Tiêu chuẩn ngành 28 TCN 177:2002 về Hàm lượng thuốc kháng sinh nhóm tetracyclin trong sản phẩm thủy sản - Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao qui định phương pháp xác định hàm lượng kháng sinh nhóm tetracyclin trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (sau đây gọi tắt là HPLC).
TIÊU CHUẨN NGÀNH 28TCN177:2002 HÀM LƯỢNG THUỐC KHÁNG SINH NHÓM TETRACYCLIN TRONG SẢN PHẨM THUỶ SẢN PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Tetracyclines group in fishery products - Method for quantitative analysis by high performance liquid chromatography Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn qui định phương pháp xác định hàm lượng kháng sinh nhóm tetracyclin thủy sản sản phẩm thủy sản sắc ký lỏng hiệu cao (sau gọi tắt HPLC) Giới hạn phát phương pháp 10 µg/kg Phương pháp tham chiếu Tiêu chuẩn xây dựng dựa theo phương pháp số 995.09 Chlortetracyclin, Oxytetracycline, and Tetracycline phần ăn động vật, I, chương 23, trang 19 - 23 (23.1.17), phương pháp chuẩn Hiệp hội nhà hoá học phân tích (AOAC) ban hành năm 1997 Nguyên tắc 3.1 Kháng sinh nhóm tetracyclin bao gồm kháng sinh sau: tetracyclin (gọi tắt TC), oxytetracyclin (gọi tắt OTC) clortetracyclin (gọi tắt CTC) 3.2 Các kháng sinh mẫu thủy sản chiết tách dung dịch đệm (pH 4) Dịch chiết làm phương pháp chiết pha rắn (SPE) cột tách chiết pha đảo Sep Pak Cartrige C18 Hàm lượng TC, OTC, CTC có dịch chiết xác định hệ thống HPLC với đầu dò UV bước sóng 350 nm theo phương pháp ngoại chuẩn Thiết bị, dụng cụ, hoá chất, dung dịch chuẩn dung dịch thử 4.1 Thiết bị, dụng cụ 4.1.1 Hệ thống HPLC với đầu dò UV 4.1.2 Cột sắc ký pha đảo gồm có: a Cột sắc ký pha đảo C8, kích thước cột L x ID : 250 x 4,6 mm, kích thước hạt µm b Cột sắc ký pha đảo C18, kích thước cột L x ID : 250 x 4,6 mm, kích thước hạt 5µm 4.1.3 Máy nghiền đồng thể tốc độ 10 000 vòng/phút 4.1.4 Cân phân tích có độ xác 0,0001 g 4.1.5 Máy ly tâm tốc độ 000 vòng/phút (sử dụng ống ly tâm dung tích 50 ml) 4.1.6 pH kế 4.1.7 ống ly tâm thủy tinh dung tích 50 ml 4.1.8 Bình định mức dung tích 10 ml, 100 ml 000 ml 4.1.9 Cột Sep-Pak C18, dung tích 10 ml 4.1.10 Phễu Buch-ner đường kính 5,5 cm 4.1.11 Pipet tự động điều chỉnh từ đến10 ml 4.1.12 Bể siêu âm 4.2 Hoá chất 4.2.1 Ðinatri photphat khan (Na2HPO4) tinh khiết, loại dùng cho phân tích 4.2.2 Nước cất loại dùng cho HPLC 4.2.3 Axit xitric ngậm phân tử nước, tinh khiết, loại dùng cho phân tích 4.2.4 Ethylenđinitrilotetraaxêtat đinatri (sau viết tắt EDTA) ngậm phân tử nước tinh khiết, loại dùng cho phân tích 4.2.5 Axít oxalic ngậm phân tử nước, tinh khiết, loại dùng cho phân tích 4.2.6 Metanol loại dùng cho HPLC 4.2.7 Axetonitril loại dùng cho HPLC 4.3 Dung dịch chuẩn dung dịch thử 4.3.1 Dung dịch đệm McIlvaine (pH 4,0 +/- 0,05) gồm: a Dung dịch A: hoà tan 28,4 g Na2HPO4 khan (4.2.1) nước cất (4.2.2) bình định mức dung tích 000 ml (4.1.8) Ðịnh mức tới vạch b Dung dịch B: hoà tan 21,0 g axít xitric (4.2.3) nước cất (4.2.2) bình định mức (4.1.8) Ðịnh mức tới vạch Cho từ từ 625 ml dung dịch A vào 000 ml dung dịch B Chỉnh pH tới 4,0 (+/- 0,05) cách cho giọt dung dịch HCl nồng độ 0,1M dung dịch NaOH nồng độ 0,1M (sử dụng pH kế để xác định pH) Chú thích: Dung dịch bền vòng tuần nhiệt độ phòng 4.3.2 Dung dịch đệm McIlvaine - EDTA Hoà tan 60,5 g EDTA (4.2.4) vào 625 ml dung dịch đệm McIlvaine (4.3.1) Chú thích: Dung dịch bền vòng tuần