Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 731-2006 về thịt và các sản phẩm của thịt - Xác định tổng số Bacillus cereus quy định quy trình để xác định tổng số Bacillus cereus trong thịt và sản phẩm của thịt. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN 10TCN TIÊU CHUẨN NGÀNH 10 TCN 7312006 THỊT VÀ CÁC SẢN PHẨM CỦA THỊTXÁC ĐỊNH TỔNG SỐ BACILLUS CEREUS (Meat and meat products Enumeration of Bacillus cereus) 10 TCN 7312006 Hà Nội 2006 TIÊU CHUẨN NGÀNH 10 TCN 7312006 THỊT VÀ CÁC SẢN PHẨM CỦA THỊTXÁC ĐỊNH TỔNG SỐ BACILLUS CEREUS (Meat and meat products Enumeration of Bacillus cereus) (Ban hành kèm theo Quyết định số QĐ/BNNKHCN ngày tháng 6 năm 2006 của Bộ trưởng Bộ Nơng nghiệp và Phát triển nơng thơn) 1. Phạm vi áp dụng Qui trình này để xác định tổng số Bacillus cereus trong thịt và sản phẩm của thịt 2. Định nghĩa Bacillus cereus là vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm nguy hiểm với các triệu chứng nơn mửa và tiêu chảy. B. cereus là vi khuẩn hình gậy, gram dương có nha bào, sản sinh men lecithinase, phản ứng VP và catalase dương tính. Phần lớn các chủng có phản ứng oxidase âm tính 3. Thiết bị, dụng cụ thuỷ tinh và giống vi khuẩn 3.1. Thiết bị và dụng cụ thuỷ tinh 3.1.1. Tủ lạnh 3.1.2 Tủ sấy 3.1.3. Tủ ấm 3.1.4. Máy đồng nhất mẫu (Stomacher) 3.1.5. Máy trộn tốc độ cao (Vortex) 3.1.6. Nồi hấp cách thuỷ 3.1.7. Nồi hấp áp lực 3.1.8. Đèn Bunse loại nhỏ và lớn 3.1.9. Kính hiển vi 3.1.10. Bình ni cấy yếm khí 3.1.11. Que cấy vòng (đường kính 34mm) 3.1.12. Đèn cồn 3.1.13. Dụng cụ thuỷ tinh Bình thuỷ tinh 1000ml, 500ml và 200ml Ống đong 10 TCN 7312006 Pipet các loại 25ml, 10ml, 5ml và 1ml, được chia vạch 0,5ml và 0,1ml Ống nghiệm 13x100mm và 16x125mm Đĩa petri tiệt trùng Phiến kính soi tiêu bản 3.2. Giống vi khuẩn Chủng chuẩn Bacillus cereus 4. Mơi trường ni cấy và thuốc thử (xem phần phụ lục) 4.1. Nước pepton 4.2. Thạch MannitolEgg YolkPolymyxin (MYP) 4.3. Mơi trường và thuốc thử phản ứng VogesProskauer (VP) 4.4. Mơi trường kiểm tra đặc tính di động 4.5. Thuốc nhuộm gram 4.6. Thạch dinh dưỡng 4.7. Thuốc thử của phản ứng catalase 4.8. Thuốc thử của phản ứng oxidase 5. Lấy mẫu Theo TCVN 4833 2002 6. Cách tiến hành Tiến hành ni cấy chủng chuẩn Bacillus cereus tuần tự theo qui trình ni cấy mẫu để kiểm tra chất lượng mơi trường và phương pháp 6.1. Đồng nhất mẫu Cân 25g mẫu cho vào túi polymer chun dùng kèm máy stomacher, thêm 225ml dung dịch pha lỗng pepton (4.1.) Sử dụng máy đồng nhất mẫu (stomacher) làm đồng nhất mẫu trong khoảng thời gian 2 phút. Mẫu trong túi đồng nhất có độ pha lỗng là 101 Tiếp tục pha lỗng mẫu bằng dung dịch (4.1.) theo cơ số 10 6.2. Ni cấy phân lập Mỗi nồng độ pha loãng được cấy vào 2 đĩa thạch MYP (4.2), mỗi đĩa 0,1ml, láng đều dung dịch mẫu trên mặt thạch. Đặt các đĩa thạch đã cấy mẫu ở 35370C trong 24h. Kiểm tra các đĩa thạch. Các khuẩn lạc B.cereus giả định là các khuẩn lạc lớn, màu hồng nhạt