Thủy phân dầu dừa bằng Enzyme Lipase Thu nhận chế phẩm Lauric

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN THỊ VINH THỦY PHÂN DẦU DỪA BẰNG ENZYME LIPASE - THU NHẬN CHẾ PHẨM LAURIC Chuyên ngành: Công Nghệ Thực Phẩm Mã số: 60 54 01 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng Năm 2016 Cơng trình hồn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa-ĐHQG-HCM Cán hướng dẫn khoa học: TS Trần Bích Lam TS Phan Ngọc Hòa (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Cán chấm nhận xét 1: TS Nguyễn Hoài Hương (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Cán chấm nhận xét 2: TS Huỳnh Tiến Phong (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Luận văn thạc sĩ bảo vệ Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 11 tháng năm 2016 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ) TS Hoàng Kim Anh TS Nguyễn Hoài Hương TS Huỳnh Tiến Phong TS Tôn Nữ Minh Nguyệt TS Trần Thị Thu Trà Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Nguyễn Thị Vinh MSHV: 13111035 Ngày, tháng, năm sinh: 12/11/1991 Nơi sinh: Lâm Đồng Chuyên ngành: Công nghệ Thực Phẩm Mã số: 60 54 01 01 I TÊN ĐỀ TÀI: THỦY PHÂN DẦU DỪA BẰNG ENZYME LIPASE - THU NHẬN CHẾ PHẨM LAURIC II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Khảo sát nguyên liệu dầu dừa enzyme lipase từ tụy lợn (PPL) Khảo sát điều kiện phản ứng thủy phân dầu dừa enzyme lipase từ tụy lợn (LPP): tỉ lệ dầu/đệm, tỉ lệ enzyme/cơ chất; pH, nhiệt độ, thòi gian phản ứng Thu nhận chế phẩm lauric, xác định thành phần acid béo hoạt tính kháng khuẩn che phẩm III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 11/01/2016 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 17/06/2016 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS Trần Bích Lam TS Phan Ngọc Hòa Tp HCM, ngày 20 tháng năm 2016 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO (Họ tên chữ ký) (Họ tên chữ ký) TRƯỞNG KHOA (Họ tên chữ ký) LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành lòng biết ơn sâu sắc đến hai hướng dẫn TS Trần Bích Lam TS Phan Ngọc Hòa, xin cảm ơn hai tận tình dạy hướng dẫn cho kiến thức, kỹ nghiên cứu quý báu ttong ttình tơi thực luận vãn Con xin cảm ơn ba, má hai em người thân quý giá nhất, người tiếp sức, động viên lúc gặp khó khăn học tập sống Tôi xin cảm ơn quý thầy cô ưong môn Công Nghệ Thực Phẩm, Khoa Kỹ Thuật Hóa Học, trường Đại học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh truyền đạt kiến thức tạo điều kiện tốt cho ừong suốt q trình học tập hồn thành đề tài luận vãn trường Cuối cùng, xin cảm ơn sâu sắc đến anh, chị bạn bè làm việc phòng thí nghiệm mơn Cơng Nghệ Thực Phẩm đồng hành, quan tâm giúp đỡ tơi ừong suốt q trình học tập hồn thành luận vãn Xin gửi lời cảm ơn chân thành lòng biết ơn sâu sắc TP Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng năm 2016 Học viên thực Nguyễn Thị Vinh ii ABSTRACT Lauric acid is the main component of coconut oil fatty acid (43-56%) It is known for high antibacterial activity Thus this study was done with the following contents: - Characterizing crude coconut oil and porcine pancreatic lipase - Surveying parameters for hydrolysis of coconut oil using porcine pancreatic lipase (PPL) as: oil to buffer ratio, enzyme to substrate ratio, temperature, pH, reaction time - Obtaining the preparation which is rich in lauric acid from