bệnh học vi khuẩn 122 KHCN (31) - 2014 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG Tài liệu tham khảo Boumediene Soufi, et al (2010) “Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture (SILAC) Applied to Quantitative Proteomics of Bacillus subtilis.” J Proteome Res 9(No 7); 3638-3646 Hammer, N D and E P Skaar (2011) “Molecular mechanisms of Staphylococcus aureus iron acquisition.” Annu Rev Microbiol 65: 129-147 Haraga, A., et al (2008) “Salmonellae interplay with host cells.” Nat Rev Microbiol 6(1): 53-66 Hebrard, M., et al (2011) “The challenge of relating gene expression to the virulence of Salmonella enterica serovar Typhimurium.” Curr Opin Biotechnol 22(2): 200-210 Huang da, W., et al (2009) “Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.” Nucleic Acids Res 37(1): 1-13 Mann, M (2006) “Functional and quantitative proteomics using SILAC.” Nat Rev Mol Cell Biol Vol 7: 952 - 958 Munday, D C., et al (2012) “Using SILAC and quantitative proteomics to investigate the interactions between viral and host proteomes.” Proteomics 12(4-5): 666-672 Ong, S E and M Mann (2006) “Protocol: A practical recipe for stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC).” Nat Protocol 1(6): 2650-2660 Oudenhove, L and B Devreese (2013) “A review on recent developments in mass spectrometry instrumentation and quantitative tools advancing bacterial proteomics.” Applied Microbiology and Biotechnology 97(11): 4749-4762 10 Saha, R., et al (2013) “Microbial siderophores: a mini review.” J Basic Microbiol 53(4): 303-317 11 Steen, H and M Mann (2004) “The ABC’s (and XYZ’s) of peptide sequencing.” Nat Rev Mol Cell Biol 5(9): 699-711 12 Troxell, B., et al (2011) “The Fur regulon in anaerobically grown Salmonella enterica sv Typhimurium: identification of new Fur targets.” BMC Microbiol 11: 236 13 Yu, J L and L Guo (2011) “Quantitative proteomic analysis of Salmonella enterica serovar Typhimurium under PhoP/PhoQ activation conditions.” J Proteome Res 10(7): 2992-3002 SUMMARY STABLE ISOTOPE LABELING BY AMINO ACID IN CELL CULTURE FOR PROTEOMIC RESEACH OF SALMONELLA ENTERICA TYPHYMURIUM LT2 Tran Trung Kien1, Lin Guo2 Hung Vuong University, 2College of Life Science, Wuhan University, Wuhan, China We use a SILAC (stable isotope labeling by amino acid in cell culture) - base a proteomic quantitative comparative analysis by LC-MS/MS of Salmonella enterica Typhymurium LT2 wild-type strain versus rstB mutant strain under the magnesium limitation of the SILAC culture medium Proteomics result indicates that proteins down-regulated were twofold higher than up-regulated in the mutant strain Metabolic pathways and functional group analysis also showed the same result On the other hand, protein expression analysis of proteins alters shown that proteins relative to the synthesis and transport of iron were down-regulated The from these findings predicts that mutant strain were virulence decrease Keywords: Salmonella enterica Typhymurium LT2, SILAC, proteomic, LC-MS/MS, protein expression KHCN (31) - 2014 123 ... tính vi khuẩn Mặt khác thông qua vi c lựa chọn protein thay đổi (tăng điều hòa, giảm điều hòa) để đánh giá biểu protein Trong nghiên cứu tiếp tục nghiên cứu biểu protein thông qua thay đổi protein. .. với Fur protein KẾT LUẬN Trong nghiên cứu sử dụng phương pháp đánh dấu đồng vị trình trao đổi chất axit amin, sau thực so sánh định lượng proteomic phổ lượng LC-MS/MS chủng S.Typhimurium LT2 đột... thay đổi đáng kể Salmonella enterica Typhimurium LT2 (S.Typhimurium LT2) vi khuẩn thương hàn LT2 điều kiện kích hoạt hệ thống PhoP/PhoQ (ở nồng độ Mg thấp) Dựa kỹ thuật đánh dấu protein, nồng độ