Nhiễm trùng vật ghép là một trong những biến chứng nghiêm trọng nhất sau phẫu thuật. Gel fibrin với nhiều ưu điểm như tương hợp sinh học, phân hủy sinh học, tính bám dính và cầm máu; phù hợp để làm hệ thống phân phối kháng sinh tại chỗ.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG GEL FIBRIN CHỨA KHÁNG SINH TRONG PHỊNG NGỪA VÀ ĐIỀU TRỊ BIOFILM VI KHUẨN Đồn Ngun Vũ*, Trương Thanh Tùng*, Phạm Anh Vũ Thụy**, Trần Lê Bảo Hà* TÓM TẮT Mở đầu: Nhiễm trùng vật ghép biến chứng nghiêm trọng sau phẫu thuật Gel fibrin với nhiều ưu điểm tương hợp sinh học, phân hủy sinh học, tính bám dính cầm máu; phù hợp để làm hệ thống phân phối kháng sinh chỗ Đối tượng phương pháp: Trong nghiên cứu này, huyết tương thu nhận từ máu ngoại vi sử dụng để tạo gel fibrin cách bổ sung ion Ca2+ Sau đó, gel fibrin chứa kháng sinh đánh giá số tính chất cấu trúc bề mặt, phân hủy sinh học, phân phối kháng sinh khả phòng ngừa/điều trị biofilm vi khuẩn in vitro Kết quả: Kết cho thấy gel fibrin vật liệu thích hợp để phân phối kháng sinh kéo dài Quan trọng, gel fibrin chứa kháng sinh có khả ức chế phát triển biofilm vi khuẩn in vitro Kết luận: Nghiên cứu bước đầu cho việc phát triển hệ thống phân phối kháng sinh nhằm điều trị hiệu nhiễm trùng vật ghép Từ khóa: kháng sinh, biofilm, hệ thống phân phối thuốc, gel fibrin, nhiễm trùng vật ghép ABSTRACT THE RESEARCH ON USING FIBRIN GEL CONTAINING ABTIBIOTICS IN PREVENTION AND TREATMENT OF BACTERIAL BIOFILM Doan Nguyen Vu, Truong Thanh Tung, Pham Anh Vu Thuy, Tran Le Bao Ha * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 – No - 2019: 261 - 267 Objectives: Prosthetic vascular graft infection is one of the most serious complications after vascular surgery Fibrin gel has many useful characteristics as biocompatibility, biodegradation, adhesion and haemostasis for development of local antibiotic delivery system Materials and method: In this study, plasma was collected from peripheral blood that was used to create fibrin gel by supplement ion Ca2+ Fibrin gel containing antibiotic was then evaluated in some characteristics such as surface structure, biodegradation, antibiotic delivery, and prevention of bacterial biofilm in vitro Results: The results showed that fibrin gel was excellent material for extended delivery of antibiotic Most importantly, fibrin gel containing antibiotic were able to inhibit growth of bacterial biofilm in vitro Conclusion: This research is the first step for development of antibiotic delivery system for effective treatments for graft infection Keywords: antibiotic, biofilm, drug delivery system, fibrin gel, graft infection 1-5%, thay đổi tùy theo vị trí cấy ghép, vật liệu ĐẶT VẤN ĐỀ sinh học sử dụng bệnh đồng mắc Gánh nặng chi phí hàng năm liên quan đến phải bệnh nhân Tỷ lệ tử vong khoảng 10nhiễm trùng vật ghép 640 triệu USD(8) Tỷ lệ 25% vòng 30 ngày sau phát mắc bệnh nhiễm trùng vật ghép dao động từ Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS Đoàn Nguyên Vũ ĐT: 0348064416 Email: dnvu@hcmus.edu.vn * ** Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 261 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 gần 50% sau năm(13) Phương pháp tạo gel fibrin Trong trình phẫu thuật, bệnh nhân thường cung cấp kháng sinh; đặc biệt phẫu thuật chỉnh hình diện tích phẫu thuật lớn vật liệu cấy ghép thể Ngoài ra, nhiễm trùng xảy vị trí cấy ghép nơi mật độ mạch máu thấp, bệnh nhân phải điều trị kháng sinh liều cao thời gian dài Do đó, làm tăng nguy gây độc cho thể bệnh nhân tạo vi khuẩn kháng kháng sinh(1,12) Ngoài ra, biofilm phát triển bề mặt vật liệu cấy ghép đóng vai trò quan trọng khó khăn điều trị nhiễm trùng vật ghép Trong trường hợp này, điều trị nhiễm trùng vật ghép kháng sinh mà không loại bỏ vật ghép bị nhiễm khơng thể(13) Máu ngoại vi ly tâm 3000 vòng/phút 10 phút Sau ly tâm, lớp huyết tương thu nhận lặp lại bước ly tâm lần Sau đó, huyết tương bảo quản 4°C sử dụng Huyết tương bổ sung nồng độ dung dịch CaCl2 (Merck): 0,011M CaCl2 (gel A); 0,013M CaCl2 (gel B); CaCl2 0,015M (gel C) ủ 37oC để tạo gel fibrin Để khắc phục nhược điểm việc chữa trị nhiễm trùng vật ghép để ngăn ngừa hình thành biofilm bề mặt vật liệu cấy ghép, hệ thống phân phối kháng sinh có kiểm sốt trúng đích cần thiết Gel fibrin có nhiều đặc điểm để trở thành ứng cử viên tiềm cho mục đích trên, tính tương hợp sinh học, đặc tính bám dính cấu trúc lỗ xốp tạo điều kiện cho việc phân phối dược phẩm(3,7) Mục đích nghiên cứu phát triển hệ thống phân phối kháng sinh chỗ từ gel fibrin nhằm điều trị nhiễm trùng vật ghép hiệu ngăn ngừa biofilm vi khuẩn ĐỐITƯỢNG- PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu thí nghiệm Đối tượng nghiên cứu Máu ngoại vi cung cấp Trung tâm truyền máu Chợ Rẫy, Bệnh viện Chợ Rẫy, Thành phố Hồ Chí Minh Pseudomonas aeruginosa (P aeruginosa) nguyên bào sợi người cung cấp Phòng thí nghiệm Kỹ thuật mô Vật liệu y sinh (TEBM), Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh 262 Phương pháp đánh giá cấu trúc gel fibrin Cấu trúc gel fibrin xác định nhuộm Hematoxylin-Eosin (H&E) kính hiển vi điện tử quét (SEM) Phương pháp đánh giá độ phân hủy gel fibrin Độ phân hủy gel fibrin đánh giá cách ủ huyết tương người 37oC ngày Khối lượng lại gel fibrin xác định ngày Phương pháp đánh giá khả nạp thải kháng sinh gel fibrin Tạo đường chuẩn (Phương pháp Kirby- Bauer) Các dung dịch huyết tương chứa vancomycin chuẩn bị nồng độ khác (0,0625 mg/ml; 0,125 mg/ml; 0,25 mg/ml; 0,5 mg/ml; mg/ml) Sau đó, khoanh giấy lọc Whatman vơ trùng thêm 30 μl dung dịch kháng sinh chuẩn bị, sau đặt đĩa vi khuẩn ủ 37°C Sau 18 giờ, đường kính vòng kháng khuẩn đo Dựng đường chuẩn thể mối tương quan nồng độ kháng sinh đường kính vòng kháng khuẩn(16) Đánh giá khả nạp kháng sinh gel fibrin in vitro Huyết tương cho vào đĩa giếng, sau vancomycin thêm vào lúc với dung dịch CaCl2 ủ 37oC Sau tạo gel fibrin, dung dịch lại thu nhận