the hydrolysate products, determining their fatty acid composition and thefr antibacterial activity against Staphylococcus aureus Results: - Raw coconut oil contains lauric acid (49.47%), caprylic acid (7.23%) - Conditions for the hydrolysis reaction of coconut oil by PPL to the highest degree of hydrolysis are: oil to buffer ratio of 0.2 (v/v); enzyme to substrate of 1.2% (w/w), pH 8.5, temperature of 37°c, reaction time of 4h - Preparation included mixture of glycerides and mixture of fatty acids Mixture of glycerides (52.6% lauric acid) have small antibacterial activity against Staphylococcus aureus Mixture of fatty acid (62.2% caprylic acid, 14.2% lauric acid) have high antibacterial activity against Staphylococcus aureus The results showed that the high specificity of the PPL for caprylic acid (C8: 0) and this acid is present mainly in the link a esters of coconut oil iii TÓM TẮT LUẬN VĂN Axit lauric thành phần axit béo dầu dừa (43 - 56%) biết đến với hoạt tính kháng khuẩn cao Do nghiên cứu “Thủy phân dầu dừa enzyme lipase - thu nhận che phẩm lauric” thực với nội dung: Khảo sát nguyên liệu Khảo sát thông số cho ttình thủy phân dầu dừa enzyme lipase từ tụy lợn (porcin pancreas lipase - PPL) hàm lượng dầu, hàm lượng enzyme, nhiệt độ, pH, thời gian phản ứng Thu nhận chế phẩm giàu lauric từ dịch thủy phân, xác định thành phần axit béo hoạt tính kháng khuẩn Staphylococcus aureus Kết thu sau: Nguyên liệu dầu dừa chứa axit lauric (49.47%), axit caprylic (7.23%) Điều kiện cho phản ứng thủy phân dầu dừa PPL cho mức độ thủy phân cao là: tỉ lệ dầu/đệm 1:5, tỉ lệ enzyme/cơ chất 1.2%, pH 8.5, nhiệt độ 37 °C, thời gian phản ứng Sản phẩm thu nhận bao gồm hỗn họp glyceride (axit lauric 52.6%) có hoạt tính kháng khuẩn Staphylococcus aureus thấp hỗn họp axit béo (axit caprylic chiếm tỉ lệ cao 62.2%, axit lauric chiếm tỉ lệ cao thứ hai 14.2%) có hoạt tính kháng khuẩn dối với Staphylococcus aureus cao Kết cho thấy enzyme PPL đặc hiệu cao axit caprylic (C8:0) acid nằm chủ yếu liên kết a este triglyceride dầu dừa iv LỜI CAM ĐOAN CỦA TÁC GIẢ Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thân Các nội dung nghiên cứu kết ừong luận vãn trung thực chưa công bố trước đây, không chép từ tài liệu hay nguồn hình thức Việc tham khảo nguồn tài liệu (nếu có) trích dẫn ghi rõ nguồn tài liệu tham khảo theo quy định Tác giả luận văn Nguyễn Thị Vinh MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i ABSTRACT ii TÓM TẮT LUẬN VÃN iii LỜI CAM ĐOAN CỦA TÁC GIẢ iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT X MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Dầu dừa 1.1.1 Phân loại dầu dừa 1.1.2 Thành phần hóa học dầu dừa 1.1.3 Tính chất hóa lý dầu dừa 1.1.4 phản ứng thủy phân dầu dừa 1.1.4.1 Thủy phân hóa chất 1.1.4.2 Thủy phân enzyme 1.2 Acid Lauric 1.2.1 ứng dụng axit lauric 1.2.2 Cơ chế kháng khuẩn acid lauric 1.2.3 Sản xuất axit lauric 1.3 Lipase 1.3.1 Phân loại lipase 10 1.3.2 Cơ che xúc tác phản ứng thủy phân chất béo lipase 17 1.3.3 Các phản ứng xúc tác lipase 19 1.4 Porcine pancreas lipase (PPL) 20 1.4.1 Cấu trúc enzyme PPL 20 1.4.2 Các yếu tố ảnh huởng đến hoạt tính xúc tác PPL 21 vi 1.4.3 ứng dụng PPL 23 1.4 Một số nghiên cứu liên quan 24 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 28 2.1 Nguyên liệu, hóa chất thiết bị 28 2.1.1 Nguyên liệu 28 2.1.2 Hóa