Tiêu chuẩn ngành 28 TCN 178:2002

Tiêu chuẩn ngành 28 TCN 178:2002 về Hàm lượng axit oxolinic trong sản phẩm thủy sản - Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao qui định phương pháp xác định hàm lượng axit oxolinic trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (sau đây gọi tắt là HPLC).

TIÊU CHUẨN NGÀNH 28TCN178:2002 HÀM LƯỢNG AXIT OXOLINIC TRONG SẢN PHẨM THUỶ SẢN - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Oxolinic acid in fishery products - Method for quantitative analysis by High Performance Liquid Chromatography Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn qui định phương pháp xác định hàm lượng axit oxolinic thủy sản sản phẩm thủy sản sắc ký lỏng hiệu cao (sau gọi tắt HPLC) Giới hạn phát phương pháp 0,5 mg/kg Phương pháp tham chiếu Tiêu chuẩn xây dựng dựa theo phương pháp Trung tâm Phát triển Thuỷ sản Ðông Nam (SEAFDEC) biên soạn Nguyên tắc Axit oxolinic - kháng sinh thuộc nhóm Quinolon - mẫu thủy sản chiết tách axetonitril Dịch chiết làm phương pháp chiết lỏng-lỏng với n-hexan bão hoà axetonitril Hàm lượng axit oxolinic dịch chiết xác định hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang theo phương pháp ngoại chuẩn Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, dung dịch chuẩn dung dịch thử 4.1 Thiết bị, dụng cụ 4.1.1 Hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang 4.1.2 Cột sắc ký TSK - GEL ODS - 80 TM, L x ID : 150 x 4,6mm, kích thước hạt 5µm 4.1.3 Màng lọc mao quản kích thước 0,4 µm 4.1.4 Máy nghiền đồng thể tốc độ 10 000 vòng/ phút 4.1.5 Cân phân tích có độ xác 0,0001g 4.1.6 Máy ly tâm tốc độ 000 vòng/phút 4.1.7 Bể siêu âm 4.1.8 Hệ thống cô quay chân không 4.1.9 ống ly tâm thuỷ tinh, dung tích 150 ml, 15ml 4.1.10 Bình chiết dung tích 125 ml 4.1.11 Bình cầu thủy tinh dung tích 100 ml 4.1.12 Bình định mức dung tích 10 ml 100 ml 4.2 Hóa chất 4.2.1 Nước cất loại dùng cho HPLC 4.2.2 Axetonitril loại dùng cho HPLC 4.2.3 Metanol loại dùng cho HPLC 4.2.4 - propanol tinh khiết, loại dùng cho phân tích 4.2.5 n - hexan tinh khiết, loại dùng cho phân tích 4.2.6 Sulfat natri khan 4.2.7 Clorua natri tinh khiết, loại dùng cho phân tích 4.2.8 Axit xitric loại dùng cho HPLC 4.2.9 Axit oxolinic loại dùng cho HPLC 4.3 Dung dịch chuẩn dung dịch thử 4.3.1 Axit xitric 0,1 M: hòa tan 21,01 g axit xitric (4.2.8) lít nước cất (4.2.1) 4.3.2 Dung môi pha động: pha động cho tiến trình chạy HPLC hỗn hợp axetonitril, metanol dung dịch axit xitric 0,1 M theo tỉ lệ thể tích : : 4.3.3 Dung dịch chuẩn gốc 100 µg/ml: cân xác 10,0 mg axit oxolinic cân phân tích (4.1.5), hòa tan định mức tới 100 ml hỗn hợp axetonitril nước cất (4.2.1) theo tỉ lệ thể tích :1 4.3.4 Dung dịch chuẩn trung gian 10 µg/ml: hút xác 10,0 ml dung dịch chuẩn gốc 100 µg/ml (4.3.3) vào bình định mức 100 ml Ðịnh mức tới vạch hỗn hợp axetonitril nước cất (4.2.1) theo tỉ lệ thể tích :1 4.3.5 Dung dịch chuẩn làm việc: hút xác 0,2 ml, 0,5 ml, 1,0 ml, 2,0 ml, 5,0 ml 10,0 ml dung dịch chuẩn trung gian (4.3.4) vào bình định mức 10 ml Ðịnh mức tới vạch hỗn hợp axetonitril nước cất (4.2.1) theo tỉ lệ thể tích :1 để chuẩn có hàm lượng axit oxolinic là: 0,2 µg/ml, 0,5 µg/ml, 1,0 µg/ml, 2,0 µg/ml, 5,0 µg/ml 10,0 µg/ml Phương pháp tiến hành 5.1 Chuẩn bị mẫu thử 5.1.1 Cân xác 5,0 g mẫu (m) băm nhuyễn cho vào ống ly tâm thủy tinh dung tích 150 ml (4.1.9) Thêm 25,0 ml axetonitril (4.2.2) 10,0 g sulfat natri khan (4.2.6) nghiền 30 giây máy nghiền đồng thể (4.1.4) Ly tâm vòng phút tốc độ 500 vòng/phút 5.1.2 Lọc lấy phần dịch cho vào bình chiết 125 ml (4.1.10) chứa sẵn 25,0 ml n-hexan bão hòa axetonitril 5.1.3 Thêm 25,0 ml axetonitril vào phần bã ống ly tâm nghiền 30 giây máy nghiền đồng thể (4.1.4) Ly tâm vòng phút tốc độ 500 vòng/phút lọc lấy phần dịch cho vào bình