để xác định nồng độ kháng sinh dựa đường chuẩn Đánh giá khả thải kháng sinh gel fibrin in vitro Gel fibrin chứa kháng sinh ủ Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 huyết tương lắc 100 vòng/phút 37°C ngày Huyết tương thu nhận bảo quản -20°C Nồng độ kháng sinh xác định ngày thí nghiệm dựa đường chuẩn Phương pháp tạo mơ hình biofim in vitro P aeruginosa ni môi trường TSA (Oxoid) 37oC qua đêm tủ ủ lắc Sau đó, P aeruginosa tiếp tục nuôi môi trường TSB (Oxoid) chứa 2% glucose 37oC qua đêm tủ ủ lắc Dung dịch P aeruginosa pha loãng để đạt mật độ 5x105 CFU/ml mơi trường TSB chứa 2% glucose Sau đó, dịch huyền phù vi khuẩn nuôi cấy đĩa 96 giếng phủ huyết tương ủ 37oC ngày Phương pháp đánh giá hình thành mơ hình biofilm in vitro Mơ hình biofilm hình thành đĩa rửa hai lần dung dịch PBS (Sigma) để loại bỏ vi khuẩn tự bám dính lỏng lẻo Sau đó, tế bào cố định cồn tuyệt đối 10 phút nhuộm crystal violet 1% 20 phút; sau rửa hai lần PBS, giếng làm khô tự nhiên Crystal violet hòa tan với acid acetic 33% độ hấp thụ thuốc nhuộm đọc bước sóng 570 nm(14) Bảng Phân loại hình thành biofilm in vitro Sự hình thành biofilm Khơng có biofilm Biofilm yếu Biofilm trung bình Average OD results OD ≤ 0,163 Biofilm mạnh OD0,652 Nghiên cứu Y học giếng đĩa 96 giếng vơ trùng có mơ hình biofilm sau 24 ủ 37°C ngày Khả điều trị biofilm in vitro đánh giá phương pháp MTT nhuộm crystal violet Phương pháp MTT Các mẫu biofilm đĩa rửa hai lần dung dịch PBS để loại bỏ vi khuẩn bám dính lỏng lẻo Mơi trường ni cấy pha với dung dịch MTT mg/ml ủ 37° Dung dịch loại bỏ nhẹ nhàng tủa hòa tan dimethylsulfoxide (DMSO), sau đo bước sóng 570nm Xử lý số liệu Số liệu thu nhận xử lý theo chương trình Statgraphic 7.0 Trường Đại học Michigan (Mỹ) KẾT QUẢ Kết tạo gel fibrin Máu ngoại vi ly tâm 3000 vòng/ phút 10 phút; sau chất lỏng bề mặt thu nhận Tốc độ ly tâm không gây lắng protein máu; đồng thời, tế bào máu không bị phá vỡ Sau lần ly tâm, huyết tương thu nhận có màu vàng, thể tích huyết tương khoảng 45% so với tổng thể tích máu ngoại vi (Hình 1) 0,163 OD ≤0,326 0,326 OD ≤0,652 Phương pháp đánh giá khả phòng ngừa hình thành biofilm in vitro Gel fibrin chứa kháng sinh đặt vào giếng đĩa 96 giếng vô trùng lúc với bổ sung dịch vi khuẩn ủ 37°C ngày Khả phòng ngừa hình thành biofilm in vitro đánh giá phương pháp MTT nhuộm crystal violet Phương pháp đánh giá khả điều trị biofilm in vitro Gel fibrin chứa kháng sinh đặt vào Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền A B C Hình Huyết tương thu nhận từ máu ngoại vi A Máu ngoại vi; B Máu ngoại vi sau ly tâm; C Huyết tương Bảng Thời gian hình thành gel fibrin Gel Thời gian hình thành (phút) A B C 20,67 0,58 15,33 0,58 13,33 0,58 Sau thêm dung dịch CaCl2, huyết tương chuyển sang màu vàng đục Sau khoảng 20 263 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 phút, gel fibrin hình thành với hình dạng vật chứa (Hình 2) Nồng độ dung dịch CaCl2 cao thời gian hình thành