chất sử dụng 29 2.1.3 Dụng cụ - thiết bị 30 2.2 Sơ đồ nghiên cứu 32 2.3 Bố trí thí nghiệm 33 2.3.1 Phân tích nguyên liệu 33 2.3.1.1 nguyên liệu dầu dừa 33 2.3.1.2 Khảo sát tính chất enzyme PPL 33 2.3.2 Khảo sát điều kiện phản ứng thủy phân 33 2.3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ dầu/đệm 35 2.3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ enzyme/cơ chất 37 2.3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng pH 38 2.3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ 39 2.3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng thời gian thủy phân 40 2.3.3 Thu nhận chế phẩm qui mơ phòng thí nghiệm 41 2.3.3.1 Thu hỗn họp axit béo hỗn họp glyceride 41 2.3.3.2 Xác định thành phần axit béo 44 2.3.3.3 Xác định hoạt tính kháng khuẩn chế phẩm .44 2.5 Phương pháp phân tích 45 2.5.1 Phương pháp xác định số axit 45 2.5.2 Phương pháp xác định số peroxide 45 2.5.3 Phương pháp xác định độ ẩm 46 vii 2.5.4 Xác định hàm lượng protein enzyme theo phương pháp Bradford 46 2.5.5 Xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp chuẩn độ axit - bazơ 46 2.5.6 Định lượng axit béo phương pháp đo quang 47 2.6 Phương pháp xử lý số liệu 47 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 48 3.1 Phân tích nguyên liệu 48 3.1.1 Nguyên liệu dầu dừa 48 3.1.1 Enzyme PPL 49 3.2 Khảo sát điều kiện phản ứng thủy phân 50 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ dầu/đệm 50 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ enzyme/cơ chất 51 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng pH 53 3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ 54 3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng thời gian thủy phân 56 3.3 Thành phần axit béo chế phẩm Lauric 57 3.4 Xác định hoạt tính kháng khuẩn chế phẩm lauric 59 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 4.1 Kết luận 63 4.2 Kiến nghị 63 BẢNG DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 PHỤ LỤC 74 48 110,9 ± 0.2 u/mg enzyme Hoạt độ riêng enzyme 249,5 ± 2.2 u/mg protein 3.2 Khảo sát điều kiện phản ứng thủy phân 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ dầu/đệm Mức độ thủy phân enzyme PPL khảo sát với tỉ lệ dầu/đệm 1:1,1:2,1:3,1:4,1:5,1:6,1:7 Kết thể hình 3.2 Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng tỉ lệ dầu/đệm đến mức độ thủy phân enzyme PPL Theo hình 3.2, tăng tỉ lệ dầu/đệm từ 0.14 (1:7) đến (1:1) mức độ thủy phân tăng dần từ 25.94% lên 29.35 % tiếp tục tăng tỉ lệ dầu/đệm từ 1:5 đến 1:1 mức độ thủy phân giảm từ 29.35% xuống 15.2% Như thấy, mức độ thủy phân đạt cực đại tỉ lệ dầu/đệm 1:5 Hàm lượng dầu hay tỉ lệ dầu/đệm yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân dầu enzyme lipase Khi tăng tỉ lệ dầu/ đệm mức độ thủy phân dầu tăng đến giới hạn tiếp tục tăng tỉ lệ dầu/đệm mức độ thủy phân dầu giảm Theo nghiên cứu serri cộng (2008) cho kết tưong tự [21], 49 Enzyme lipase hoạt động bề mặt liên pha dầu/nước nên việc tăng bề mặt tiếp xúc hai pha dầu, nước làm tăng khả hoạt động xúc tác enzyme lipase Do đó, để lipase hoạt động tốt tiến hành tạo nhũ cho chất Nhũ tạo thành tốt tăng hoạt tính xúc tác lipase Mà trình tạo nhũ với tỉ lệ dầu/đệm khác từ 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7 tỉ lệ dầu/đệm 1:5 tạo nhũ tốt với thời gian tách pha lâu Có lẽ mà tỉ lệ cho kết mức độ thủy phân cao Đối với loại