Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 348:1999 áp dụng cho việc bảo quản ngắn hạn nguồn gien vi sinh vật dị dưỡng hiếu khí sử dụng trong nông nghiệp với nguồn vật liệu di truyền là tế bào sinh dưỡng, bào tử trong điều kiện vô trùng bằng phương pháp bảo quản trên môi trường thạch nghiêng và dưới lớp dầu khoáng.
TIÊU CHUẨN NGÀNH 10 TCN 348:1999 BẢO QUẢN NGẮN HẠN NGUỒN GIEN VI SINH VẬT NÔNG NGHIỆP Phạm vi áp dụng: Tiêu chuẩn áp dụng cho việc bảo quản ngắn hạn nguồn gien vi sinh vật dị dưỡng hiếu khí sử dụng nơng nghiệp với nguồn vật liệu di truyền tế bào sinh dưỡng, bào tử điều kiện vô trùng phương pháp bảo quản mơi trường thạch nghiêng lớp dầu khống Thuật ngữ, định nghĩa: 2.1 Nguồn gien vi sinh vật nông nghiệp hiểu nguồn tài nguyên di truyền cơng nghệ bao gồm nhóm chủng vi sinh vật khác vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm men, nấm mốc, vi khuẩn lam đối tượng nghiên cứu sử dụng nông nghiệp (trừ vi sinh vật lĩnh vực thú y, bao gồm chủng khai thác để lai tạo chủng có tiềm kiểm định, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn cho phép sử dụng 2.2 Bảo quản nguồn gien vi sinh vật bảo quản mẫu giống khiết sau chọn lọc, điều kiện phù hợp bảo đảm độ sống sót cao bảo tồn tính trạng ban đầu để sử dụng trường hợp cần thiết 2.3 Bảo quản ngắn hạn bảo quản mẫu giống thời gian năm Trong áp dụng số yếu tố làm giảm tốc độ sinh trưởng nguồn vật liệu di truyền hạ thấp nhiệt độ nuôi cấy, đưa thêm chất ức chế sinh trưởng v.v… 2.4 Đặc tính sinh học khả vi sinh vật thông qua hoạt động sống chúng có tác dụng đến q trình sinh trưởng, phát triển trồng, vật ni, kiểm sốt sinh học sinh thái môi trường 2.5 Môi trường nuôi cấy chọn lọc môi trường phù hợp cho phát triển lồi hay nhóm vi sinh vật thuận lợi hay hồn toàn bất lợi phát triển loài hay nhóm vi sinh vật khác 2.6 Mơi trường chẩn đốn phân biệt (mơi trường thị) mơi trường cho phép phân biệt nhanh chóng lồi vi sinh vật với loài vi sinh vật khác 2.7 Mẫu giống: Mẫu giống giống tác giả chọn lọc, lai tạo hay lấy từ quĩ gien có tính di truyền ổn định - Một mẫu giống vật liệu cần giữ lượng mẫu lặp lại ba lần - Không chọn khuẩn lạc riêng biệt lần cấy chuyển để làm giống (tránh đột biến sinh trưởng) - Việc lấy mẫu tiến hành cho mẫu kiểm tra phải mẫu Người lấy mẫu phải huấn luyện có kinh nghiệm việc lấy mẫu - Trong trình lấy mẫu, vận chuyển xử lý mẫu phải đảm bảo tránh tạp nhiễm từ bên đảm bảo tính nguyên trạng ban đầu 2.8 Thời gian cấy chuyển khoảng thời gian mẫu giống lưu giữ trước cần cấy chuyển, phụ thuộc vào đặc điểm sinh học mẫu vật liệu, phương tiện kinh nghiệm người giữ mẫu giống 2.9 Độ phần trăm sống sót mẫu giống tỷ lệ phần trăm lượng tế bào sống sót mẫu giống bảo quản mẫu giống gốc nuôi cấy phát triển ổn định Độ phần trăm sống sót mẫu giống cho phép định thời gian cấy chuyển mẫu giống 2.10 Hồi phục trình cấy chuyển mẫu bảo quản môi trường dinh dưỡng chọn lọc sau loại bỏ chất ức chế sinh trưởng (dầu parafin) 3 Nội dung: 3.1 Phương pháp bảo quản môi trường thạch nghiêng: 3.1.1 Chuẩn bị: 3.1.1.1 Trang thiết bị: - Tủ sấy (thiết bị tiệt trùng khô) nồi hấp (thiết bị tiệt trùng ướt) - Tủ ấm - Cân kỹ thuật có độ xác