gel fibrin nhanh (Bảng 2) đan xen Những sợi protein có đường kính khoảng 0,5 μm (Hình 3) Hình Hình ảnh chụp SEM gel fibrin (x10.000) Hình Gel fibrin hình thành với dung dịch CaCl2 nồng độ khác Kết cấu trúc gel fibrin Hình ảnh chụp SEM cho thấy gel fibrin có cấu trúc xốp hình thành sợi protein A B Kết nhuộm H&E cho thấy kích thước lỗ trung bình gel fibrin tăng dần nồng độ dung dịch CaCl2 tăng Mặt khác, mật độ lỗ gel giảm (Hình 4) C Hình Hình ảnh nhuộm H&E gel fibrin (x400) A: Gel A, B: Gel B, C: Gel C Kết đánh giá độ phân hủy gel fibrin Kết phân hủy gel fibrin huyết tương người cho thấy gel fibrin phân hủy liên tục ngày Khối lượng gel fibrin giảm nhanh ngày (30 - 50%) giảm chậm ngày sau Sau ngày, gel A C bị phân hủy hoàn toàn; gel B lại 25% khối lượng ban đầu (Hình 5) Kết cho thấy gel fibrin có khả phân hủy sinh học huyết tương người gel B tồn lâu ngày 264 Hình Phần trăm khối lượng gel fibrin lại ngày Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Kết tạo đường chuẩn Nghiên cứu Y học 65,5%), lớn lượng vancomycin giữ lại gel C (44,8%) Vancomycin pha loãng với nồng độ khác huyết tương thu nhận, sau tạo vòng kháng khuẩn phương pháp Kirby- Bauer Đường chuẩn cho thấy mối quan hệ nồng độ vancomycin đường kính vòng kháng khuẩn xác nhận với độ xác 98,9% (Hình 6) Kết đánh giá khả thải kháng sinh gel fibrin in vitro Kết cho thấy gel A B có khả giải phóng lượng vancomycin tương đương (khoảng 30% lượng vancomycin gel) ngày đầu tiên, gel C thấp (khoảng 14% lượng vancomycin gel) Gel A B có khả giải phóng vancomycin đến ngày, gel C giải phóng vancomycin ngày Kết hình thành biofilm in vitro Nghiên cứu tạo biofilm đĩa 96 giếng polypropylene bao phủ huyết tương người P aeruginosa sinh trưởng môi trường TSB chứa 2% glucose Phân tích SEM cho thấy biofilm trưởng thành hình thành phát triển dày đặc Hình Đường chuẩn thể mối tương quan nồng độ vancomycin đường kính vòng kháng khuẩn đĩa polystyrene với cấu trúc ba chiều nhiều lớp Kết đánh giá khả nạp kháng sinh gel fibrin in vitro crystal violet sinh khối biofilm 24 (Hình 7) Ngoài ra, kết đạt nhuộm 2,798 (>0,652) chứng minh có hình thành Kết cho thấy lượng vancomycin giữ lại gel A B tương đương (67,1% biofilm mạnh A B Hình Sự hình thành biofilm bề mặt đĩa 96 giếng sau 24 A Quan sát kính hiển vi đảo ngược (x100), B Quan sát kính hiển vi điện tử quét (x5.000) Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 265 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Kết đánh giá ảnh hưởng gel fibrin chứa kháng sinh lên hình thành biofilm in vitro Hình Đường cong tăng trưởng vi khuẩn nhóm thí nghiệm Với mục đích phòng ngừa hình thành biofilm in vitro, gel fibrin chứa kháng sinh có khả giải phóng lượng vancomycin lớn vài ngày đầu (khoảng 30%) nhằm ngăn chặn bám dính tế bào vi khuẩn bề mặt đĩa polypropylene Ngoài ra, vancomycin liên tục giải phóng ngày để tiêu diệt tất tế bào vi khuẩn lại Sự tăng sinh vi khuẩn hình thành biofilm (OD570nm