chất khác tỉ lệ tối ưu khác Trong nghiên cứu W.J.Ting cộng (2006), thủy phân dầu đậu nành enzyme CRL tỉ lệ dầu/đệm tối ưu 10:7 [69], Trong nghiên cứu khác Yuji Shimada cộng (1998), khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả thủy phân CRL dầu lưu ly họ chọn tỉ lệ dầu/nước tối ưu 2:1 (v/v) [20], 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ enzyme/cơ chất Mức độ thủy phân enzyme PPL khảo sát với nồng độ enzyme thay đổi từ 0.4%, 0.6%, 0.8 %, 1.0 %, 1.2 %, 1.4 %, 1.6 % (w/w) Kết thể hình 3.3 Bảng 3.3 Bảng quỉ đổi từ tỉ lệ % enzyme /cơ chẩt u/g chẩt 50 Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng tỉ lệ enzyme/cơ chẩt đển mức độ thủy phân enzyme PPL Hàm lượng enzyme tăng mức độ thủy phân dầu tăng Tuy nhiên, tăng hàm lượng enzyme vượt q giá trị mức độ thủy phân khơng tăng thêm Điều giải thích tăng hàm lượng enzyme làm tăng tiếp xúc enzyme chất Khi tỉ lệ enzyme chất đạt độ bão hòa việc tăng thêm lượng enzyme khơng làm tăng mức độ thủy phân Ngoài ra, tăng lượng enzyme mức làm giảm mức độ thủy phân sản phẩm thủy phân hình thành nhiều thời điểm khởi đầu phản ứng trở thành tác nhân ức chế enzyme giai đoạn Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng tỉ lệ enzyme/cơ chất tuân theo qui luật hên Mức độ thủy phân đạt giá trị cao tỉ lệ enzyme/dầu 1.2 % (w/w) Khi tăng tỉ lệ từ 0.4% đến 1.6% mức độ thủy phân tăng dần từ 18.11% với tỉ lệ 0.4% lên đến 29.06% với tỉ lệ 1.2% Tiếp tục tăng tỉ lệ enzyme/dầu từ 1.2% đến 1.6% mức độ thủy phân khơng tăng thêm mà giảm nhẹ từ 29.06% xuống 28.19% Trong nghiên cứu khác N.A Serri cộng (2008) việc sản xuất axit béo từ dầu cọ thủy phân enzyme CRL xác định quy luật tương tự Khi khảo sát hàm lượng enzyme CRL từ 3.73 kLU/ml đến 14.92 kLU/ml với hàm lượng dầu o.lg/ml nhiệt độ 45°c, tốc độ khuấy 200 rpm mức độ thủy phân dầu cọ tăng 51 dần đạt giá trị lớn với hàm lượng enzyme 7.46 kLU/ml Khi tăng hàm lượng enzyme CRL từ 7.46 kLU/ml đến 14.92 kLU/ml mức độ thủy phân giảm nhẹ [21], Yuji Shimada cộng (1998) nghiên cứu sản xuất axit Y -linolenic (GLA) cách thủy phân dầu lưu ly enzyme lipase Candida rugosa yếu tố ảnh hưởng thời gian nồng độ enzyme/cơ chất cho kết quả: nồng độ enzyme cho mức độ thủy phân cao 100 u/g mẫu tăng nồng độ enzyme cao mức độ thủy phân không tăng thêm [20] 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng pH Mức độ thủy phân enzyme PPL khảo sát khoảng pH từ - Kết thể hình 3.4 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng pH đển mức độ thủy phân enzyme PPL pH môi trường phản ứng yếu tố ảnh hưởng đến mức độ thủy phân dầu enzyme lipase pH gây ảnh hưởng đến mức độ ion hóa enzyme làm ảnh hưởng đến hoạt tính thủy phân enzyme Mỗi enzyme có khoảng pH hoạt động khác Trong khoảng giá trị có giá trị pH tối thích để enzyme hoạt động tốt đạt mức độ thủy phân dầu cao Vì vậy, việc tìm giá trị pH tối thích cần thiết Mỗi enzyme có khoảng pH thích hợp khác Enzyme PPL có khoảng pH hoạt động môi trường kiềm với pH từ 7:9 [75], Trong nghiên cứu này, khảo sát giá 52 trị pH từ 7:9 mức độ thủy phân dầu dừa đạt cao 32.68% giá tri pH 8.5 Tuy nhiên, giá trị pHOpt thay đổi khác tùy vào loại chất Bagi K cộng (1997) sử dụng enzyme lipase Porcine pancreas cố định lên hạt polyacrylamide để thủy phân dầu oliu Kết cho thấy pH tối ưu cho enzyme LPP 8.9 hai dạng tự cố định [48], Li Yanjing cộng (2009) nghiên