chiết (5.1.2) 5.2 Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng định nghĩa mẫu thủy sản xác định khơng có axit oxolinic Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống chuẩn bị với mẫu thử theo qui định Ðiều 5.1 5.3 Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi Thêm 2ml dung dịch chuẩn có hàm lượng µg/ml vào 10,0 g mẫu trắng Ðồng mẫu máy nghiền đồng thể (4.1.4) Tiến hành chuẩn bị mẫu giống chuẩn bị với mẫu thử theo qui định Ðiều 5.1 5.4 Làm dịch chiết 5.4.1 Lắc mạnh bình chiết thu Ðiều 5.1, 5.2 5.3 vòng 10 phút để yên cho tách lớp Mở khố để chuyển lớp axetonitril vào bình cầu thủy tinh 100 ml (4.1.11) Thêm 5,0 ml 1-propanol (4.2.4) vào bình cạn máy quay chân không (4.1.8) nhiệt độ 40oC 5.4.2 Thêm 2,0 ml (V) hỗn hợp axetonitril nước cất (4.2.1) theo tỷ lệ 3:7 thể tích Ðể bình vào bể điều nhiệt bể siêu âm (4.1.7) hoà tan cặn hoàn toàn 5.4.3 Chuyển dung dịch vào ống ly tâm dung tích 15 ml (4.1.9) Thêm 100,0 mg clorua natri tinh khiết 1,0 ml dung dịch n-hexan bão hòa axetonitril Trộn bể siêu âm (4.1.7) ly tâm vòng phút tốc độ 500 vòng/phút 5.4.4 Ðể yên cho tách lớp, sau dùng pipet cẩn thẩn hút lớp axetonitril cho vào xilanh nhựa gắn sẵn màng lọc mao quản (4.1.3) Tiến hành phân tích dịch lọc thu HPLC theo qui định Ðiều 5.5 5.5 Tiến hành phân tích HPLC 5.5.1 Ðiều kiện phân tích a Cột sắc ký : TSK - GEL ODS 80 TM, L x ID:150 x 4,6 mm, kích thước hạt µm b Nhiệt độ cột : 35oC c Pha động : Hỗn hợp axetonitril, metanol axit xitric 0,1 M (4.3.2) d Tốc độ dòng : 0,5 ml/phút đ Bước sóng cài đặt cho đầu dò huỳnh quang: (kích hoạt) E x 337nm, (phát xạ) Em 365nm e Thể tích tiêm : 20 µl 5.5.2 Tiêm dung dịch chuẩn (4.3.5) vào máy HPLC theo thứ tự nồng độ từ thấp đến cao Mỗi dung dịch tiêm lần, tính diện tích pic trung bình Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ diện tích pic thu nồng độ axit oxolinic theo quan hệ tuyến tính bậc (phương trình y = ax + b) 5.5.3 Tiêm dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu trắng, dung dịch xác định độ thu hồi theo qui định Ðiều 5.4.4 vào hệ thống HPLC Mỗi dung dịch mẫu tiêm lần Tính giá trị trung bình 5.6 Yêu cầu độ tin cậy phép phân tích 5.6.1 Ðộ lặp lại lần tiêm Ðộ lệch chuẩn (CVS) tính theo diện tích pic sắc ký lần tiêm dung dịch chuẩn phải nhỏ 0,5 % 5.6.2 Ðộ thu hồi (R) Ðộ thu hồi xác định cách sử dụng mẫu cho vào lượng dung dịch axit oxolinic chuẩn biết hàm lượng xác Ðộ thu hồi tính phải khoảng từ 85 % đến 115 %, độ thu hồi trung bình phải lớn 90 % 5.6.3 Ðường chuẩn phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R 2) phải lớn 0,99 Tính kết Hàm lượng axit oxolinic có mẫu tính sở đường chuẩn thu (5.5.2) Với đường chuẩn dạng y = ax + b, hàm lượng axit oxolinic có mẫu tính theo cơng thức sau: C (µg/kg) = (Y - b) a x F x 000 Trong đó: - C nồng độ axit oxolinic có mẫu, tính theo µgkg - Y hiệu số diện tích pic dịch chiết diện tích pic có mẫu trắng tiêm vào HPLC, tính theo đơn vị diện tích - a, b thông số đường chuẩn y = ax + b, xác định theo Ðiều 5.5.2 - F hệ số pha lỗng mẫu có giá trị tỉ số thể tích dịch chiết thu sau làm V (5.4.2) khối lượng mẫu m (5.1.1) sử dụng  ... (5.1.2) 5.2 Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng định nghĩa mẫu thủy sản xác định khơng có axit oxolinic Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống chuẩn bị với mẫu thử theo qui định Ðiều 5.1 5.3 Chuẩn bị mẫu... xác định độ thu hồi Thêm 2ml dung dịch chuẩn có hàm lượng µg/ml vào 10,0 g mẫu trắng Ðồng mẫu máy nghiền đồng thể (4.1.4) Tiến hành chuẩn bị mẫu giống chuẩn bị với mẫu thử theo qui định Ðiều... Ðộ lệch chuẩn (CVS) tính theo diện tích pic sắc ký lần tiêm dung dịch chuẩn phải nhỏ 0,5 % 5.6.2 Ðộ thu hồi (R) Ðộ thu hồi xác định cách sử dụng mẫu cho vào lượng dung dịch axit oxolinic chuẩn