Tiêu chuẩn ngành 28 TCN 179:2002 về Hàm lượng aflatoxin - Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao qui định phương pháp xác định hàm lượng độc tố aflatoxin (B1, B2, G1, G2) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (sau đây gọi tắt là HPLC).
TIÊU CHUẨN NGÀNH 28TCN179:2002 HÀM LƯỢNG AFLATOXIN - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Aflatoxin in fishery products - Method for quantitative analysis by High Performance Liquid Chromatography Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn qui định phương pháp xác định hàm lượng độc tố aflatoxin (B1, B2, G1, G2) thủy sản sản phẩm thủy sản sắc ký lỏng hiệu cao (sau gọi tắt HPLC) Giới hạn phát phương pháp 1,5 µg/kg Phương pháp tham chiếu Tiêu chuẩn xây dựng dựa theo phương pháp chuẩn số 49.2.05 Hiệp hội nhà hố học phân tích (AOAC) cơng bố năm 1997 Nguyên tắc Aflatoxin có mẫu thủy sản bao gồm nhóm B1, B2, G1 G2 chiết tách clorofom Dịch chiết đựơc làm phương pháp chiết pha rắn (SPE) silicagel Hàm lượng aflatoxin có dịch chiết xác định hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang theo phương pháp ngoại chuẩn Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, chất chuẩn dung dịch thử 4.1 Thiết bị, dụng cụ 4.1.1 Hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang 4.1.2 Cột sắc ký pha đảo LC18 kích thước L x ID 25 cm x 4,6 mm, đường kính hạt từ đến 10 [NAD1] µm 4.1.3 Màng lọc mao quản kích thước 0,4 µm 4.1.4 Máy nghiền đồng thể tốc độ 10 000 vòng/ phút 4.1.5 Cân phân tích có độ xác 0,0001 g 4.1.6 Máy ly tâm tốc độ 000 vòng/phút 4.1.7 Bể siêu âm 4.1.8 Hệ thống quay chân khơng 4.1.9 Cột thủy tinh có khóa teflon, kích thước L x ID 500 x 20 mm 500 x mm 4.1.10 ống ly tâm thủy tinh dung tích 250 ml 4.1.11 Bình cầu thủy tinh dung tích 100 ml 250 ml 4.1.12 Bình định mức dung tích ml 10 ml 4.2 Hóa chất 4.2.1 Nước cất loại dùng cho HPLC 4.2.2 Metanol loại dùng cho HPLC 4.2.3 Clorofom loại dùng cho HPLC 4.2.4 Axetonitril loại dùng cho HPLC 4.2.5 n-hexan tinh khiết loại dùng cho phân tích 4.2.6 Ete etylic tinh khiết 4.2.7 Sulfat natri khan 4.2.8 Silicagel cỡ hạt từ 60 đến 200 mesh 4.2.9 Silicagel hoạt hóa: cân 50,0 g silicagel tinh khiết (4.2.8) để vào tủ sấy nhiệt độ 110oC Sau để nguội nhiệt độ phòng bình hút ẩm ngâm clorofom 15 phút trước nhồi cột 4.3 Dung dịch chuẩn dung dịch thử 4.3.1 Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp gồm: B1 (nồng độ 100,0 µg/l), B2 (nồng độ 20,0 µg/l), G1 (nồng độ 100 µg/l) G2 (nồng độ 20 µg/l) 4.3.