được bao quanh bởi một vùng kết tủa do hoạt động của men lecithinase. Một số chủng B.cereus chỉ sinh ít hoặc khơng sinh lecithinase sẽ khơng có vùng kết tủa bao quanh. Các khuẩn lạc này cũng cần được thử khẳng định. Đếm các khuẩn lạc điển hình và khơng điển hình trên các đĩa ở hai nồng độ pha lỗng liên tiếp 6.3. Khẳng định vi khuẩn 6.3.1. Đánh giá vi khuẩn học 10 TCN 7312006 * Ni cấy trên thạch dinh dưỡng Lấy vài khuẩn lạc nghi ngờ là B.cereus ở (6.2.) cấy chuyển vào các ống thạch dinh dưỡng nghiêng (4.6), ủ ấm ở 35370C trong 24h. * Nhuộm gram Lấy khuẩn lạc mọc trên thạch nghiêng (6.3.1) nhuộm gram và kiểm tra hình thái vi khuẩn. Q trình nhuộm tiến hành trong vòng 34 phút, rồi đọc kết quả. B.cereus bắt màu tím, nên là vi khuẩn gram dương, trong vi trường chúng xếp dạng chuỗi ngắn hoặc dài * Nhuộm nha bào Nha bào có hình oval, nhân ở phần đi nhưng khơng làm biến dạng thân vi khuẩn 6.3.2. Khẳng định bằng các phản ứng sinh hố * Pha lỗng khuẩn lạc Lấy khuẩn lạc từ các ống thạch nghiêng (6.3.1) chuyển vào các ống nghiệm có chứa 0,5ml dung dịch pha lỗng pepton (4.1), trộn đều vi khuẩn bằng máy trộn vortex Tiếp tục cấy chuyển vào các mơi trường sau để làm phản ứng sinh hố * Phản ứng VP Lấy đầy 1 vòng que cấy canh khuẩn (10 l), cấy chuyển vào mơi trường VP (4.3.1) và để 350C trong 48 2h. Sau đó lấy 1ml canh khuẩn cho vào ống nghiệm kích thước 16x125 mm và thêm vào 0,6 ml dung dịch alphanaphthol và 0,2 ml potasium hydroxide 40% (4.3.2). Lắc đều và thêm vào một vài tinh thể creatine (4.3.3). Để tại nhiệt độ phòng và đọc kết quả sau 1 giờ. Phản ứng dương tính khi có mầu hồng hoặc màu tím xuất hiện * Thử phản ứng catalase Lấy một khuẩn lạc điển hình và hồ vào một giọt dung dịch hydro peroxit 3% trên phiến kính. Đọc kết quả trong vòng 1 phút, khi thấy có tạo bọt khí chứng tỏ là phản ứng dương tính * Thử phản ứng oxidase Nhỏ thuốc thử oxidase, đọc kết quả trong vòng 1 phút, nếu phản ứng dương tính khuẩn lạc biến đổi sang mầu hồng và chuyển dần sang mầu tím. Khuẩn lạc khơng đổi màu là phản ứng âm tính. B.cereus có phản ứng oxidase âm tính * Kiểm tra đặc tính di động Lấy đầy 1 vòng que cấy canh khuẩn (10 l) cấy trích sâu xuống giữa mơi trường di động (4.4), đặt ống nghiệm 300C trong 1824h. Các vi khuẩn di động sẽ mọc lộn xộn xung quanh đường cấy. Hầu hết các chủng B.cereus và B.thuringiensis là di động, chỉ có một vài chủng B.cereus và B.anthracis là khơng di động 6.4. Các tiêu chuẩn khẳng định B.cereus Nhuộm gram Nhuộm nha bào Gram dương, hình gậy hình oval, nhân ở phần đi, khơng làm biến dạng vi khuẩn 10 TCN 7312006 Phản ứng catalase dương tính Phản ứng VP dương tính Phản ứng oxidase âm tính Đặc tính di động phần lớn các chủng B. cereus di động 7. Biểu thị kết quả 7.1 Trường hợp chung 7.1.1 Tính số lượng a của B.cereus có phản ứng dương tính với các test sinh hố (6.3.2.) đã nhận dạng trên mỗi đĩa đã chọn Trên mỗi đĩa, tính số lượng a các B.cereus có phản