nhiệt độ phòng 4.3.3 Dung dịch axit oxalic-metanol: hồ tan 1,26 g axít oxalic (4.2.5) metanol (4.2.6) bình định mức 000 ml (4.1.8) Ðịnh mức tới vạch Chú thích: Dung dịch chiết khơng bền, pha trước sử dụng 4.3.4 Pha động cho HPLC: hồ tan 1,26 g axít oxalíc (4.2.5) nước cất (4.2.2) bình định mức 000 ml (4.1.8) Ðịnh mức tới vạch Thêm vào dung dịch 500 ml axetonitril (4.2.7) 166 ml metanol (4.2.6) Lọc đuổi khí Chú thích: Dung dịch pha động khơng bền, pha trước sử dụng 4.3.5 Dung dịch chuẩn gốc 000 µg/ml: cân 108 mg (+/- 0,1) loại kháng sinh chuẩn (TC, OTC CTC) loại có giấy chứng nhận hàm lượng (lượng cân điều chỉnh theo hàm lượng kháng sinh ghi giấy chứng nhận) vào bình định mức dung tích 100 ml (4.1.8) riêng biệt Hòa tan định mức tới vạch 100 ml metanol (4.2.6) Chú thích: Bảo quản dung dịch nhiệt độ -20 0C Dung dịch bền vòng tháng 4.3.6 Dung dịch chuẩn hỗn hợp 100 µg/ml: hút xác 10 ml dung dịch chuẩn gốc (4.3.5) vào bình định mức 100 ml (4.1.8) Ðịnh mức tới vạch metanol (4.2.6) 4.3.7 Dung dịch chuẩn hỗn hợp 25 µg/ml: hút xác 2,5 ml dung dịch chuẩn hỗn hợp 100 µg/ml (4.3.6) vào bình định mức 10 ml (4.1.8) Ðịnh mức tới vạch metanol (4.2.6) Chú thích: Bảo quản dung dịch tủ lạnh nhiệt độ từ đến 5oC Dung dịch bền vòng tuần 4.3.8 Dung dịch chuẩn hỗn hợp 0,05; 0,10; 0,25; 0,50 1,00 µg/ml: hút xác 20, 40, 100, 200, 400 µl dung dịch chuẩn hỗn hợp 25 µg/ml (4.3.7) vào bình định mức 10 ml (4.1.8) Thêm ml dung dịch axít oxalic-metanol (4.3.3) vào bình Ðịnh mức tới vạch nước cất (4.2.2) Chú thích: Bảo quản dung dịch tủ lạnh nhiệt độ từ đến 5oC Dung dịch bền vòng tuần Phương pháp tiến hành 5.1 Chuẩn bị mẫu thử 5.1.1 Cân 5,00 g (+/- 0,05) mẫu (m) băm nhuyễn cho vào ống ly tâm thủy tinh (4.1.7) thứ Thêm 20 ml dung dịch đệm McIlvaine - EDTA (4.3.2) vào ống nghiền 30 giây máy nghiền đồng thể (4.1.3) Sau đó, ly tâm ống máy ly tâm (4.1.5) 10 phút tốc độ 000 vòng/phút 5.1.2 Gạn dịch ống thứ vào ống ly tâm thủy tinh (4.1.7) thứ Cho thêm 20 ml dung dịch đệm McIlvaine - EDTA vào ống ly tâm thuỷ tinh thứ Trộn đều, ly tâm ống 10 phút tốc độ 000 vòng/phút lại gạn dịch vào ống ly tâm thủy tinh thứ 5.1.3 Cho thêm 10 ml dung dịch đệm McIlvaine - EDTA vào ống ly tâm thuỷ tinh thứ Trộn ly tâm ống 10 phút tốc độ 000 vòng/phút Tiếp tục gạn dịch vào ống ly tâm thủy tinh thứ 5.1.4 Ly tâm ống thủy tinh thứ 20 phút tốc độ 000 vòng/phút Sau đó, lọc dịch qua giấy lọc phễu Buch-ner Rửa ống ly tâm lần, lần rửa sử dụng ml dung dịch đệm McIlvaine - EDTA 5.2 Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng định nghĩa mẫu thủy sản xác định khơng có kháng sinh thuộc nhóm TC Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống chuẩn bị với mẫu thử theo qui định Ðiều 5.1 5.3 Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi Thêm 100 µl dung dịch chuẩn hỗn hợp 25 µg/ml (4.3.7) vào 5,00 g mẫu trắng Ðồng mẫu máy nghiền đồng thể (4.1.3) Tiến hành chuẩn bị mẫu giống chuẩn bị với mẫu thử theo qui định Ðiều 5.1 5.4 Làm dịch chiết 5.4.1 Chuẩn bị cột Nối cột Sep - Pak C18 vào đầu xi lanh thủy tinh dung tích 100 ml Thêm 20 ml metanol (4.2.6), 20 ml nước cất (4.2.2) vào xi lanh thủy tinh Loại bỏ dung dịch chảy qua cột 5.4.2 Làm dịch chiết 5.4.2.1 Cho dịch chiết ống ly tâm thu Ðiều 5.1.4, 5.2 5.3 vào cột Sep - Pak chuẩn bị Ðiều 5.4.1 Tráng rửa bình chứa 2,0 ml dung dịch đệm McIlvaine - EDTA (4.3.2) Trong giai đoạn này, kháng sinh nhóm