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp aflatoxin có nồng độ (như Ðiều 4.3.1) metanol từ ống chuẩn Tùy theo nồng độ aflatoxin có ống chuẩn, dùng bình định mức lượng metanol thích hợp 4.3.3 Dung dịch chuẩn trung gian có nồng độ B1 (10,0 µg/l), B2 (2,0 µg/l), G1 (10,0 µg/l) G2 (2,0 µg/l): hút xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp (4.3.1) vào bình định mức 10 ml (4.1.12) định mức tới vạch metanol (4.2.2) 4.3.4 Dung dịch chuẩn: hút xác 0,0 ml, 1,0 ml, 2,0 ml, 4,0 ml, 8,0 ml 10,0 ml dung dịch chuẩn trung gian (4.3.3) vào bình định mức 10 ml (4.1.12) định mức tới vạch metanol Các dung dịch chuẩn thu có nồng độ aflatoxin sau: a Chuẩn : B1 (0,0 µg/l), B2 (0,0 µg/l), G1 (0,0 µg/l), G2 (0,0 µg/l) b Chuẩn : B1 (1,0 µg/l), B2 (0,2 µg/l), G1 (1,0 µg/l), G2 (0,2 µg/l) c Chuẩn : B1 (2,0 µg/l), B2 (0,4 µg/l), G1 (2,0 µg/l), G2 (0,4 µg/l) d Chuẩn : B1 (4,0 µg/l), B2 (0,8 µg/l), G1 (4,0 µg/l), G2 (0,8 µg/l) đ Chuẩn : B1 (8,0 µg/l), B2 (1,6 µg/l), G1 (8,0 µg/l), G2 (1,6 µg/l) e Chuẩn : B1 (10,0 µg/l), B2 (2,0 µg/l), G1 (10,0 µg/l), G2 (2,0 µg/l) 4.3.5 Dung dịch pha động: pha hỗn hợp dung môi axetonitril, metanol nước cất loại dùng cho HPLC theo tỉ lệ thể tích : : Phương pháp tiến hành 5.1 Chuẩn bị mẫu thử 5.1.1 Dùng cân phân tích (4.1.5) cân xác 50,0 g mẫu (m) băm nhuyễn cho vào ống ly tâm thuỷ tinh dung tích 250 ml (4.1.10) 5.1.2 Thêm 100,0 ml clorofom (4.2.3) vào ống trộn khoảng phút máy nghiền đồng thể (4.1.4) Sau đó, ly tâm ống máy ly tâm (4.1.6) khoảng phút tốc độ 000 vòng/phút Tiến hành lọc dịch chiết rửa phần bã clorofom cho tất dịch thu vào bình cầu thuỷ tinh dung tích 250 ml (4.1.11) 5.2 Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng định nghĩa mẫu thủy sản xác định khơng có aflatoxin Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống chuẩn bị với mẫu thử theo qui định Ðiều 5.1 5.3 Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi Thêm 2,0 ml dung dịch chuẩn (4.3.4.c) vào 10,0 g mẫu trắng Ðồng mẫu máy nghiền đồng thể (4.1.4) Tiến hành chuẩn bị mẫu giống chuẩn bị với mẫu thử theo qui định Ðiều 5.1 Phải chuẩn bị mẫu xác định độ thu hồi đồng thời với chuẩn bị mẫu thử mẫu trắng 5.4 Làm dịch chiết 5.4.1 Chuẩn bị cột Ðặt lớp thủy tinh vào đáy cột thủy tinh có khóa teflon (4.1.9) Ðóng khóa cho clorofom tới khoảng 2/3 cột thêm 5,0 g sulfat natri khan (4.2.7), 20,0g silicagel hoạt hóa (4.2.8), 15 g sulfat natri khan (4.2.7) Chú thích: để tránh khô cột giữ mực clorofom cao lớp sulfat natri khan khoảng 1,5 cm 5.4.2 Làm dịch chiết 5.4.2.1 Cô dịch chiết thu (5.1.2) hệ thống quay chân khơng (4.1.8) khoảng 5,0 ml nhiệt độ 40 oC Dùng pipet chuyển dung dịch từ bình cầu (5.1.2) vào cột làm chuẩn bị (5.4.1) tráng rửa bình cầu clorofom Ðiều chỉnh khoá để tốc độ chảy dung dịch khỏi cột khoảng từ 1,0 đến 1,5 ml/phút Trong giai đoạn này, aflatoxin hấp phụ lên hạt silicagel 5.4.2.2 Thêm vào cột 50,0 ml n-hexan (4.2.5), 50,0 ml ete etylic (4.2.6) Ðiều chỉnh tốc độ dung môi chảy qua cột 1,0 ml/phút Sau loại bỏ dịch chảy khỏi cột 5.4.2.3 Giải hấp aflatoxin khỏi cột làm 50,0 ml hỗn hợp clorofom metanol theo tỉ lệ thể tích 97: với tốc dộ 1,0 ml/phút Hứng dung dịch chảy khỏi cột vào bình cầu dung tích 100 ml (4.1.11) Cơ dịch thu hệ thống cô quay chân không (4.1.8) nhiệt độ 40o C khơ hồn tồn Hồ tan cặn 5,0 ml (V) dung dịch pha động (4.3.5) bình định mức ml (4.1.12) Tiến hành phân tích hàm lượng aflatoxin HPLC theo qui định Ðiều 5.5 5.4.2.4 Tiến hành làm mẫu trắng (5.2) mẫu để xác định độ thu hồi (5.3) giống với mẫu thử (5.1) theo qui định Ðiều 5.4.2.1, Ðiều 5.4.2.2 Ðiều 5.4.2.3 5.5 Tiến hành phân tích HPLC 5.5.1 Ðiều kiện phân tích a Cột sắc ký : RP-LC 18, kích thước L x ID 25 cm x 4,6 mm, đường kính hạt -10 [NAD2] µm b Nhiệt độ cột : 35oC c Pha động : Hỗn hợp gồm: axetonitril, metanol nước cất (4.3.5 d Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút đ Bước sóng cài đặt cho đầu dò huỳnh quang là: (kích hoạt) E x 365 nm, (phát xạ) Em 455 nm e Thể tích tiêm : 20 µl 5.5.2 Tiêm dung dịch chuẩn (4.3.4) vào máy HPLC theo thứ tự nồng độ từ thấp đến cao Mỗi dung dịch tiêm lần, tính diện tích pic trung bình Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ diện tích pic thu nồng độ loại aflatoxin theo quan hệ tuyến tính bậc (phương trình y = ax + b) 5.5.3 Tiêm dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu trắng dung dịch xác định độ thu hồi vào hệ thống HPLC Mỗi dung dịch mẫu tiêm lần Tính giá trị trung bình 5.6 u cầu độ tin cậy phép phân tích 5.6.1 Ðộ lặp lại lần tiêm Ðộ lệch chuẩn (CVs) tính theo diện tích pic sắc ký lần tiêm dung dịch chuẩn phải nhỏ 0,5 % 5.6.2 Ðộ thu hồi (R) Ðộ thu hồi xác định cách sử dụng 10 mẫu trắng cho vào lượng dung dịch aflatoxin chuẩn biết hàm lượng xác (5.3) Ðộ thu hồi tính phải nằm khoảng từ 85 % đến 115 %, độ thu hồi trung bình phải lớn 90 % 5.6.3 Ðường chuẩn phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R2) phải lớn 0,99 Tính kết Hàm lượng aflatoxin có mẫu tính sở đường chuẩn thu (5.5.2) Với đường chuẩn dạng y = ax +b, hàm lượng aflatoxin có mẫu tính theo cơng thức sau: C (µg/kg) = (Y - b) a xF Trong đó: - C nồng độ aflatoxin có mẫu, tính theo µg/kg - Y hiệu số diện tích pic dịch chiết diện tích pic có mẫu trắng tiêm vào HPLC, tính theo đơn vị diện tích - a, b thông số đường chuẩn y = ax + b, xác định theo Ðiều 5.5.2 - F hệ số pha lỗng mẫu có giá trị tỉ số thể tích dịch chiết thu sau làm V (5.4.2) khối lượng mẫu m (5.1.1) sử dụng ... Dung dịch chuẩn dung dịch thử 4.3.1 Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp gồm: B1 (nồng độ 100,0 µg/l), B2 (nồng độ 20,0 µg/l), G1 (nồng độ 100 µg/l) G2 (nồng độ 20 µg/l) 4.3.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc... dung dịch chuẩn thu có nồng độ aflatoxin sau: a Chuẩn : B1 (0,0 µg/l), B2 (0,0 µg/l), G1 (0,0 µg/l), G2 (0,0 µg/l) b Chuẩn : B1 (1,0 µg/l), B2 (0,2 µg/l), G1 (1,0 µg/l), G2 (0,2 µg/l) c Chuẩn :... 250 ml (4.1.11) 5.2 Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng định nghĩa mẫu thủy sản xác định aflatoxin Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống chuẩn bị với mẫu thử theo qui định Ðiều 5.1 5.3 Chuẩn bị mẫu để xác