tới 0,01g - Que cấy - Que gạt thủy tinh - Ống nghiệm thủy tinh - Ống đong: 100ml, 500ml, 1000ml - Bình tam giác: 250ml, 500ml - Đĩa petri (hộp lồng) - Pipet chia độ: chuyên dùng cho vi sinh có dung tích 1ml; 5ml; 10ml - Đèn cồn đèn gas 3.1.1.2 Chuẩn bị dụng cụ: Các dụng cụ dùng xác định vi sinh vật phải tiệt trùng phương pháp đây: - Trong tủ sấy nhiệt độ từ 160-175oC - Trong nồi hấp 121oC (1 atmotphe) khơng 20 phút 3.1.1.3 Môi trường nuôi cấy: Môi trường nuôi cấy môi trường nuôi cấy chọn lọc (xem mục 3.6) Cân hòa tan thành phần mơi trường nước cất theo thứ tự cho Phân môi trường vào ống nghiệm (5-6ml/ống nghiệm) Đậy nút bông, tiệt trùng 121 oC 30 phút Để nguội môi trường đến 45-50oC, đặt nghiêng ống nghiệm khoảng 45o Đợi bề mặt thạch khô tiến hành cấy giống 3.1.2 Tiến hành: Cấy giống: Từ mẫu giống gốc, thao tác vô trùng cấy ria môi trường nuôi cấy thích hợp Sau tế bào phát triển ổn định, tiến hành cất giữ tủ lạnh hay phòng (có thể dùng giấy bạc túi plastic bao đầu ống giống để tránh nước môi trường) Nhiệt độ cất giữ 4-10oC Định kỳ cấy chuyển Tùy loại giống mà quy định thời gian phải cấy chuyển lại sau 5-7 ngày, 2-4 tuần hay 3-4 tháng 3.1.3 Kiểm tra mẫu giống: Định kỳ sau 12 tháng kiểm tra độ phần trăm sống sót đặc tính sinh học mẫu giống 3.1.3.1 Độ phần trăm sống sót mẫu giống: - Mơi trường để kiểm tra: Môi trường để kiểm tra sử dụng môi trường nuôi cấy chọn lọc Môi trường pha chế theo thứ tự hóa chất thành phần cho, sau phân phối vào dụng cụ thủy tinh chuẩn bị trước khử trùng 121oC 30 phút Để nguội môi trường đến 45-50oC, phân phối môi trường vào đĩa petri khử trùng điều kiện vô trùng - Dịch pha loãng dung dịch muối sinh lý (NaCl 0,85%), khơng chứa hợp chất nitơ, có độ pH 7,0 sau khử trùng 121oC 30 phút Phân phối dịch pha loãng vào ống nghiệm hình tam giác có dung tích thích hợp với lượng cho sau khử trùng, ống nghiệm chứa 9ml bình tam giác chứa 90ml Làm nút khử trùng 121oC 30 phút Nếu chưa sử dụng ngay, dịch pha loãng cần bảo quản tủ lạnh nhiệt độ 4-10 oC, thời gian bảo quản không tháng kể từ ngày chuẩn bị Ghi chú: Để tránh làm ảnh hưởng đến vi sinh vật thay đổi nhiệt độ đột ngột, nên điều chỉnh nhiệt độ dịch pha lỗng đến nhiệt độ phòng thử nghiệm - Chuẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn (suspension): Lấy ống giống bảo quản cần kiểm tra khỏi nhiệt độ bảo quản, để nhiệt độ ống giống bảo quản nhiệt độ phòng thí nghiệm bắt đầu tiến hành kiểm tra Lấy sinh khối vi sinh từ ống giống đưa vào bình tam giác chứa 90ml dịch pha lỗng, trộn lắc tay hay thiết bị lắc học để đảm bảo vi sinh vật phân bố đồng Dung dịch tạo gọi dịch huyền phù vi khuẩn ban đầu Dùng pipet vô trùng lấy 1ml dịch huyền phù ban đầu cho vào ml dịch pha loãng, tránh chạm pipet vào dịch pha loãng Trộn kỹ cách dùng pipet vô trùng khác hút lên xuống 10 lần dụng cụ trộn học 5-10 giây, tần số quay dụng cụ chọn cho chất lỏng cuộn xoáy dâng lên cách mép lọ chứa khoảng 2-3 cm để có dung dịch pha loãng 10-2 Lặp lại thao tác để thu dịch pha loãng 10 -3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8 Cấy mẫu: dùng pipet vô trùng riêng cho độ pha loãng, lấy từ dịch mẫu lượng mẫu dịch 0,05 ml (1 giọt) cấy vào