cứu cố định enzyme PPL lên vật liệu xốp SB A 15 dạng sợi để thủy phân triacetin Khi khảo sát thông số phản ứng thủy phân triacetin so sánh PPL dạng tự cố định hai có pH tối ưu [67], 3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ Mức độ thủy phân enzyme PPL khảo sát khoảng nhiệt độ từ 30°C 50°C Kết thể hình 3.5 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đển mức độ thủy phân enzyme PPL Mức độ thủy phân dầu xúc tác enzyme lipase bị ảnh hưởng lớn nhiệt độ Theo lý thuyết tăng nhiệt độ tốc độ phản ứng tăng dần Nhiệt độ tăng 53 làm tăng chuyển động phân tử dung dịch phản ứng giảm độ nhớt dung dịch phản ứng Từ đó, làm tăng va chạm enzyme chất, phân tử dầu nước Tuy nhiên, chất protein enzyme, tăng nhiệt độ cao enzyme bị biến đổi cấu trúc nhanh chóng bị bất hoạt Do đó, việc xác định giá trị nhiệt độ tối thích cho phản ứng thủy phân dầu enzyme lipase cần thiết Theo hình 3.5, nhiệt độ mơi trường thủy phân tăng từ 30°C, 35°c đến 37°c mức độ thủy phân enzyme tăng từ 25.81%, 31.52% đến 34.61% Tuy nhiên, nhiệt độ tăng lên 40°C, 45°c 50°C mức độ thủy phân enzyme giảm từ 34.61% xuống 32.87%, 30.7% 29.44 % Nhiệt độ tối ưu cho PPL hoạt động thủy phân chất dầu dừa 37°c Kết phù hợp với kết số nghiên cứu khác Bagi K công (1997) sử dụng enzyme lipase PPL cố định lên hạt polyacrylamide để thủy phân dầu oliu Kết cho thấy khoảng nhiệt độ tối ưu cho enzyme PPL tự cố định 37°c 4- 40°C Trong nghiên cứu khác Li Yanjing cộng (2009), nhiệt độ tối ưu cho phản ứng thủy phân triacctin enzyme LPP dạng tự cố định 35°c [45], 3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng thời gian thủy phãn Mức độ thủy phân enzyme PPL khảo sát khoảng thời gian từ 0.51-2-3-4-5-6-7-811 Kết thể hình 3.6 54 Hình 3.6 Đồ thị biểu Diễn ảnh hưởng thời gian thủy phân tới mức độ thủy phân enzyme PPL Khi tăng thời gian phản ứng thủy phân mức độ thủy phân tăng dần Tuy nhiên, thời gian phản ứng lâu tốc độ phản ứng thủy phân giảm dần mức độ thủy phân tăng khơng đáng kể gần không tăng Việc thực phản ứng thời gian lâu gây thời gian, đồng thòi gây số biến đổi sản phẩm thủy phân Do đó, cần phải xác định thời gian thủy phân phù họp để phản ứng thủy phân dầu lipase để đạt hiệu mong muốn Theo hình 3.6 mức độ thủy phân tăng theo thời gian phản ứng gần không đổi sau 4h Khi tiếp tục tăng lên 5h, 6h, 7h, 8h, 9h, lOh, llh 1211 mức độ thủy phân gần không đổi giảm nhẹ Việc giảm nhẹ biến đổi vài acid béo chưa bão hòa sinh sau thủy phân Có thể dự đốn mức độ thủy phân khơng tăng thêm sau 12h Do đó, khoảng thời gian 4h phù hợp để tiến hành phản ứng thủy phân dầu dừa enzyme PPL Yuji Shimada cộng (1998) nghiên cứu sản xuất Ỵ -linolenic acid (GLA) cách thủy phân dầu lưu ly CRL, 35°c với nồng độ enzyme 100 u/g mẫu mức độ thủy phân đạt cao 80% sau 15h phản ứng Tuy nhiên, so với mức độ thủy phân sau 8h, kéo dài thời gian phản ứng đến 15h mức độ thủy phân tăng không đáng kể 55 [20], Tomoko Okada cộng (2007) nghiên cứu sử dụng lipase xúc tác thủy phân dầu chiết xuất từ cá mòi Thái Bình Dương để sản xuất axit béo Cữ- Phản ứng thủy phân dầu cá sử dụng lipase thương mại từ Candida rugosa, Candida cyỉindracea, Mucor javanicus, Aspergillus niger thực 37°c khuấy liên tục 1.5, 3, Dầu cá mòi thủy phân nhanh chóng 1.5 sau 3, 6, hàm lượng DHA EPA thay đổi không đáng kể [9], Sau tiến hành khảo sát thông số phản ứng, điều kiện phù hợp cho