tetracyclin hấp phụ lên bề mặt hạt rắn chứa cột Chú thích: Khơng cột Sep - Pak khô hai giai đoạn chuẩn bị cột làm dịch chiết Ðiều chỉnh cho dịch chảy khỏi cột giọt 5.4.2.2 Cho 20 ml nước cất (4.2.2) vào xi lanh thủy tinh cho chảy qua cột Loại bỏ dịch chảy khỏi cột Làm khơ cột dòng khơng khí phút 5.4.2.3 Giải hấp kháng sinh nhóm tetracyclin cách cho 6,0 ml dung dịch axít oxalicmetanol (4.3.3) chảy qua cột với tốc độ 1,5 ml/phút Thu dịch khỏi cột vào bình định mức 10 ml Ðịnh mức tới vạch (thể tích V) nước cất (4.2.2) Tiến hành phân tích dịch thu HPLC theo qui định Ðiều 5.5 5.5 Tiến hành phân tích HPLC 5.5.1 Ðiều kiện phân tích a Cột sắc ký : Cột pha đảo C8, L x ID : 250 x 4,6 mm, kích thước hạt µm b Nhiệt độ cột: Nhiệt độ phòng c Pha động: Hỗn hợp dung dịch axit oxalic-metanol-axetonitrile (4.3.4) d Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút đ Bước sóng cài đặt cho đầu dò UV 350 nm e Thể tích tiêm: 60 µl 5.5.2 ổn định cột sắc ký 30 phút pha động (4.3.4) 5.5.3 Tiêm dung dịch chuẩn (4.3.8) vào máy HPLC theo thứ tự nồng độ từ thấp đến cao Mỗi dung dịch tiêm lần, tính chiều cao pic trung bình Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ chiều cao pic thu nồng độ (µg/ml) loại kháng sinh theo quan hệ tuyến tính bậc (phương trình y = ax + b) 5.5.4 Tiêm dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu trắng, dung dịch xác định độ thu hồi theo qui định Ðiều 5.4.2.3 vào hệ thống HPLC Mỗi dung dịch mẫu tiêm lần Tính giá trị trung bình Chú thích: Sau phân tích xong, làm hệ thống HPLC (bao gồm cột sắc ký) hỗn hợp: nước cất (4.2.2) - metanol (4.2.6) - axetonitrile (4.2.7) theo tỷ lệ thể tích 7-1-2 30 phút 5.6 Yêu cầu độ tin cậy phép phân tích 5.6.1 Ðộ lặp lại lần tiêm Ðộ lệch chuẩn (CVS) tính theo chiều cao pic sắc ký lần tiêm dung dịch chuẩn phải nhỏ 0,5 % 5.6.2 Ðộ thu hồi (R) Ðộ thu hồi xác định cho lần chạy mẫu phải lớn 80 % 5.6.3 Ðường chuẩn kháng sinh phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R2) phải lớn 0,995 5.6.4 Ðối với mẫu chứa 0,5 µg/g kháng sinh nhóm TC, phải kiểm tra xác nhận kết cách tiêm lại dịch chiết mẫu dung dịch chuẩn cột C18 (4.1.2.b) chạy chế độ cột C8 (4.1.2.a) so sánh thời gian lưu píc mẫu píc chuẩn Tính kết Hàm lượng kháng sinh có mẫu tính sở đường chuẩn thu (5.5.3) Với đường chuẩn dạng y = ax + b, hàm lượng kháng sinh có mẫu tính theo cơng thức sau: C (µg/kg) = (Y - b) a x F x 000 Trong đó: - C nồng độ kháng sinh có mẫu, tính theo µg/kg - Y hiệu số chiều cao pic dịch chiết chiều cao pic có mẫu trắng tiêm vào HPLC, tính theo đơn vị độ dài - a, b thông số đường chuẩn y = ax + b, xác định theo Ðiều 5.5.3 - F hệ số pha lỗng mẫu có giá trị tỉ số thể tích dịch chiết thu sau làm V ( 5.4.2.3) khối lượng mẫu m ( 5.1.1) sử dụng ... EDTA 5.2 Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng định nghĩa mẫu thủy sản xác định khơng có kháng sinh thuộc nhóm TC Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống chuẩn bị với mẫu thử theo qui định Ðiều 5.1 5.3 Chuẩn. .. dịch chuẩn hỗn hợp 25 µg/ml (4.3.7) vào 5,00 g mẫu trắng Ðồng mẫu máy nghiền đồng thể (4.1.3) Tiến hành chuẩn bị mẫu giống chuẩn bị với mẫu thử theo qui định Ðiều 5.1 5.4 Làm dịch chiết 5.4.1 Chuẩn. .. dung dịch chuẩn cột C18 (4.1.2.b) chạy chế độ cột C8 (4.1.2.a) so sánh thời gian lưu píc mẫu píc chuẩn Tính kết Hàm lượng kháng sinh có mẫu tính sở đường chuẩn thu (5.5.3) Với đường chuẩn dạng