đĩa petri chứa môi trường chuẩn bị sẵn (xem 3.1.3.1) Mỗi mẫu cấy lặp lại đĩa petri Dùng que gạt vô trùng gạt để dịch mẫu dàn trải bề mặt thạch, đợi khô bề mặt thạch, úp ngược đĩa petri, nuôi tủ ấm nhiệt độ thời gian thích hợp Đếm số lượng khuẩn lạc đặc trưng mẫu giống chủng giống vi sinh vật đĩa petri Mật độ vi sinh vật đơn vị kiểm tra (gam hay ml) tính theo cơng thức sau: a x 20 A= d Trong đó: A: số khuẩn lạc/ml dịch a: số khuẩn lạc trung bình có đĩa petri d: nồng độ dịch pha loãng 20: số giọt dịch ml dịch Ghi chú: Số lượng khuẩn lạc trung bình tính trung bình cộng số khuẩn lạc đĩa petri cấy từ độ pha lỗng, tính đĩa petri chứa 30-300 khuẩn lạc Số lượng khuẩn lạc trung bình tính trung bình cộng số lượng khuẩn lạc đĩa petri cấy từ hai độ pha lỗng cách tính số khuẩn lạc trung bình cộng độ pha lỗng, số khuẩn lạc độ pha lỗng cao nhân với 10, sau lấy trung bình cộng hai giá trị tỷ số giá trị lớn giá trị nhỏ không lớn Nếu tỷ số lớn lấy giá trị nhỏ làm kết Mật độ vi sinh vật đơn vị kiểm tra biểu thị số 1,00 9,99 nhân với 10n, n số mũ thích hợp % độ sống sót = Số lượng tế bào mẫu giống bảo quản Số lượng tế bào mẫu giống gốc x 100 3.1.3.2 Xác định đặc tính sinh học: Tiến hành theo phương pháp cụ thể (phụ thuộc vào khả sinh hoạt tính nhóm chủng vi sinh vật) 3.2 Phương pháp bảo quản lớp dầu khoáng 3.2.1 Chuẩn bị: 3.2.1.1 Trang thiết bị, dụng cụ: xem 3.1.1.1 3.2.1.2 Chuẩn bị dụng cụ: xem 3.1.1.2 3.2.1.3 Môi trường nuôi cấy: - Chuẩn bị môi trường: xem 3.1.1.3 - Dầu parafin có tỷ trọng 0,865-0,890 khử trùng 121 oC 30 phút, sau để nhiệt độ phòng cho bay lẫn dầu 3.2.2 Tiến hành: Cấy giống: xem 3.1.2 Khi tế bào phát triển ổn định, thao tác vô trùng đổ parafin chuẩn bị 3.2.1.3 lên bề mặt thạch nghiêng cấy giống cho dựng đứng ống thạch lên bề mặt lớp dầu khoáng cách mép lớp thạch khoảng cm Ống giống đưa vào bảo quản phải đạt độ khiết 100% Nhiệt độ cất giữ 4-10oC, định kỳ cấy chuyển sau 12 tháng 3.2.3 Kiểm tra mẫu giống: Định kỳ sau 12 tháng kiểm tra độ phần trăm sống sót đặc tính sinh học mẫu giống 3.2.3.1 Độ phần trăm sống sót mẫu giống: xem 3.1.3.1 Trước lấy sinh khối vi sinh vật để chuẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn cần loại bỏ tồn lớp dầu khống cách dùng pipet hút hết dầu khống, sau dùng giấy lọc thấm khơ hết dầu khống dính bề mặt ống giống 3.2.3.2 Xác định đặc tính sinh học mẫu giống: xem 3.1.3.2 Ghi chú: Chỉ cho phép giữ lại mẫu giống có phần trăm độ sống sót cao, có hoạt tính sinh học ổn định mẫu giống gốc Các mẫu giống cấy chuyển lại môi trường nuôi cấy tiếp tục bảo quản ... pha loãng 10 -3, 10- 4, 10- 5, 10- 6, 10- 7, 10- 8 Cấy mẫu: dùng pipet vô trùng riêng cho độ pha loãng, lấy từ dịch mẫu lượng mẫu dịch 0,05 ml (1 giọt) cấy vào đĩa petri chứa môi trường chuẩn bị sẵn... - Ống đong: 100 ml, 500ml, 100 0ml - Bình tam giác: 250ml, 500ml - Đĩa petri (hộp lồng) - Pipet chia độ: chuyên dùng cho vi sinh có dung tích 1ml; 5ml; 10ml - Đèn cồn đèn gas 3.1.1.2 Chuẩn bị dụng... trùng khác hút lên xuống 10 lần dụng cụ trộn học 5 -10 giây, tần số quay dụng cụ chọn cho chất lỏng cuộn xoáy dâng lên cách mép lọ chứa khoảng 2-3 cm để có dung dịch pha loãng 10- 2 Lặp lại thao tác