phản ứng thủy phân dầu dừa vco enzyme PPL để thu nhận chế phẩm lauric chọn là: tỉ lệ dầu/đệm 1:5, tỉ lệ enzyme/cơ chất 1.2 % (w/w), pH 8.5, nhiệt độ phản ứng 37 °C thời gian phản ứng 3.3 Thành phần axit béo chế phẩm Lauric Thành phần axit béo hỗn hợp axit béo hỗn hợp glyceride sau chiết trình bày bảng 3.4 56 Bảng 3.4 Thành phần axit béo hỗn hợp axit béo hỗn hợp glyceride Thành phần hỗn họp axit béo chủ yếu axit béo mạch ngắn mạch trung (C8C14) Trong đó, hàm lượng axit caprylic (C8:0) chiếm tỉ lệ cao (62.2%), axit Lauric chiếm tỉ lệ cao thứ hai (14.2%), tiếp axit capric (C10:0), axit myrictic (C14:0) axit caproic (C6:0) Các acid béo mạch dài (C16 - C18) chiếm tỉ lệ thấp (khoảng 3.1%) Trong thành phần nguyên liệu dầu dừa ban đầu, axit lauric chiếm tỉ lệ cao 49.47% (bảng 3.1) thành phần hỗn hợp axit béo axit lauric chiếm 14% (mặc dù chiếm tỉ lệ cao thứ hai hỗn hợp này) Còn axit caprylic (C8:0), chiếm 7.23% thành phần nguyên liệu dầu dừa (bảng 3.1) lại chiếm tỉ lệ cao (62.2%) gấp nhiều lần so với tỉ lệ nguyên liệu dầu dừa ban đầu Như thấy enzyme PPL có tính đặc hiệu cao axit béo mạch ngắn đặc biệt axit caprylic (C8:0) Thành phần axit béo hỗn họp glyceride gần tương đương với thành phần axit béo ttong nguyên liệu ban đầu Tuy nhiên tỉ lệ axit béo mạch ngắn (C6- C10) thấp so với tỉ lệ axit béo ttong nguyên liệu dầu, axit lauric axit béo mạch dài khác chiếm tỉ lệ cao tỉ lệ chúng ttong nguyên liệu ban đầu Điều 57 họp lý enzyme PPL ưu tiên cắt liên kết ester axit béo mạch ngắn đặc biệt axit caprylic (C8:0) Do PPL đã khẳng định đặc hiệu vị trí 1.3, thấy axit caprylic chủ yếu liên kết a ester Trong nghiên cứu khác K Saerens cộng (2008), so sánh khả thủy phân sáu loại lipase việc tăng hàm lượng axit béo mạch ngắn đặc biệt axit butanoic (đóng vai trò quan trọng tạo hương vị cho bơ sữa) cho kết lipase từ porcin pancreas so lipase khác từ Candida cylindracea, Pencillium roqueforti cho thấy tính đặc hiệu axit béo mạch ngắn mạch trung Ket phù hợp với kết ưên [68], Như hỗn họp axit béo hỗn họp glyceride thu axit lauric chiếm tỉ lệ cao bên phần hỗn hợp glyceride dạng monoglyceride, diglyceride triglyceride chưa bị thủy phân axit lauric dạng tự ttong hỗn họp axit béo chiếm tỉ lệ thấp 3.4 Xác định hoạt tính kháng khuẩn chế phẩm lauric Axit lauric có khả kháng khuẩn tốt, đặc biệt vi khuẩn gram dương [76], Staphylococcus aureus vi khuẩn gram dương, nguyên nhân quan trọng nhiễm trùng bệnh viện, bệnh cộng đồng vấn đề liên quan đến ngộ độc thực phẩm thường thấy [77], Do việc kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của sản phẩm thủy phân chứa axit lauric Staphylococcus aureus cần thiết Các sản phẩm thu bao gồm hỗn hợp axit béo hỗn hợp glyceride đem kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn Staphylococcus aureus Kết thu được trình bày hình 3.7 bảng 3.5 58 Hình 3.7 Hoạt tỉnh kháng khuẩn chểphẩm lauric Trong đó: A - Hỗn hợp axit béo sau chiết; B - Hỗn họp glyceride sau chiết; o - Mau đối chứng Bảng 3.5 Đường kính kháng khuẩn chế phẩm lauric Từ hình 3.7 kết từ bảng 3.5, ta thấy hỗn họp axit béo có hoạt tính kháng khuẩn mạnh Staphylococcus aureus (đường kính vòng kháng khuẩn lớn 11.2 ± 0.2 mm), hỗn hợp glyceride có hoạt tính kháng khuẩn yếu đối vói Staphylococcus aureus (đường kính vòng kháng khuẩn nhỏ, 1.2 ± 0.2) Điều giải thích do, sản phẩm sau thủy phân dầu dừa