Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 349:1999 áp dụng cho việc bảo quản dài hạn nguồn gien vi sinh vật dị dưỡng hiếu khí và vi hiếu khí sử dụng trong nông nghiệp với nguồn vật liệu di truyền là tế bào sinh dưỡng, bào tử trong điều kiện vô trùng bằng phương pháp đông khô.
TIÊU CHUẨN NGÀNH 10 TCN 349:1999 BẢO QUẢN DÀI HẠN NGUỒN GIEN VI SINH VẬT NÔNG NGHIỆP BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG KHÔ Phạm vi áp dụng: Tiêu chuẩn áp dụng cho việc bảo quản dài hạn nguồn gien vi sinh vật dị dưỡng hiếu khí vi hiếu khí sử dụng nơng nghiệp với nguồn vật liệu di truyền tế bào sinh dưỡng, bào tử điều kiện vô trùng phương pháp đông khô Thuật ngữ, định nghĩa: 2.1 Nguồn gien vi sinh vật nông nghiệp hiểu nguồn tài nguyên di truyền cơng nghệ bao gồm nhóm chủng vi sinh vật khác vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm men, nấm mốc, vi khuẩn lam khác đối tượng nghiên cứu sử dụng nông nghiệp (trừ vi sinh vật lĩnh vực thú y), bao gồm chủng khai thác để lai tạo chủng có tiềm kiểm định, Bộ Nông nghiệp - PTNT cho phép sử dụng 2.2 Bảo quản nguồn gien vi sinh vật bảo quản mẫu giống khiết sau chọn lọc, điều kiện phù hợp bảo đảm độ sống sót cao bảo tồn tính trạng ban đầu để sử dụng trường hợp cần thiết 2.3 Bảo quản dài hạn bảo quản mẫu giống thời gian năm 2.4 Đặc tính sinh học khả vi sinh vật thông qua hoạt động sống chúng có tác dụng đến q trình sinh trưởng, phát triển trồng, vật nuôi, kiểm sốt sinh học sinh thái mơi trường 2.5 Mơi trường nuôi cấy chọn lọc môi trường phù hợp cho phát triển lồi hay nhóm vi sinh vật thuận lợi hay hoàn toàn bất lợi phát triển lồi hay nhóm vi sinh vật khác 2.6 Mơi trường chẩn đốn phân biệt (mơi trường thị) mơi trường cho phép phân biệt nhanh chóng lồi vi sinh vật với loài vi sinh vật khác 2.7 Mẫu giống: - Mẫu giống giống tác giả chọn lọc, lai tạo hay lấy từ quĩ gien có tính di truyền ổn định - Một mẫu giống vật liệu cần giữ lượng mẫu lặp lại ba lần - Không chọn vi khuẩn lạc riêng biệt lần cấy chuyển làm giống (tránh đột biến sinh trưởng) - Việc lấy mẫu tiến hành cho mẫu kiểm tra phải mẫu - Người lấy mẫu phải huấn luyện có kinh nghiệm việc lấy mẫu - Trong trình lấy mẫu, vận chuyển xử lý mẫu phải đảm bảo tránh tạp nhiễm từ bên đảm bảo tính nguyên trạng ban đầu 2.8 Thời gian cấy chuyển khoảng thời gian mẫu giống lưu giữ trước cần cấy chuyển, phụ thuộc vào đặc điểm sinh học mẫu vật liệu, phương tiện kinh nghiệm người giữ mẫu giống 2.9 Độ phần trăm sống sót mẫu giống tỷ lệ phần trăm lượng tế bào sống sót mẫu giống bảo quản mẫu giống gốc nuôi cấy phát triển ổn định Độ phần trăm sống sót mẫu giống cho phép định thời gian cấy chuyển mẫu giống 2.10 Hồi phục trình cấy chuyển mẫu đông khô môi trường dinh dưỡng chọn lọc Nội dung: 3.1 Chuẩn bị: 3.1.1 Trang thiết bị: - Tủ sấy (thiết bị tiệt trùng khô) nồi hấp (thiết bị tiệt trùng ướt) - Tủ ấm - Máy đơng khơ - Cân kỹ thuật có độ xác tới 0,01g - Que cấy - Que gạt thủy tinh - Lọ đơng khơ (có nút cao su) ampul thủy tinh trung tính - Ống nghiệm thủy tinh - Ống đong: 100ml, 500ml, 1000ml - Bình tam giác: 250ml, 500ml - Đĩa petri (hộp lồng) - Pipet chia độ: chuyên dùng cho vi sinh có dung tích 1ml, 5ml, 10ml - Đèn cồn đèn gas 3.1.2 Chuẩn bị dụng cụ: - Các dụng cụ dùng xác định vi sinh vật phải tiệt trùng phương pháp đây: + Trong tủ sấy nhiệt độ từ 160-175oC + Trong nồi hấp 121oC (1 atmotphe) khơng 20 phút - Chuẩn bị lọ đông khô (hoặc ampul): ngâm HCl 2% 12 Sau rửa lại nước máy 3-4 lần tráng lại nước cất vô trùng 3.1.3 Chuẩn bị môi trường: - Môi trường nuôi cấy sinh khối kiểm tra độ phần trăm sống sót mẫu giống mơi trường nuôi cấy chọn lọc (xem mục 2.5) Cân hòa tan thành phần mơi trường nước cất theo thứ tự cho Phân phối môi trường vào bình tam giác Đậy nút bơng, tiệt trùng 121 oC 30 phút - Môi trường bảo vệ: có thành phần sau: sữa tách bơ 20%, Saccharoza 10%, Gelalin 1% Môi trường bảo vệ cần tiệt trùng phương pháp Pasteur, màng lọc vi khuẩn 121oC 15 phút 3.2 Tiến hành: 3.2.1 Tạo sinh khối vi sinh vật: Các mẫu giống ni cấy mơi trường ni cấy thích hợp (dạng dịch thể hay thạch nghiêng) Sau tế bào phát triển tốt, ổn định, thu sinh khối vi sinh vật để tiến hành đông khô 3.2.2 Chuẩn bị dịch huyền phù cho đông khô: - Cho sinh khối vi sinh vật vào môi trường bảo vệ Trộn để thu dịch huyền phù đồng nhất, đảm bảo 108 tế bào/ml - Dùng pipet vô trùng hút 1ml dịch huyền phù nhỏ đáy lọ đông khô (hoặc ampul) Tiến hành thao tác điều kiện vô trùng, không để rây vi sinh vật lên mép thành lọ đông khô (hoặc ampul) 3.2.3 Quá trình đơng khơ: tiến hành sau: - Pha 1: Hạ băng: Từ 20oC xuống -35oC - Pha 2: Đông khô: Từ -35oC đến -10oC 18 Từ -10oC đến 25oC - Pha 1: Làm kiệt: Duy trì 25oC 3.2.4 Quy định chất lượng đông khô: - Vùng nhiệt sử dụng (từ -35oC đến -25oC): nằm vùng cho phép, vi sinh vật không bị tổn thương Sau mẻ đông khô cần kiểm tra độ sống sót vi sinh vật, độ tạp nhiễm trước sau đơng khơ - Ống đơng khơ có độ chân không gần tuyệt đối (kiểm tra đèn cực tím) - Ẩm độ sản phẩm sau đơng khơ nhỏ 4% - Cấu trúc vật lý: xốp, không vỡ - Tan cho dung môi vào sản phẩm đông khô - Không bị biến màu 3.2.5 Bảo quản: Mẫu đông khô bảo quản tủ lạnh nhiệt độ 4-10 oC chỗ tối mát 3.3 Kiểm tra mẫu giống: Định kỳ sau 1-5 năm kiểm tra độ phần trăm sống sót đặc tính sinh học mẫu giống 3.3.1 Độ phần trăm sống sót mẫu giống: 3.3.1.1 Mơi trường để kiểm tra: Môi trường để kiểm tra sử dụng môi trường nuôi cấy chọn lọc Môi trường pha chế theo thứ tự hóa chất thành phần cho Sau phân phối vào dụng cụ thủy tinh chuẩn bị trước khử trùng 121oC 30 phút Để nguội môi trường đến 45-50oC, phân phối môi trường vào đĩa petri khử trùng điều kiện vô trùng 3.3.1.2 Dịch pha lỗng, dung dịch muối sinh lý (NaCl 0,85%), khơng chứa hợp chất nitơ, có độ pH 7,0 sau khử trùng 121oC 30 phút Phân phối dịch pha lỗng vào ống nghiệm có dung tích thích hợp với lượng cho sau khử trùng, ống nghiệm chứa 9ml Làm nút khử trùng 121 oC 30 phút Nếu chưa sử dụng ngay, dịch pha loãng cần bảo quản tủ lạnh nhiệt độ 4-10 oC, thời gian bảo quản không tháng kể từ ngày chuẩn bị Ghi chú: Để tránh làm ảnh hưởng đến vi sinh vật thay đổi nhiệt độ đột ngột, nên điều chỉnh nhiệt độ dịch pha loãng đến nhiệt độ phòng thử nghiệm 3.3.1.3 Chuẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn (suspension): Lấy ống giống bảo quản cần kiểm tra khỏi nhiệt độ bảo quản, tiến hành kiểm tra nhiệt độ ống giống bảo quản nhiệt độ phòng thí nghiệm + Từ ống nghiệm đông khô dạng ampul: - Sát trùng ampul gạc tẩm cồn - Cưa ngang ampul vào chỗ nút bên - Dùng đầu đũa thủy tinh nóng đỏ để bẻ ampul, bọc gạc quanh ampul giống bẻ gãy vị trí cưa Phải cẩn thận tránh gạc ướt, cồn bị sộc vào chủng giống ống chân không bị bẻ - Cho phép khơng khí vào ống nghiệm