ứng dương tính với test sinh hố (6.3.2.) đã nhận dạng, theo cơng thức: a bc xc c Ac bnc xc nc Anc trong đó Ac là số lượng khuẩn lạc điển hình đã qua test sinh hố (6.3.2.); Anc là số lượng khuẩn lạc khơng điển hình đã qua test sinh hố (6.3.2.); bc là số lượng khuẩn lạc điển hình cho thấy có phản ứng dương tính với các test sinh hố; bnc là số lượng khuẩn lạc khơng điển hình cho thấy có phản ứng dương tính với các test sinh hố; cc là tổng số khuẩn lạc điển hình nhìn thấy trên đĩa (6.3.2); cnc là tổng số khuẩn lạc khơng điển hình nhìn thấy trên đĩa (6.3.2); Lấy kết quả tròn số [Xem TCVN 6404 (ISO 7218)] 7.1.2 Tính số lượng N B.cereus có phản ứng dương tính qua test sinh hố (6.3.2.) đã được nhận dạng có mặt trong phần mẫu thử Đối với các đĩa có chứa tối đa 300 khuẩn lạc, có 150 khuẩn lạc điển hình và/ hoặc khơng điển hình ở hai độ pha lỗng liên tiếp, thì tính số lượng B.cereus có phản ứng dương tính qua test sinh hố (6.3.2.) đối với mỗi đĩa theo qui định trong (7.1.1) tính số N B.cereus có phản ứng dương tính qua test sinh hố (6.3.2) được nhận biết có mặt trong mẫu thử, là trung bình thu được từ hai độ lỗng liên tiếp, bằng cơng thức sau: N a V (n1 0,1n2 )d 10 TCN 7312006 trong đó a là tổng số khuẩn lạc B.cereus có phản ứng dương tính qua test sinh hố (6.3.2.) đã nhận biết trên tất cả các đĩa đã chọn V là thể tích của chất cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit; n1 là số đĩa đã được chọn ở độ pha lỗng thứ nhất; n2 là số đĩa đã được chọn ở độ pha lỗng thứ hai; d là độ pha lỗng tương ứng với dung dịch pha lỗng thứ nhất đã chọn (huyền phù ban đầu là một độ pha lỗng) Làm tròn các kết quả đã tính đến hai chữ số có nghĩa [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] Báo cáo kết quả theo số B.cereus có phản ứng dương tính qua test sinh hố (6.3.2.) trong 1 gam được biểu thị theo số từ 1,0 đến 9,9 nhân 10x, trong đó x là luỹ thừa tương ứng của 10 7.2 Ước tính các số lượng nhỏ 7.2.1 Nếu hai đĩa, tương ứng với mẫu thử (sản phẩm dạng lỏng) hoặc huyền phù ban đầu (sản phẩm ở dạng khác), mỗi đĩa chứa ít hơn 15 khuẩn lạc đã được nhận biết thì báo cáo các kết quả như sau: a) Đối với các sản phẩm dạng lỏng, số B.cereus có phản ứng dương tính (6.3.2.) trong một mililit được ước tính như sau: Ne a V trong đó a là tổng số khuẩn lạc B.cereus nhận biết được (7.1.1) trên hai đĩa đã chọn; V là thể tích cấy lên mỗi đĩa b) Đối với các sản phẩm dạng khác, số B.cereus có phản ứng dương tính trong một gam được ước tính như sau: Ne a V d trong đó 10 TCN 7312006 a là tổng số khuẩn lạc B.cereus có phản ứng dương tính (6.3.2.) nhận biết được trên hai đĩa đã chọn; d là độ pha lỗng của huyền phù ban đầu; V là thể tích cấy lên mỗi đĩa 7.2.2 Nếu hai đĩa tương ứng khi cấy 0,1 ml (trường hợp chung là 0,1 ml dịch cấy) mẫu thử (sản phẩm dạng lỏng) hoặc huyền phù ban đầu (sản phẩm dạng khác) khơng chứa bất kỳ khuẩn lạc B.cereus nào có phản ứng dương tính (6.3.2.) thì báo cáo kết quả như sau ; − Ít hơn 10 B.cereus có phản ứng dương tính (6.3.2.) trong một mililit (sản phẩm dạng lỏng); Ít hơn 10/d B.cereus có phản ứng dương tính (6.3.2.) trong một gam (sản phẩm dạng khác), trong đó d là độ pha lỗng của huyền phù ban đầu 7.2.3. Nếu cấy 1 ml mẫu, thì báo cáo kết quả như sau: − Ít hơn 1 B.cereus có phản ứng dương tính (6.3.2.) trong một mililit (sản phẩm dạng lỏng); − Ít hơn 1/d B.cereus có phản ứng dương tính (6.3.2.) trong một gam (sản phẩm dạng khác) 8. Tài liệu tham khảo 8.1. Microbiologycal method for meat industry 1991 New Zealand 8.2. TCVN 6404: 1998 (ISO 7218: 1997) Vi sinh vật học – Ngun tắc chung về kiểm tra vi sinh vật 8.3. TCVN 4833: 2002 Lấy mẫu thịt KT. BỘ TRƯỞNG THỨ TRƯỞNG Bùi Bá Bổng 10 TCN 7312006 Phụ lục 4. Môi trường nuôi cây và thuốc thử 4.1. Nước pepton Thành phần: Peptone NaCl Nước cất 1,0g 8,5g 1000ml Cách pha chế Hồ tan các thành phần vào nước cất, điều chỉnh pH sao cho sau khi hấp tiệt trùng pH là 7,2 + 0,2. Đóng 225ml mơi trường vào các bình tam giác. Hấp ướt ở 121 oC trong 15 phút. Mơi trường được bảo quản ở 4100 C, sử dụng được trong 1 tháng 4.2. Thạch mannitol Egg Yolk Polymyxin (MYP) 4.2.1. Mơi trường cơ sở Thành phần: Cao thịt bò Pepton từ casein Dmannitol NaCl Phenol đỏ Thạch Nước cất 1,0 g 10,0 g 10,0 g 10,0 g 0,025 g 12 g đến 18 g a 900 ml a Tuỳ thuộc vào khả năng đơng của thạch Cách pha chế Cho các thành phần chất khơ vào nước, đun nóng và khuấy đều để hồ tan các chất Chỉnh pH để sau khi tiệt trùng mơi trường có pH là 7,2 0,2, rót từ 225ml đến 500 ml vào 10 TCN 7312006 các bình tam giác. Hấp ướt ở 1210C trong 15 phút. Bảo quản ở 4100C mơi trường có thể sử dụng được trong vòng 1 tháng 4.2.2. Thành phần bổ sung 1 (dung dịch polymixin B 0,1%) Cách pha chế: Hồ tan 500,000 đơn vị polymixin B sulfate ngun chất vào 50ml nước cất. Bảo quản trong lọ thuỷ tinh dung tích 85ml ở 40C 4.2.3. Thành phần bổ sung 2 (Dung dịch lòng đỏ trứng) Cách pha chế: Rửa 2 quả trứng tươi bằng bàn chải cứng và làm khơ. Ngâm trứng trong dung dịch cloramin 0,1% trong 1 giờ. Đổ dung dịch cloramin đi và thay bằng dung dịch Ethanol 70% ngâm trứng 30 phút. Đập trứng một cách vơ trùng, gạn lấy lòng đỏ. Thêm 1 lượng nước muối 0,85 % vơ trùng vào lòng đỏ trứng theo tỷ lệ 1:1, trộn đều. Bảo quản nước trứng ở 40 C có thể sử dụng trong 1 tuần 4.2.4.Mơi trường hồn chỉnh Thêm 2,5ml polymixin B và 12,5ml dung dịch nước trứng vào 225ml dung dịch cơ sở (4.2.1) đã đun tan chảy và làm nguội đến 500C. Trộn đều rót 18ml mơi trường vào đĩa petri kích cỡ 15x100mm. Để mơi trường ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng 24 giờ 4.3. Mơi trường và thuốc thử VogesProskauer (VP) 4.3.1. Môi trường VP Thành phần: Peptone proteose Glucose NaCl Nước cất 7,0g 5,0g 5,0g 1000ml Cách pha chế: Đun nóng để hồ tan các thành phần trong 1000ml nước cất, điều chỉnh để cuối cùng mơi trường có pH là 6,5 0,2. Đóng 5ml mơi trường vào ống nghiệm, hấp ướt 10 phút ở 1210 C. Mơi trường được bảo quản ở 4 100C dùng được trong 1 tháng. 