enzyme PPL có axit béo tự monoglyceride có hoạt tính kháng khuẩn Trong hỗn hợp axit béo (chủ yếu axit béo mạch ngắn trung bình), axit béo có hoạt tính kháng khuẩn cao axit lauric Axit lauric có hoạt tính kháng khuẩn tốt so với axit caprilic (C8:0), axit capric (C10:0) acid myristic (C14:0) [78], Còn hỗn hợp glyceride thành phần axit lauric cao 52.6 % thành phần monoglyceride thấp, axit lauric chủ yếu nằm ữong liên kết 59 dạng diglyceride triglyceride mà hai dạng khơng có hoạt tính kháng khuẩn [79], Blaise Quattara cộng (1997), nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn acid béo tinh dầu hai loài vi khuẩn gram âm (Pseudomonas fluorescens liquefaciens Serratia), bốn loài vi khuẩn gram dương (Brochothrix thermosphacta, Carnobacterium piscicola, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus sake) Ket cho thấy axit lauric palmitoleic cho thấy có tác dụng ức chế lớn với nồng độ ức chế tối thiểu từ 250 đến 500 mg / ml, myristic (C14:0), palmitic(C16:0), stearic(C18:0) axit oleic (C18:l) hoàn tồn khơng có khả [5], Axit caprylic (C8:0) axit béo cho hoạt tính kháng khuẩn cao Trong nghiên cứu Manoj Kumar Mohan Nair cộng (2004), xác định tác dụng kháng khuẩn Axit caprylic (C8: 0) monoglyceride nó, monocaprylin L monocytogenes E coli 0157: H7 sữa nguyên chất cho thấy hoạt động kháng khuẩn tốt có khả ứng dụng làm chất bảo quản sữa [80], Trong nghiên cứu khác, M K M Naữ cộng (2005) tiến hành kiểm ừa hiệu axit caprylic, axit béo chuỗi ngắn, monoglyceride nó, monocaprylin, để làm bất hoạt chung tác nhân gây bệnh viêm vú bò, bao gồm Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis, Staphylococcus aureus Escherichia coli Kết nghiên cứu axit caprylic monocaprylin nên lựa chọn thay hỗ trợ cho loại thuốc kháng sinh dùng để điều trị bệnh viêm vú bò [81], Đã có nhiều nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn dầu dừa sau thủy phân enzyme lipase số loài vi khuẩn Elysa cộng (2014) xác định hoạt tính kháng khuẩn dầu dừa nguyên chất (VCO) thủy phân chế phẩm lipase TLIM (Novozymes) Salmonella cho thấy vùng ức chế tăng tỉ lệ thuận với nồng độ dầu vco thủy phân enzyme khơng có khác biệt khả kháng khuẩn dầu vco thủy phân Salmonella typhimuriumand Salmonella typhi Cloramphenicol cho thấy khả kháng khuẩn cao 60 Tuy nhiên khả kháng khuẩn chloramphenicol Salmonella typhi tốt Salmonella typhimurium Điều cho thấy Salmonella typhỉmurium kháng lại chloramphenicol không đề kháng với dầu dừa thủy phân enzyme [82], Jansen Silalahi cộng (2014) nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn dầu vco thủy phân chế phẩm lipase TLIM (Novozyme) Kết cho thấy vco chưa thủy phân khơng cho hoạt tính kháng khuẩn, vco thủy enzyme kháng khuẩn tốt vco thủy phân kiềm Tetracycilin ampicillin có hoạt tính kháng khuẩn cao vco thủy phân nhiên vco sử dụng ừong thành phần số loại thực phẩm với mục đích bảo quản mà khơng gây đề kháng kháng sinh [7], Một nghiên cứu khác Ninda T.M Sihombing cộng (2014) nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết xuất tỏi, dầu dừa thủy phân chế phẩm enzyme TLIM (Novozyme) kết họp chúng Kết cho thấy dầu dừa chưa thủy phân khơng có hoạt tính kháng khuẩn, dầu dừa thủy phân enzyme có hoạt tính kháng khuẩn cao với vi khuẩn gram dương Tỏi có hoạt tính kháng khuẩn tốt với vi khuẩn gram âm gram dương, kết hợp chúng không cho thấy tác dụng hợp