từ chỗ bẻ Nếu mở khơng tốt, nút bị đẩy sát vào đáy ống giống phần tinh khiết dịch đơng khơ bị lộ khơng khí - Bỏ đầu ampul giống nút kẹp vơ trùng Nếu khơng lấy cẩn thận, nút gây nhiễm trùng ống giống đông khô - Đốt nóng đầu mở ampul - Dùng bơm tiêm vơ trùng thêm ml môi trường dinh dưỡng dịch thể tương ứng vào ampul giống để hydrat hóa chủng giống Lắc kỹ 20 phút để đảm bảo tế bào phân bố đồng Dung dịch tạo gọi dịch huyền phù ban đầu + Từ ống đơng khơ dạng lọ có nút cao su: - Sát trùng lọ gạc tẩm cồn - Dùng bơm tiêm vô trùng thêm ml môi trường dinh dưỡng dịch thể tương ứng vào lọ giống (qua nút cao su) để hydrat hóa chủng giống Lắc kỹ 20 phút để đảm bảo tế bào phân bố đồng Dung dịch tạo gọi dịch huyền phù ban đầu - Dùng bơm tiêm vô trùng hút toàn dịch huyền phù ban đầu (1ml) cho vào 9ml dịch pha loãng, tránh chạm bơm tiêm vào dịch pha loãng Trộn kỹ cách dùng pipet vô trùng khác hút lên xuống 10 lần dụng cụ trộn học 5-10 giây, tần số quay dụng cụ chọn cho chất lỏng cuộn xoáy dâng lên cách mép lọ chứa khoảng 2-3 cm để có dung dịch pha loãng 10-2 Lặp lại thao tác để thu dịch pha loãng 10 -3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 Cấy mẫu: dùng pipet vô trùng riêng cho độ pha loãng, lấy từ dịch mẫu lượng mẫu dịch 0,05 ml (1 giọt) cấy vào đĩa petri chứa môi trường chuẩn bị sẵn (xem 3.3.1) Mỗi mẫu cấy lặp lại đĩa petri Dùng que gạt vô trùng gạt để dịch mẫu dàn trải bề mặt thạch, đợi khô bề mặt thạch, úp ngược đĩa petri, nuôi tủ ấm với nhiệt độ thời gian thích hợp Đếm số lượng khuẩn lạc đặc trưng mẫu giống chủng giống vi sinh vật đĩa petri Mật độ vi sinh vật đơn vị kiểm tra (gam hay ml) tính theo cơng thức sau: a x 20 A= d Trong đó: A: số khuẩn lạc/ml dịch a: số khuẩn lạc trung bình có đĩa petri d: nồng độ dịch pha loãng 20: số giọt dịch ml dịch Ghi chú: Số lượng khuẩn lạc trung bình tính trung bình cộng số khuẩn lạc đĩa petri cấy từ độ pha lỗng, tính đĩa petri chứa từ 30-300 khuẩn lạc Số lượng khuẩn lạc trung bình tính trung bình cộng số lượng khuẩn lạc đĩa petri cấy từ hai độ pha lỗng cách tính số khuẩn lạc trung bình cộng độ pha lỗng, số khuẩn lạc độ pha lỗng cao nhân với 10, sau lấy trung bình cộng hai giá trị tỷ số giá trị lớn giá trị nhỏ không lớn Nếu tỷ số lớn lấy giá trị nhỏ làm kết Mật độ vi sinh vật đơn vị kiểm tra biểu thị số 1,00 9,99 nhân với 10n, n số mũ thích hợp % độ sống sót = Số lượng tế bào mẫu giống bảo quản x 100 Số lượng tế bào mẫu giống gốc 3.3.2 Xác định đặc tính sinh học: Tiến hành theo phương pháp cụ thể (phụ thuộc vào khả sinh hoạt tính nhóm chủng vi sinh vật) Ghi chú: Chỉ cho phép giữ lại mẫu giống có phần trăm độ sống sót cao, có hoạt tính sinh học ổn định mẫu giống gốc Các mẫu giống cấy chuyển lại môi trường nuôi cấy tiếp tục bảo quản ... dịch pha loãng 10 -3, 10- 4, 10- 5, 10- 6, 10- 7 Cấy mẫu: dùng pipet vơ trùng riêng cho độ pha lỗng, lấy từ dịch mẫu lượng mẫu dịch 0,05 ml (1 giọt) cấy vào đĩa petri chứa môi trường chuẩn bị sẵn (xem... - Ống đong: 100 ml, 500ml, 100 0ml - Bình tam giác: 250ml, 500ml - Đĩa petri (hộp lồng) - Pipet chia độ: chuyên dùng cho vi sinh có dung tích 1ml, 5ml, 10ml - Đèn cồn đèn gas 3.1.2 Chuẩn bị dụng... trùng khác hút lên xuống 10 lần dụng cụ trộn học 5 -10 giây, tần số quay dụng cụ chọn cho chất lỏng cuộn xoáy dâng lên cách mép lọ chứa khoảng 2-3 cm để có dung dịch pha lỗng 10- 2 Lặp lại thao tác