4.3.2. Thuốc thử VP Thành phần: Dung dịch 1: aNaphtol 5,0g Cồn tuyệt đối 100ml Dung dịch 2: Potassium hydroxide 40,0g Nước cất vừa đủ 100ml 4.3.3. Tinh thể creatine 10 TCN 7312006 4.4. Mơi trường kiểm tra đặc tính di động Thành phần: Trypticase Men bia Glucose Na2HPO4 Thạch Nướt cất 10,0g 2,5 g 5,0g 2,5g 3,0g 1000ml Cách pha chế: Cho các thành phần vào nước đun sơi để hồ tan tất cả các chất, điều chỉnh pH sao cho sau khi hấp tiệt trùng pH là 7,4 + 0,2. Đóng mơi trường vào các bình tam giác 100 170ml, hấp ướt 121oC trong 15 phút. Để nguội đến 50oC, chia 2ml mơi trường vào các ống nghiệm có kích cỡ 13 x100 mm. Bảo quản mơi trường ở nhiệt độ phòng 2 ngày trước khi sử dụng 4.5. Thuốc nhuộm gram 4.5.1. Hucker’s Crystal violet Thành phần: Dung dịch A Crystal violet (90% dye content ) Ethanol 95% Dung dịch B Ammonium oxalate Nước cất 2,0g 20,0ml 0,8g 80ml Cách pha chế: Trộn đều dung dịch A với dung dịch B, lọc bằng giấy lọc, bảo quản trong 24h 4.5 2. Gram’s Iodine Thành phần: Iodine 1,0g Postasdium iodide (KI) 2,0g Nước cất 300ml Cách pha chế: Đổ KI vào trong cối thêm iodine và nghiền bằng chầy trong 510 phút. Sau đó vừa nghiền vừa thêm nước. Lần thứ nhất thêm 1ml, lần thứ 2 thêm 5ml, lần thứ 3 thêm 10ml Rót dung dịch được nghiền vào chai, rửa chầy cối bằng lượng nước còn lại và đổ vào chai 4.5.3. Hucker’s counterstain Thành phần: 10 10 TCN 7312006 Safranin Ethanol 95% 2,5g 100ml Cách pha chế: Hồ tan 2,5g safranin vào 100ml ethanol 95%. Sau đó thêm 10ml dung dịch trên vào 90ml nước cất 4.6. Thạch dinh dưỡng Thành phần: Cao thịt bò Pepton Thạch Nước cất 3,0 g 5,0 g 15,0 g 1000 ml Cách pha chế Cho các thành phần chất khơ vào nước, đun nóng và khuấy đều để hồ tan các chất Chỉnh pH để sau khi tiệt trùng mơi trường có pH là 6,8 0,2. Đóng 100ml mơi trường vào các bình tam giác và 15 ml vào ống nghiệm. Hấp ướt 1210C trong 15 phút. Mơi trường được bảo quản ở 4100C có thể sử dụng được trong vòng 1 tháng 4.7. Thuốc thử của phản ứng catalase* Dung dịch H2O2 3% 4.8. Thuốc thử của phản ứng oxidase* Thành phần: N,N,N,N,tetramethyl 2HCl Nước cất phenylenediamine. 1,0g 100ml Cách pha chế: Hoà tan 1g N,N,N,N,tetramethylphenylenediamine 2HCl 100ml nước cất. Dung dịch chuẩn bị xong bảo quản lạnh (410 0C) trong chai thuỷ tinh mầu, sử dụng được trong vòng 7 ngày * Thuốc thử được pha mới trước khi tiến hành phản ứng 11 ... 10 TCN 7312006 Hà Nội 2006 TIÊU CHUẨN NGÀNH 10 TCN 7312006 THỊT VÀ CÁC SẢN PHẨM CỦA THỊTXÁC ĐỊNH... 10 TCN 7312006 Pipet các loại 25ml, 10ml, 5ml và 1ml, được chia vạch 0,5ml và 0,1ml Ống nghiệm 13x100mm và 16x125mm Đĩa petri tiệt trùng Phiến kính soi tiêu bản 3.2. Giống vi khuẩn Chủng chuẩn Bacillus cereus ... 10 TCN 7312006 các bình tam giác. Hấp ướt ở 1210C trong 15 phút. Bảo quản ở 4 100 C mơi trường có thể sử dụng được trong vòng 1 tháng