lực kháng khuẩn [8], Như vậy, ứng dụng hỗn họp axit béo thu từ dịch thủy phân dầu dừa enzyme PPL chất kháng khuẩn Nhưng để ứng dụng cần có nghiên cứu tác dụng kháng vi sinh vật nhiều đối tượng vi sinh vật khác bảo quản thực phẩm với nghiên cứu sâu rộng CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua kết khảo sát, đến kết luận sau: Điều kiện để phản ứng thủy phân dầu dừa enzyme PPL để mức độ thủy phân đạt 61 giá trị cao là: tỉ lệ dầu/đệm 1:5 (v/v), tỉ lệ enzyme/cơ chất 1.2 % (w/w), pH 8.5, Nhiệt độ: 37°c, thời gian phản ứng Trong dầu dừa vco acid caprylic nằm chủ yếu liên kết a ester PPL tỏ thủy phân đặc hiệu với acid Hỗn hợp axit béo thu có thành phần axit béo mạch ngắn (C8:0, 62,2 %; C12:0, 14.2 %) cho hoạt tính kháng khuẩn Staphylococcus aureus cao cao nhiều so với hỗn hợp glyceride thu Do ứng dụng để bổ sung vào thực phẩm với mục đích bảo quản 4.2 Kiến nghị - Tách riêng caprylic để nghiên cứu để so sánh hoạt tính kháng khuẩn - Mở rộng nghiên cứu nhiều loại enzyme khác, để chọn enzyme đặc hiệu với axit lauric - Tối ưu hóa qui trình thu nhận chế phẩm lauric - Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn chế phẩm thu nhiều loại vi khuẩn khác khả sử dụng chế phẩm để bảo quản thực phẩm 62 BẢNG DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] I Gill and R Valivety, “Polyunsaturated fatty acids, part 1: Occurrence, biological activities and applications,” Trends Biotechnol., vol 15, no 10, pp 401-409, 1997 [2] u M.T Houtsmuller and A Van Der Beek, “Effects of topical application of fatty acids,” Prog Lipid Res., vol 20, pp 219-224, 1981 [3] G Barcelo-Coblijn and E J Murphy, “Alpha-linolenic acid and its conversion to longer chain n-3 fatty acids: Benefits for human health and a role in maintaining tissue n-3 fatty acid levels,” Prog Lipid Res., vol 48, no 6, pp 355-374, 2009 [4] c J Zheng, J.-S Yoo, T.-G Lee, H.-Y Cho, Y.-H Kim, and W.-G Kim, “Fatty acid synthesis is a target for antibacterial activity of unsaturated fatty acids.,” FEBS Lett., vol 579, no 23, pp 5157-5162, 2005 [5] B Ouattara, R E Simard, R A Holley, G J.-P Piette, and A Begin, “Antibacterial activity of selected fatty acids and essential oils against six meat spoilage organisms,” Int J Food Microbiol., vol 37, no 2-3, pp 155-162, 1997 [6] s Zhang, H Yang, and L Singh, “Increased information leakage from text,” CEUR Workshop Proc., vol 1225, no July 2016, pp 41-42, 2014 [7] s D Loung F.S., Silalahi J., “Antibacterial activity of enzymatic hydrolyzed of virgin coconut,” Int J PharmTech Res., vol 7, no 3, pp 90-94, 2014 [8] N T M Sihombing, J Silalahi, and D Suryanto, “Antibacterial activity of aqueous garlic (allium sativum) exttacts and vừgin coconut oil and then ... lỷ dầu dừa [16] a 1,1.4 phản ứng thủy phân dầu dừa Nhìn chung có phương pháp để thủy phân dầu dừa: thủy phân hóa chất thủy phân enzyme I.I.4.I Thủy phân hóa chất - K I■ CH - - CO - Rọ - - 1- H,... TÀI: THỦY PHÂN DẦU DỪA BẰNG ENZYME LIPASE - THU NHẬN CHẾ PHẨM LAURIC II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Khảo sát nguyên liệu dầu dừa enzyme lipase từ tụy lợn (PPL) Khảo sát điều kiện phản ứng thủy phân dầu. .. - l1“ JJ- - OJ- K ■ '- OÍ 'h p._ - ÓĨT- - 'lĩ" 7-T ;-7 -3 "."TT - -' -H Hĩnh 1.2 Phản ứng thủy phân triacylglycerol môi trường axit > Tác nhân xúc tác thủy phân acid, kiềm (NaOH KOH) > Thủy